Assemblée des nucléosomiques tableaux de recombinants base histones et nucléosomes ADN positionnement
Summary
Une méthode est présentée pour la reconstitution du modèle nucléosomiques tableaux de histones recombinantes et d'ADN répétées en tandem de positionnement des nucléosomes. Nous décrivons également comment les expériences de la vitesse de sédimentation en ultracentrifugation analytique, et la microscopie à force atomique (AFM) sont utilisés pour mesurer l'ampleur de nucléosomique saturation de tableau après reconstitution.
Abstract
Octamères histones fondamentales qui sont répétitive espacés le long d'une molécule d'ADN sont appelés tableaux nucléosomiques. Tableaux nucléosomes sont obtenus dans une des deux façons suivantes: purification à partir de sources in vivo ou in vitro de reconstitution histones fondamentales recombinants et de l'ADN répétées en tandem de positionnement des nucléosomes. Cette dernière méthode a l'avantage de permettre à l'ensemble d'un uniforme plus de composition et tableau nucléosomique positionné précisément. expériences de vitesse de sédimentation en ultracentrifugation analytique des informations d'élasticité d'environ la taille et la forme des macromolécules en analysant la vitesse à laquelle ils migrent à travers la solution sous la force centrifuge. Cette technique, en même temps que la microscopie à force atomique, peut être utilisé pour le contrôle de qualité, en veillant à ce que la majorité des matrices d'ADN sont saturés avec des nucléosomes après reconstitution. Nous décrivons ici les protocoles nécessaires pour reconstituer quelques milligrammes de longueur et de composition dtableaux nucléosomiques efined appropriés pour les études biochimiques et biophysiques de la structure et la fonction de la chromatine.
Introduction
Génomes eucaryotes n'existent pas d'ADN nu, mais sont compactés et organisées par des protéines liées. Ces complexes d'ADN et de protéines sont connues comme la chromatine. L'unité de répétition de base de la chromatine est le nucléosome. Un nucléosome est constitué d'histone octamère et 146 paires de bases d'ADN enroulé autour de l'octamère d'histone environ 1,6 fois 1. L'octamère d'histones est composé de deux exemplaires de chacun des histones H2A le fondamentales, H2B, H3, et H4. Octamères histones fondamentales qui sont répétitive espacés le long d'une molécule d'ADN sont appelés tableaux nucléosomiques. La structure étendue de tableaux nucléosomiques a été désigné comme la fibre de 10 nm ou les «perles sur un fil" structure et est présent in vitro dans des conditions de faible teneur en sel 2. La fibre de 10 nm est capable de se condenser dans les structures d'ordre supérieur par le compactage intra-groupe et / ou inter-réseau oligomérisation 2. Ces structures d'ordre supérieur peuvent être induites en présence de sels,ou qui peut être influencé par la liaison des protéines de la chromatine à l'architecture du réseau nucléosomale 3,4. Niveaux de compaction de la chromatine sont inversement corrélés avec un taux de transcription dans 5,6 vivo. Les dernières recherches soulignent l'importance de l'organisation structurale des génomes dans des procédés tels que la différenciation, le développement du cancer et d'autres 7,8. L'utilisation de tableaux nucléosomiques pour étudier la structure et la fonction de la chromatine s'est généralisée. Nous décrivons ici une méthode pour l'assemblage de tableaux de nucléosomiques histones recombinantes et d'ADN de positionnement des nucléosomes.
Utilisation de l'ADN recombinant avec des répétitions en tandem de séquences de positionnement des nucléosomes permet la reconstitution des tableaux qui contiennent des nucléosomes régulièrement espacés. Deux des séquences de positionnement plus populaires sont la séquence du gène d'ARNr 5S et le "601" 9,10 de séquence. La séquence 601 a été obtenue à partir d'expériences et la mortalité SELEXe positionne fortement nucléosomes que la séquence 5S 11. Par conséquent, la longueur de liaison de l'ADN des 601 matrices est plus homogène. ADN de positionnement des nucléosomes répétée en tandem est obtenu par filtration sur gel 4,12. Histones recombinantes sont purifiées à partir de E. coli dans des conditions de dénaturation 13. L'utilisation d'histones recombinantes permet de contrôler avec soin la composition de l'histone des matrices nucléosomiques. Par exemple, le noyau histones portant des mutations spécifiques 14 ou modifications post-traductionnelles 15,16 peut être substitué pour histones de type sauvage.
expériences de vitesse de sédimentation de surveiller le taux de sédimentation des macromolécules en solution sous une force centrifuge appliquée 17. Cela donne des informations sur la taille et la forme des macromolécules dans un échantillon. expériences de vitesse de sédimentation sont donc un outil approprié pour l'étude des changements d'état de la solution dans la fibre de chromatinela structure due à la condensation de la chromatine 18. Surtout, il est d'abord nécessaire d'utiliser des expériences de vitesse de sédimentation comme une étape de contrôle de la qualité dans nucléosomique tableau reconstitution. Si l'ADN et les nucléosomes sont pas combinées à un rapport molaire approprié, les tableaux peuvent être sous-ou sur-saturé avec histones. Ainsi, les informations obtenues à partir d'expériences de vitesse de sédimentation est utilisé pour veiller à ce que l'ADN est correctement saturé de nucléosomes. Il est important d'utiliser d'autres méthodes pour estimer la saturation de l'ADN avec des nucléosomes, en particulier si l'on travaille avec une matrice d'ADN non caractérisée. Par conséquent, nous décrivons également un procédé pour l'analyse de réseaux nucléosomales utilisant la microscopie à force atomique (AFM). L'AFM est une technique puissante qui permet la visualisation des effets d'un certain nombre de paramètres, tels que le niveau de saturation, l'effet de la présence de variants d'histones ou les effets de MgCl 2 19,20. AFM a également été applied pour étudier la dynamique des nucléosomes utilisant laps de temps imagerie 21. In vitro assemblés nucléosomiques tableaux 12-mer sont particulièrement favorables à des études de l'AFM, car ils appartiennent à la gamme de la bonne taille pour l'imagerie AFM 22. Dans la présente étude, nous avons utilisé l'AFM de tableaux nucléosomiques comme un contrôle de la qualité ainsi que d'un moyen d'affirmer les données de l'ASC ("voir c'est croire"). En plus de la visualisation simple, l'AFM permet de mesurer des profils de hauteur d'échantillons comme une métrique supplémentaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modèle tableaux de nucléosomiques sont un outil très utile pour l'étude in vitro de la structure et la fonction de la chromatine. Par exemple, ils ont été largement utilisés pour étudier le mécanisme de la condensation de la chromatine de la fibre dans une solution de 30 à 34, et a permis d'obtenir une structure aux rayons X d'un Tetranucleosome 35. Plus récemment, ils se sont avérés utiles à déchiffrer les effets structurels de variantes noyau d'histone spé…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le NIH subventions GM45916 et GM66834 à JCH et une bourse de la Fondation internationale pour le syndrome de Rett AK Ce travail a également été soutenu par des subventions du NIH GM088409 et Howard Hughes Medical Institute contributions à KL
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648-100ML | |
| 6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 21-152-5 | |
| HiLoad Superdex 200 16/60 Column | GE | 17-1069-01 | |
| Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator | Sartorius | VS2031 | |
| 12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 08-667A | |
| Illustra Sephacryl S-1000 Superfine | GE | 17-0476-01 | |
| XL-A/I Analytical Ultracentrifuge | Beckman-Coulter |
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