ב Electroporations אובו של HH 10 עוברים שלב עוף
Summary
צ'יק ב electroporation אובו היא טכניקה המאפשרת מניפולציה גנטית של העובר העופות. יישומים נפוצים של טכניקה זו כוללות אנליזה פונקציונלית של גנים המשוערת אלמנטים משפר. וידאו זה מדגים electroporation neural tube אצל ה"ה 10 עוברי אפרוח. טכניקת הזרקת וטיפול נאות ביצה הם דנו.
Abstract
גודל גדול והתפתחות חיצונית של העובר עוף הפכו זמן זה כלי חשוב בחקר הביולוגיה ההתפתחותית. עם כניסתו של שיטות ביולוגיות מולקולריות, האפרוח הפך שימושי מערכת שבה ללמוד ויסות הגנים ותפקוד. עד electroporating בונה DNA או RNA לתוך העובר המתפתח עוף, גנים יכול לבוא לידי ביטוי או הפילו על מנת לנתח את תפקוד הגן vivo. כמו כן, בונה הכתב יכול לשמש למיפוי גורל או לבחון אלמנטים גנים המשוערת הרגולציה. לעומת ניסויים דומים העכבר, electroporation חומוס יש את היתרונות של להיות מהירה, קלה וזולה. וידאו זה מדגים הראשונה איך לעשות חלון קליפת כדי לתפעל את העובר. בשלב הבא, העובר הוא מדמיין בתמיסה מדוללת של דיו הודו מוזרק מתחת העובר. מחט זכוכית פיפטה משמשים להזריק דנ"א צבען הירוק מהיר לתוך הצינור העצבי המתפתח, אז אלקטרודות פלטינה ממוקמים במקביל העובר ואת פולסים חשמליים קצרים מנוהלים עם גנרטור הדופק. לבסוף, הביצה היא חתומה עם סרט והניח בחזרה באינקובטור להמשך פיתוח. בנוסף, הוידאו מראה אחסון ביצה טיפול נאות ודן גורמים אפשריים electroporation אובדן העובר הבא.
Protocol
Discussion
פרוטוקול זה מספק צעד אחר צעד מדריך כדי electroporation בצינור העצבי של HH10 עוברי אפרוח. בנוסף מראה את הטכניקה, הנחיות לאחסון וטיפול ביצים הוא גם סיפק. טכניקה זו יש מגוון רחב של יישומים עבור ניתוח גנטי ואת עלות נמוכה וקלות של ניסויים גורם להם ריאלי עבור מעבדות רבות.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Chicken egg incubator | humidified, set to 37.80°C (100F). | |||
| Pulse generator | Genetronics | BTX T820 | Square wave generator or comparable | |
| Electrodes | our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart | |||
| Connecter cables | ||||
| Micromanipulator | ||||
| Dissecting scope | with large working distance | |||
| Glass capillaries | and capillary puller or commercial glass needles | |||
| Leibovitz’s L-15 media | ||||
| chicken eggs | fertilized | |||
| Curved scissors | ||||
| 10 ml syringe | ||||
| Large bore needle | 16-18G | |||
| Mouth pipette | ||||
| India ink | ||||
| Insulin syringe/syringe | ||||
| Plasmid DNA | ≥ 1µg/µl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye |
References
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. 'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
