In Ovo Electroporations von HH Stage 10 Hühnerembryonen

Summary

Küken in ovo Elektroporation ist eine Technik, die genetische Manipulation der Vogelembryo ermöglicht. Typische Anwendungen für diese Technik sind die funktionelle Analyse von Genen und vermeintlichen Enhancer-Elemente. Dieses Video zeigt Neuralrohr Elektroporation in HH 10 Hühnerembryonen. Injektionstechnik und ordnungsgemäße Eibehandlung werden diskutiert.

Abstract

Größe und externe Entwicklung des Hühnerembryo schon lange gemacht, ein wertvolles Werkzeug in der Studie der Entwicklungsbiologie. Mit dem Aufkommen von molekularbiologischen Techniken, hat das Küken zu einem nützlichen System, in dem Gen-Regulation und Funktion zu studieren. Durch Elektroporation DNA-oder RNA-Konstrukte in den Entwicklungsländern Hühnerembryo können Gene exprimiert werden können oder nach unten, um in vivo Funktion von Genen zu analysieren klopfte. Ebenso kann Reporter-Konstrukte für das Schicksal Mapping verwendet werden oder zur vermeintlichen Gen regulatorische Elemente zu untersuchen. Im Vergleich zu ähnlichen Versuchen in der Maus hat chick Elektroporation den Vorteil, dass schnell, einfach und kostengünstig. Dieses Video zeigt zunächst, wie man ein Fenster in die Eischale zu machen, um den Embryo zu manipulieren. Anschließend wird der Embryo sichtbar gemacht mit einer verdünnten Lösung von Tusche unter den Embryo injiziert. Ein Glas Nadel und Pipette werden verwendet, um DNA und Fast Green Farbstoff in die Entwicklung des Neuralrohrs, dann Platin-Elektroden sind parallel zu den Embryo gelegt und kurze elektrische Impulse werden mit einem Impulsgeber verabreicht zu injizieren. Schließlich wird das Ei mit Klebeband verschlossen und wieder in einen Inkubator für die weitere Entwicklung. Zusätzlich zeigt das Video richtigen Ei Lagerung und Handhabung und diskutiert mögliche Ursachen des Embryos Verlust nach der Elektroporation.

Protocol

Egg Handling Eier können bei 13 ° C aufbewahrt werden bis zu einer Woche vor der Inkubation ohne signifikanten Verlust der Lebensfähigkeit (eine kleine Wein-Kühler eignet sich ideal für diesen Zweck). Vor der Inkubation, damit Eier auf Raumtemperatur, dann in einem befeuchteten Inkubator Huhn auf 37,8 eingestellt warmen ° C (100 ° F). Wir in der Regel elektroporieren Embryonen etwa 48 Stunden nach Beginn der Inkubation, wenn der Embryo hat Hamburger und Hamilton Stufe 10 erreicht hat…

Discussion

Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für Schritt-Anleitung zum Neuralrohr Elektroporation von HH10 Hühnerembryonen. Zusätzlich zu zeigen, die Technik wird Richtlinien für die Lagerung und Handhabung von Eiern zur Verfügung gestellt. Diese Technik hat eine breite Palette von Anwendungen für die genetische Analyse und die Leichtigkeit und geringen Kosten von Experimenten macht sie möglich für viele Labors.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Chicken egg incubator				humidified, set to 37.80°C (100F).
Pulse generator		Genetronics	BTX T820	Square wave generator or comparable
Electrodes				our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart
Connecter cables
Micromanipulator
Dissecting scope				with large working distance
Glass capillaries				and capillary puller or commercial glass needles
Leibovitz’s L-15 media
chicken eggs				fertilized
Curved scissors
10 ml syringe
Large bore needle				16-18G
Mouth pipette
India ink
Insulin syringe/syringe
Plasmid DNA				≥ 1µg/µl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye