Summary
Proteinkomplex katalysera viktiga cellfunktioner. Detaljerad funktionell och strukturell karaktärisering av många viktiga komplex kräver rekombinant produktion. MultiBac är ett baculovirus / insektscell-system särskilt anpassat för att uttrycka eukaryota proteiner och deras komplex. MultiBac genomfördes som en öppen tillgång plattform, och standardrutiner som utvecklats för att maximera sin nytta.
Abstract
Proteomik forskning visade imponerande komplexitet eukaryota proteom i oöverträffad detaljrikedom. Det är nu en allmänt accepterad föreställning om att proteiner i cellerna oftast existerar inte som isolerade enheter utan utövar sin biologiska aktivitet tillsammans med många andra proteiner i människan tio eller fler, bildar monteringslinjer i cellen för de flesta om inte alla vitala funktioner. 1 , 2 Kunskap om funktion och arkitektur av dessa Multiproteinkomplex församlingar kräver sin bestämmelse i överlägsen kvalitet och tillräcklig mängd för detaljerad analys. Bristen på många proteinkomplex i cellerna, i synnerhet i eukaryoter, förbjuder deras utvinning från naturliga källor, och kräver rekombinant produktion. The baculovirus expressionsvektorsystem (BEVS) har visat sig vara särskilt användbar för framställning av eukaryota proteiner, förlitar vars aktivitet ofta på posttranslationell bearbetning som andra vanligen använda expressionssystem ofta kaninte stödja. tre BEVS använder ett rekombinant baculovirus i vilken genen av intresse insattes att infektera insekt cellkulturer som i sin tur producerar proteinet av val. MultiBac är en BEVS som har särskilt anpassat för produktion av eukaryota proteinkomplex som innehåller många subenheter. 4 En viktig förutsättning för effektiv produktion av proteiner och deras komplex är robusta protokoll för alla steg som ingår i ett uttryck experiment som helst kan genomföras som standardrutiner (SOP) och följs även av icke-specialiserade användare med jämförande lätthet. Den MultiBac plattform vid European Molecular Biology Laboratory (EMBL) använder standardrutiner för alla steg som ingår i en multiproteinkomplex uttryck experiment, från införandet av gener i en konstruerad bakuloviral genom optimerad för heterologa egenskaper protein produktion till småskalig analys av proteinet exemplar framställda. 5-8 Plattformeninstalleras i ett öppet tillträde läge vid EMBL Grenoble och har stöttat många forskare från akademi och industri att påskynda protein komplexa forskningsprojekt.
Introduction
Biologisk aktivitet styrs av aggregat av proteiner och andra biomolekyler som verkar i samförstånd för att katalysera cellulära funktioner. Noterbara exempel inkluderar det maskineri som transkriberar den ärftliga informationen i DNA till budbärar-RNA. Hos människor, mer än 100 proteiner samlas i en definierad och reglerad process att transkribera gener, bildar stora multiproteinkomplex med 10 och fler subenheter inklusive RNA-polymeras II och de allmänna transkriptionsfaktorer såsom TFIID, TFIIH och andra. 9 Andra exempel är ribosomen, som består av många proteiner och RNA-molekyler, som katalyserar proteinsyntes, eller den nukleära por komplex som är ansvarig för shuttling biomolekyler genom kärnhöljet i eukaryoter. En detaljerad arkitektoniska och biokemisk dissektion av väsentligen alla flerkomponenttextilfibrer maskiner i cellen är viktigt att förstå deras funktion. Strukturen belysning av prokaryota och eukaryotic ribosomer, till exempel, utgjorde kännemärke händelser som ger oöverträffad inblick i hur dessa makromolekylära maskiner utföra sina funktioner i cellen. 10,11
Ribosomer kan erhållas i tillräcklig kvalitet och kvantitet för detaljerad studie genom att rena det endogena material från odlade celler, på grund av det faktum att upp till 30% av den cellulära massan består av ribosomer. RNA-polymeras II är redan mindre rikligt med flera storleksordningar, och många tusen liter av jästkultur måste bearbetas för att få en detaljerad atomär syn på denna viktiga komplex centralt för transkription. 12 Den överväldigande majoriteten av de andra viktiga komplexen är dock närvarande i mycket lägre belopp i nativa celler, och därmed kan inte renas tillräckligt från nativt källmaterialet. Att göra sådana komplex tillgängliga för detaljerad strukturell och funktionell analys kräver heterolog produktion genom att använda rekombinant techniques.
Rekombinant protein produktionen haft en stor inverkan på biovetenskaplig forskning. Många proteiner produceras rekombinant, och deras struktur och funktion dissekerade vid hög upplösning. Structural Genomics program har utnyttjat klargörandet av genomen hos många organismer att ta itu med den repertoar genprodukten av hela organismer i hög genomströmning (HT)-läget. Tusentals proteinstrukturer har sålunda fastställts. Hittills har det mest produktivt använda systemet för rekombinant protein produktion varit E. coli, och många expressionssystem har utvecklats och förfinats genom åren för heterolog produktion i denna värd. De plasmider som härbärgerar en uppsjö av funktioner för att aktivera protein produktion i E. coli fyller hela kataloger av kommersiella leverantörer.
Emellertid E. coli har vissa begränsningar som gör det olämpligt att producera många eukaryota proteiner och partikulära proteinkomplex med många subenheter. Därför har proteinproduktion i eukaryota värdar blivit allt den metod som föredras under senare år. En särskilt väl lämpad för att producera eukaryota proteiner är bakulovirusuttryckningsvektorn systemet (BEVS) som bygger på ett rekombinant baculovirus bär de heterologa gener att infektera insekt cellkulturer odlas i laboratoriet. Den MultiBac-systemet är en mer nyligen utvecklade BEVS som är speciellt anpassade för produktion av eukaryota proteinkomplex med många subenheter (Figur 1). MultiBac först infördes 2004. Sedan introduktionen 13, har MultiBac varit kontinuerligt förfinats och renodlats för att förenkla hantering, förbättra kvaliteten målprotein och allmänt göra systemet tillgängligt för icke-specialiserade användare genom att utforma effektiva standardrutiner (SOP). 4 MultiBac har genomförts i många laboratorier över hela världen, i academia och industri. Vid EMBL i Grenoble, var transnationell tillgång program som införts av Europeiska kommissionen för att ge sakkunnig utbildning vid MultiBac plattform för forskare som ville använda detta produktionssystem för avancera sin forskning. Strukturen och funktionen hos många proteinkomplex som hittills varit inte tillgänglig utreddes med hjälp av prover som produceras med MultiBac. På följande 4, är de viktigaste stegen i MultiBac produktion sammanfattas i protokoll som de är i drift vid MultiBac anläggningen vid EMBL Grenoble.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Tandem Recombineering (TR) för att skapa konstruktioner multigen Expression
- Planering av samexpression strategi. Angreppssätt för att sätta dina gener av intresse i givare och mottagare. Potentiella fysiologiska submodulerna av din komplexa bör grupperas tillsammans på specifika mottagare och givare. Använd multipliceringsmodul bestående av Homing endonukleas (HE) - BstXI par att kombinera uttryckskassetter på individuell Donor och plasmider acceptanttrådar 7,8 Skapa alla relevanta konstruktioner i silico och validera strategi noggrant innan du fortsätter till experimentellt arbete.. Till exempel bör gener av intresse kontrolleras att inte innehålla HE eller andra restriktionsställen och närvaron av korrekta öppna läsramar (ORF) skall valideras. Överväga att beställa syntetiska gener optimerade för insektscellodling kodonanvändningen och mRNA sekundär struktur för att förbättra nivån protein produktion samt avlägsnande av eventuella existing HE webbplatser från generna av intresse. Överväg att placera rening taggar baserade på data från litteraturen om flexibla eller exponerade N-eller C-terminalerna av dina proteiner av valet. Överväg att använda polyproteinprekursorer strategier som syftar till att producera flera subenheter i din komplicerad om de relativa mängderna av enskilda proteiner måste kontrolleras på grund av stökiometri frågor i komplexet. 4 utarbeta detaljerade "How-To" dokument (elektronisk lab Boken rekommenderas) innehåller alla projekterade experimentella steg av projektet som ledde fram till den fullständiga multigen konstruktionen (s). Skapa elektroniska filer av Cre-loxP sammansmälta plasmider till exempel genom att använda Cre-ACEMBLER programvara som kan laddas ner från Berger gruppbostaden sida ( www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies / cre-acembler ).
- Sätt dina gener av intresse i utvalda givare ochAcceptorer med hjälp av restriktionsenzym och ligas, eller, alternativt, genom att använda ligeringsmetoder oberoende metoder efter publicerade protokoll. 5,6,14 Om du har tillgång till en vätskehantering arbete-station och om du planerar ett stort antal konstruktioner som ska genereras ( till exempel för kombinatoriska metoder) överväga att använda robotteknik skript utvecklats och genomförts av Berger gruppen (Figur 2). 14,15 Om en vätskehantering arbete-station inte är tillgänglig, kan manuell drift med mikrotiterplattor geninsättning i en HT som mode.
- Begränsningar av behovet att styra stökiometri de uttryckta subenheter kan förverkligas. I fallet med stökiometriskt obalanserade expressionsnivåer av individuella underenheter av ett proteinkomplex, överväga att tillämpa polyproteiner strategier för att conjoin flera subenheter av din komplexa och ett specifikt proteas (t.ex. tobak etch virus NIA proteas) i enstaka stora ORF åtskilda med särskilda proteolytiska webbplatser. 4,8 Överväg samuttrycker en eller flera polyproteiner med enstaka uttryckskassetter om du har ett mycket stort komplex med många subenheter och allmänt varierande molekylvikt enskilda subenheter. Betrakta samuttrycker flera gener som kodar för samma protein i ett polyprotein eller som flera identiska expressionskassetter om det proteinet kännetecknas av låg produktion utbyte. 4,13
- Validera alla givare och mottagare konstruktioner klonade genom restriktionskartering (eventuellt i high-throughput) och sekvensering. Fortsätt att smälta Donor-acceptanttrådar kombinationer av Cre-LoxP rekombination för att generera konstruktionerna Multigene uttryck av valet. Verifiera renat Acceptor-Donor fusion plasmider genom restriktionskartläggning, använda elektroniska sekvenser skapas av Cre-ACEMBLER eller liknande program som en referens.
- Förvara renade och validerade givare, acceptorer och Donor-acceptanttrådar fusioner vid -20 ° C eller -80 ° C. Arkiv plasmids och deras sekvenser (Microsoft Excel, FileMaker, andra) noggrant för senare användning.
2. Komposit Multigene Bakulovirus Generation, Förstärkning och förvaring
- Integrera Multigene överföringsvektorer den MultiBac bakuloviral genomet genom att omvandla till DH10-celler som hyser det virala genomet och de funktioner som krävs för Tn7 införlivande. Observera att Multibac bakuloviral genomet kan vara förinstallerade med särskilda gener av intresse (YFP markör, följeslagare, etc.) i sin egen LoxP webbplats (konstruerad i genomet distalt om Tn7 fäststället) genom en in vivo-Cre reaktion föregår Tn7 integration. 13 Efter Tn7 införlivande, är celler med komposit bakulovirus innehållande generna av intresse väljs av blå / vit screening (framgångsrika Tn7 införlivande resulterar i förlust av α-komplementering av β-galaktosidas, och därför kolonier med korrekt Tn7 införlivande återstår vit på selektivt engar-plattor innehållande X-gal) och genomet framställs genom alkalisk lys och etanol / isopropanol utfällning. 5,6
- Transfektion och initial virusproduktion. Placera 6-brunnars vävnadsodlingsplatta i sterila huven. Från log-fas Sf21 insektscellodling, frö ut alikvoter av celler i brunnarna och transfektera genom att tillsätta det renade bakuloviral genomet och ett transfektionsreagens blandas i odlingsmedier såsom beskrivits. Sex Skörd initial virus efter 48-60 h genom att avlägsna media ( hög kvalitet, låg titer virus V 0, typiskt 3 ml per brunn). Tillägg färskt medium, och testet för protein produktion (och, om en YFP markör är närvarande, för fluorescens) efter ytterligare 2-3 dagar. 6,7
- Förstärkning av virus, låg MOI regim. Använd V 0 viruset att infektera 25-50 ml celler i log-fas (cell densitet <1x10 6 celler per ml) i små (100-250 ml) Erlenmeyer shaker kolvar upprördPå omloppstid plattform shakers (Figur 3). Räkna celler och dela varje 24 tim tills cellerna slutar fördubbling (proliferation gripande). Följ en låg MOI (mångfald av infektion, dvs antalet viruspartiklar per cell) regim: Cellerna skall fördubblas (minst) en gång (MOI <1), annars upprepa experimentet med en mindre volym V 0 tillsattes. Normalt 3 ml V 0 användes för att infektera 25 ml Sf21-insektsceller vid en densitet av 0.5x10 6 celler / ml. Detta är nödvändigt för att förhindra skadlig över-amplifiering och automatisk borttagning av virus som kan resultera i förlust av de heterologa gener av intresse. Harvest V 1-virus (25-50 ml) efter 48-60 tim genom pelletering celler och ta bort media som innehåller viruset. Komplettera med färska media och provningsmetoder för YFP och protein produktion genom att ta bort 1x10 6 celler var 12 eller 24 timmar, pelletering och validera protein produktion och markör protein (YFP) signal. 6, Amplify virus (tillV 2) ytterligare om större uttryck volymer syftar till genom att infektera upp till 400 ml celler i 2 L shaker kolvar med V 1-virus respekterar ovan nämnda låga MOI regim (celler måste fördubblas åtminstone en gång efter infektion med V 1). Stringent testa protein produktion och markörproteinet signal under förstärkning för att undvika ackumulering av defekta virus inte längre innehåller dina gener av intresse. 5-7 Använd cellpellets ackumuleras vid varje förstärkningar steg redan för upprättande reningsprotokoll för det uttryckta proteinet komplex av intresse.
- BIIC lagring av produktionen virus. Vi rekommenderar starkt att lagra V 2 virus som produktionen virus med hjälp av BIIC (B aculovirus-Jag nfected jag nsect c alnar) metoden för att förhindra ändringar (t.ex. förlust av genen av intresse) av det rekombinanta virus och bevara hög expression nivås 16 Pellets infekterade celler 24 timmar efter spridning gripandet observeras -. I detta skede celler innehåller kompletta viruspartiklar strax innan de skulle släppas (genom knoppning) i mediet. Ta bort media och alikvoter frysning av cellpelleten i flytande kväve och förvaras på obestämd tid. 7,16
Tre. Protein Produktion och bearbetning nedströms
- Infektera stora (R) kulturer och övervakning YFP. Använd V 1, V 2 eller frysta BIIC portioner för att infektera större cellkulturer för serier (vanligen 400 ml i 2 L flaskor). Hålla sig till låg MOI regim (justera virus volym används för infektion så att infekterade kulturen dubblar minst en gång). Större infekterade odlingsvolymer om det behövs genom att multiplicera antalet flaskor. Om YFP markörproteinet är närvarande, dra vid definierade intervall 1x10 6 celler, pellets och lyserar cellerna och övervaka utvecklingen av YFP signalen tills en platå nås indicating maximal rekombinant proteinproduktion. YFP halter kan mätas i en standard 96 brunnar läsare kan registrera fluorescenssignaler (t.ex. Tecan SPECTRAFluor). Harvest celler i detta skede. Förvara cellpelletar vid -20 ° C (kortvarigt) eller -80 ° C (lång sikt).
- Cellys och fraktionering. Lyse cellerna genom din favorit metod för val, anpassade till kraven i din protein (frysning-tining, ultraljudsbehandling, fransk press, andra). 5-7 fraktionera cytosolen och kärnor och testa för förekomst av dina proteiner av intresse. Utveckla reningsprotokoll som baseras på resultaten för att förenkla proteinrening. Överväg att använda blötläggning förfaranden för att extrahera din protein från den nukleära fraktionen under höga KCl villkor om dina proteiner bosatta i kärnan. 7,18
- Proteinrening (mikro-skala, stor skala). Observera att ofta små volymer (10 eller 25 ml) av cellodling är sufficient för erhållande cellpelletar för rening väsentliga mängder dina proteiner av intresse på grund av de ofta höga eller mycket höga produktionsnivåer av heterologa proteiner i baculovirus / insektscellsystem (ofta 10-100 mg protein per L kultur och mer). I samband med mikro-rening (multibrunnplattor, microtip metoder, GE Healthcare ÄKTAmicro system, andra) är det möjligt att erhålla biokemiska och aktivitet data och ofta också tillräcklig mängd av den önskade proteiner och för nanoliter-skala hög genomströmning kristallisation (HTX ). Överväg att använda rening metall affinitet (Clonetech Takara TALON, Qiagen NiNTA metallkelator hartser) och en oligo-histidin (6-10 rester) tag på exponerade subenheter av ditt protein komplex för att underlätta rening, i samverkan med jonbyte och gelkromatografi i små volymer med exempelvis ÄKTAmicro eller en liknande liten volym rening maskin (figur 4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stark samuttryck av heterologa proteiner som uppnåtts genom MultiBac system visas i figur 1d (prober tagits 48 h efter infektera en kultur suspension cell). De överuttryckta proteinbanden är tydligt urskiljbar i helcellextrakt (SNP) och klarnat lysat (SN). Kvaliteten och kvantiteten av det producerade proteinet materialet är ofta tillräcklig för att möjliggöra strukturbestämning av proteinkomplex, såsom mitotiska checkpoint komplexa MCC visas i figur 1e. 17
Figur 2 visar arbetsflödet i en gensammansättning experiment med robot-assisterad tandem recombineering (TR). Robusta DNA montering protokoll var manus till robotteknik rutiner för parallelliserad montering av konstruktioner multigen uttryck. Enskilda robotiserade steg visas i snap-shots (Figur 2c, I - IV). De DNA-komponenter som skall monteras genereras genom PCR och kvalitet kontrolleras ave-geler (figur 2d, vänster), är de hopsatta Multigene konstruktionerna likaså validerats av PCR med specifikt utformade uppsättningar av primers (figur 2d, höger) 14,15.
Rekombinant baculovirus generering och förstärkning följer standardrutiner (schematiskt visas i figur 3a). Ögonblicksbilder av celler odlade i ett monoskikt visas (Figur 3b, I. & II.) Efter infektion med en MultiBac virus.
Vidarebehandling av rekombinanta proteinkomplex kan miniatyriseras med hjälp av multi-väl-platta eller microtip-baserad kromatografi för affinitetsrening följt av gelkromatografi (SEC) av komplexen genom att i arbetsflödet småskaliga system såsom ÄKTAmicro (figur 4a). En representant SEC profil för en ~ 700 kDa mänsklig transkriptionsfaktor komplex visas. Prov renat genom att användaden ÄKTAmicro i liten skala är vanligtvis tillräckligt för karakterisering av biokemiska och biofysiska metoder inklusive elektronmikroskopi (Figur 4b).
Figur 1. MultiBac plattform teknik för multiproteinkomplex produktion. (A) Gener av intresse är integrerade i Multibac bakuloviral genomet genom att använda Tn7 införlivande tillsammans med blå / vit screening. En loxP-stället om det virus som ryggraden medger tillägg av ytterligare funktionaliteter såsom en fluorescerande markörprotein att övervaka virus prestanda och heterolog proteinproduktion. (B) baculovirus antar en långsträckt pinne form och kännetecknas av ett flexibelt hölje som kan öka för att rymma stora (> 130 kb) cirkulär dubbelsträngad DNA-genom. Stora heterologa gen införanden i genomet tolereras by elongating kuvertet. (c) Standard E-kolvar på orbitalskak plattformar kan användas för att odla storskaliga kulturer insektscellinjer för heterologues proteinproduktion. (d) MultiBac systemet effektivt producerar rekombinanta proteiner som ofta är klart synliga redan i hela- cell extrakt (SNP). (e) Strukturen på den mitotiska checkpoint komplexet belysas genom röntgendiffraktion från kristaller odlas från prov som produceras med MultiBac systemet. 17 Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. (Automated) Tandem Recombineering (TR). (A) Tandem recombineering utnyttjar små grupper av syntetiska plasmid-DNA-molekyler som kallas givare och mottagare för montering multigene uttryckskonstruktioner, eventuellt i robot-assisterad läge med en vätskehantering arbete-station (höger). (b) TR arbetsflöde visas. SLIC står för sekvens och ligering oberoende kloning, står Cre för Cre-loxP fusion sammanfoga givare och mottagare i vilka gener av intresse har införts genom SLIC. Multigene expressionskonstruktioner genereras av denna recombineering förfarande med SLIC och Cre i tandem sedan integreras i MultiBac baculovirusgenomet och användas för små och storskaligt uttryck i kulturer insektscellinjer infekterade med rekombinanta virus. (C) Ögonblicksbilder av robotens-assisted TR process visas inklusive tillhandahållande av mall-DNA och primers (I), beredning av PCR-reaktioner i flerbrunnsplattor (II), PCR-amplifiering av DNA: n (III) och framställning av multigenfamilj konstruktioner odlas i bakteriekultur genom alkalisk lys i flerbrunnsplattor ( IV). (d) PCR-produkter som används för TR visualiseras genom ossning av e-gelsystemet (vänster). Genomförda Multigene konstruktioner valideras genom analytiska PCR-reaktioner lastade på en e-gel (till höger). Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. MultiBac virus generation, förstärkning, förvaring. (A) Den standardförfarande (SOP) i MultiBac plattformen vid EMBL Grenoble visas i en schematisk vy. Rekombinant MultiBac virus identifieras med blå-vit screening och framställd av bakteriekulturer. Initial transfektion sker på 6-brunnars plattor ympade med monoskikt av insektsceller (Sf21, Sf9, Hi5, andra). Virus förstärks och målprotein som produceras i Erlenmeyer shakers. Virus lagras genom att frysa alikvoter av infekterade insektsceller (BIIC). Florescence registreras som ett analytiskt verktyg omYFP (eller annan fluorescerande protein) har integrerats som en markör protein till exempel i loxP webbplatsen finns på MultiBac bakuloviral genomet. (B) Ögonblicksbilder av insektsceller infekterade med MultiBac bakuloviruset visas. Cellerna slutar föröka, öka i storlek (I.). Cellfusioner observeras (II). Virus knoppades av de infekterade cellerna i media samlas in och används för att infektera större cellkulturer för protein komplex produktion (III, IV). Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Protein komplexa produktions-och nedströms bearbetning. Protein komplexa prov kan redan lämpligen renas från småskaliga initiala cellkulturer genom att använda miniatyriserade reningsmetoder såsom flerskikts eller mikrospets-baserad rening, eventuellt i kombination med små volymer kromatografisystem (vänster). Ofta utbytet av redan dessa "analytiska" rening körningar (mitten) är tillräcklig för att analysera strukturen och funktionen av det renade komplexet genom en mängd olika sätt, inklusive elektronmikroskopi (höger). Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Video snap-skott i Figurerna 2 och 3 illustrerar hela processen från robot-assisterad generationen från cDNA av multigenfamilj uttryckskonstruktionerna hela vägen till infektion av kryp cellkulturer för proteinproduktion. Nya reagenser (plasmider och virus) samt robusta protokoll har utvecklats för att möjliggöra en rörledning förlita sig på standardrutiner. Hela ledningen har genomförts som en plattform teknik vid EMBL i Grenoble. Den MultiBac plattformen har visats av många forskare från akademi och industri som är engagerade i multiproteinkomplex forskning. Utbildningen tillgång stöds av fasta anslutningar som finansieras av Europeiska kommissionen (P-CUBE, BioSTRUCT-X).
Tillgängligheten av standardrutiner att utföra proteinkomplex uttryck genom att använda det MultiBac systemet har gjort denna teknik lätt mottaglig även för icke-specialiserade användare. Robot-assisterad operation accelererar multiproteinkomplex produktion i particular när ett tillräckligt stort antal av komplex, till exempel varianter och mutanter av ett prov av intresse, måste genereras parallellt. Men manuell drift vid låg till medelhög genomströmning också stor nytta av tillgången på standardrutiner. Enligt vår erfarenhet krävs processer som kan vara framgångsrikt manus i robotik rutiner som ska förfinas först med betydande insatser tills tillräckligt robusta protokoll erhölls som är kompatibla med hjälp av en robot. Sådana protokoll utgör grunden för våra standardrutiner. 5,6,14,15 Faktum är att genomförandet av dessa robusta protokoll för roboten att leda till en mycket betydande effektivitetsvinst också av manuella operationer i vårt laboratorium.
Många proteiner och proteinkomplex har varit och som produceras med hjälp av MultiBac system som vi utvecklat, och nära 500 laboratorier över hela världen har fått de reagenser. MultiBac har katalyseras forskning inte bara i strukturbiologi, men också i många OTHER områdena biovetenskap som undersöker eller utnyttja växelverkan mellan proteiner i stora församlingar. MultiBac har också använts för att producera protein mål i stort farmakologiskt intresse inklusive virusliknande partiklar, som kan bli användbara vaccinkandidater. 4 På senare tid har MultiBac också använts för att leverera gener in i däggdjursceller och cellkulturer, eller ens hela organismer genom genterapi. 4 Vi räknar med att metoder såsom de som illustreras i detta bidrag kommer att vara till nytta för många forskningsområden där Multiproteinkomplex församlingar och komplext samspel av biologiska makromolekyler som utgör grunden för cellulära processer i hälsa och sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
IB är uppfinnare på patent och patentansökningar beskriver delar av den teknik som beskrivs här.
Acknowledgments
Vi tackar Christoph Bieniossek, Simon Trowitzsch, Daniel Fitzgerald, Yuichiro Takagi, Christiane Schaffitzel, Yvonne Hunziker, Timothy Richmond och alla tidigare och nuvarande medlemmar av Berger laboratorium för hjälp och råd. Den MultiBac plattformen och dess utveckling har varit och är generöst stöd från finansiärer, inklusive den schweiziska National Science Foundation (SNSF), Agence National de Recherche (ANR) och Centrum National de Recherche Scientifique (CNRS) och Europeiska kommissionen (EG) i ramprogrammen (FP) 6 och 7. Stöd till gränsöverskridande tillgång ges av EG FP7-projekt P-CUBE ( www.p-cube.eu ) och BioStruct-X ( www.biostruct-x.eu ). Det franska ministeriet för vetenskap är särskilt känd för att stödja MultiBac plattform vid EMBL genom Investissement d'Avenir FRISBI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| Tetracycline | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000X at 50 mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000X at 1M |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP transfection reagent | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6-well plate Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| Liquid nitrogen tank dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| Biological Safety Cabinet Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| Optical Microscope | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 Insect cells | |||
| Hi5 Insect cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO running Evoware plus | TECAN | ||
| 10 μl conductive tips (black), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl conductive tips (black) | TECAN | 10 612 510 | |
| disposable trough for reagents, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, skirted | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 well V bottom, non sterile | BD falcon | 353263 | |
| 96 deepwell plate color natural, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 well flat bottom | Greiner | 655101 | |
| 96 deepwell plate | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24 well blocks RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI restriction enzyme | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | homemade | 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| High DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| Low DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA polymerase, LIC-qualified | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | homemade | ||
| Urea 2 M | homemade | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | Homemade | ||
| LB broth (Miller) 500 g | Athena ES | 103 |
References
- Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. Getting a Grip on Complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
- Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W.
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes. Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).
- Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).
- Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20 (2008).
- Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production. J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).
- Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells. J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).
- Thomas, M. C., Chiang, C. M. The general transcription machinery and general cofactors. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).
- Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N.
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).
- Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism. Science. 288 (5466), 640-649 (2000).
- Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).
- Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
- Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering. Nat. Protocols. , (2009).
- Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus. Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).
- Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford,
- Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a. Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).
