In Electroporations Ovo della Fase HH 10 embrioni di pollo
Summary
Pulcino in ovo elettroporazione è una tecnica che permette di manipolazione genetica dell'embrione aviaria. Comuni applicazioni di questa tecnica includono l'analisi funzionale dei geni e dei putativi elementi enhancer. Questo video dimostra l'elettroporazione del tubo neurale in HH 10 embrioni di pollo. Tecnica di iniezione e la gestione corretta di uova sono discussi.
Abstract
Grandi dimensioni e sviluppo esterno dell'embrione di pollo hanno da tempo reso un prezioso strumento nello studio della biologia dello sviluppo. Con l'avvento di tecniche biologiche molecolari, il pulcino è diventato un sistema utile per studiare regolazione genica e la funzione. Da electroporating costruisce DNA o RNA in un embrione di pollo di sviluppo, i geni possono essere espressi o abbattuto al fine di analizzare in funzione del gene in vivo. Allo stesso modo, costruisce giornalista può essere utilizzato per mappare il destino o per esaminare gli elementi gene putativo regolamentazione. Rispetto a esperimenti simili nel topo, elettroporazione pulcino ha il vantaggio di essere rapida, semplice e poco costoso. Questo video dimostra come prima di fare una finestra nel guscio d'uovo di manipolare l'embrione. Quindi, l'embrione viene visualizzato con una soluzione diluita di inchiostro di china iniettato sotto l'embrione. Un ago pipetta di vetro e sono usati per iniettare il DNA e Fast colorante verde nel tubo di sviluppo neurale, poi elettrodi di platino sono posti in parallelo per l'embrione e brevi impulsi elettrici vengono somministrati con un generatore di impulsi. Infine, l'uovo è sigillato con nastro adesivo e rimesso in un incubatore per un ulteriore sviluppo. Inoltre, il video mostra la corretta conservazione delle uova e la manipolazione e discute le possibili cause di elettroporazione in seguito alla perdita degli embrioni.
Protocol
Discussion
Questo protocollo fornisce una guida passo-passo per elettroporazione del tubo neurale HH10 di embrioni di pollo. Oltre a mostrare la tecnica, le linee guida per lo stoccaggio e il trattamento delle uova è prevista anche. Questa tecnica ha una vasta gamma di applicazioni per l'analisi genetica e la facilità ea basso costo di esperimenti li rende fattibile per molti laboratori.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Chicken egg incubator | humidified, set to 37.80°C (100F). | |||
| Pulse generator | Genetronics | BTX T820 | Square wave generator or comparable | |
| Electrodes | our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart | |||
| Connecter cables | ||||
| Micromanipulator | ||||
| Dissecting scope | with large working distance | |||
| Glass capillaries | and capillary puller or commercial glass needles | |||
| Leibovitz’s L-15 media | ||||
| chicken eggs | fertilized | |||
| Curved scissors | ||||
| 10 ml syringe | ||||
| Large bore needle | 16-18G | |||
| Mouth pipette | ||||
| India ink | ||||
| Insulin syringe/syringe | ||||
| Plasmid DNA | ≥ 1µg/µl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye |
References
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. 'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
