En Electroporations Ovo de embriones de pollo HH Etapa 10
Summary
De pollo en la electroporación in ovo es una técnica que permite la manipulación genética del embrión aviar. Las aplicaciones más comunes de esta técnica incluyen el análisis funcional de los genes y la posible potenciador de los elementos. Este video muestra la electroporación del tubo neural en embriones de pollo HH 10. Técnica de inyección y la adecuada manipulación de los huevos se discuten.
Abstract
Gran tamaño y externa para el desarrollo del embrión de pollo desde hace mucho tiempo convertido en una herramienta valiosa en el estudio de la biología del desarrollo. Con el advenimiento de técnicas de biología molecular, la chica se ha convertido en un sistema útil para estudiar la regulación de genes y su función. Por electroporating construcciones de ADN o ARN en el embrión de pollo en desarrollo, los genes pueden expresarse o derribado con el fin de analizar la función génica in vivo. Del mismo modo, reportero construcciones se pueden utilizar para la asignación de destino o para examinar los elementos de regulación de genes putativos. En comparación con experiencias similares en el ratón, la electroporación de pollo tiene la ventaja de ser rápido, fácil y barato. Este video muestra primero cómo hacer que una ventana en la cáscara del huevo para manipular el embrión. Luego, el embrión se visualiza con una solución diluida de tinta china inyectada por debajo del embrión. Una aguja de cristal y pipetas se utilizan para inyectar el ADN y el tinte verde rápido en el tubo neural en desarrollo, a continuación, los electrodos de platino se colocan en paralelo al embrión y cortos impulsos eléctricos se administran con un generador de pulsos. Por último, el huevo está sellada con cinta adhesiva y se coloca de nuevo en una incubadora para un mayor desarrollo. Además, el video muestra el almacenamiento de huevos y manejo adecuado y se analizan las posibles causas de la electroporación de embriones después de la pérdida.
Protocol
Discussion
Este protocolo proporciona una guía paso a paso a la electroporación del tubo neural de embriones de pollo HH10. Además de mostrar la técnica, las directrices para el almacenamiento y manipulación de los huevos también se proporciona. Esta técnica tiene una amplia gama de aplicaciones para el análisis genético y la facilidad y bajo costo de los experimentos los hace factible para muchos laboratorios.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Chicken egg incubator | humidified, set to 37.80°C (100F). | |||
| Pulse generator | Genetronics | BTX T820 | Square wave generator or comparable | |
| Electrodes | our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart | |||
| Connecter cables | ||||
| Micromanipulator | ||||
| Dissecting scope | with large working distance | |||
| Glass capillaries | and capillary puller or commercial glass needles | |||
| Leibovitz’s L-15 media | ||||
| chicken eggs | fertilized | |||
| Curved scissors | ||||
| 10 ml syringe | ||||
| Large bore needle | 16-18G | |||
| Mouth pipette | ||||
| India ink | ||||
| Insulin syringe/syringe | ||||
| Plasmid DNA | ≥ 1µg/µl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye |
References
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. 'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
