הרכבה של nucleosomal מערכים מההיסטונים ליבת רקומביננטי והנוקלאוזום המיקום DNA
Summary
שיטה מוצגת לכינון מחדש של מערכי nucleosomal מודל מההיסטונים ליבת רקומביננטי ו-DNA מיצוב הנוקלאוזום חוזר tandemly. אנו גם מתארים כיצד ניסויי מהירות שקיעה בultracentrifuge האנליטיות, ומיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) משמשים לניטור לאחר הכינון מחדש את מידת הרוויה מערך nucleosomal.
Abstract
octamers היסטון ליבה שהם מרווחים שוב ושוב לאורך מולקולת הדנ"א נקרא מערכי nucleosomal. מערכי nucleosomal מתקבלים באחת משתי דרכים: טיהור מin vivo מקורות, או הכינון מחדש במבחנה מההיסטונים ליבת רקומביננטי ו-DNA מיצוב הנוקלאוזום חוזר tandemly. השיטה השנייה יש את היתרון של המאפשר הרכבה של מדים compositionally יותר ומערך nucleosomal ממוקם בדיוק. ניסויי מהירות שקיעה במידע תשואת ultracentrifuge אנליטיים בערך בגודל ובצורה של מקרומולקולות על ידי ניתוח בקצב שבו הם נודדים דרך פתרון מתחת לכוח הצנטריפוגלי. טכניקה זו, יחד עם מיקרוסקופ כוח אטומי, יכולה לשמש לבקרת איכות, על מנת להבטיח כי הרוב המכריע של תבניות DNA רווי בnucleosomes לאחר הכינון מחדש. כאן אנו מתארים את הפרוטוקולים הדרושים כדי לשקם את כמויות מיליגרם של אורך וcompositionally דמערכי nucleosomal efined מתאימים למחקרים ביוכימיים וbiophysical של מבנה הכרומטין ותפקוד.
Introduction
הגנום אוקריוטים לא קיים DNA עירום כ, אלא הם נדחסו ומאורגנים על ידי חלבונים מאוגדים. מתחמים אלה של ה-DNA וחלבונים ידועים כמו הכרומטין. היחידה החוזרת הבסיסית של הכרומטין היא הנוקלאוזום. הנוקלאוזום מורכב מoctamer היסטון ו146 זוגות בסיסים של DNA העטוף סביב octamer היסטון על פי 1.6 1. Octamer היסטון מורכב משני עותקים כל אחד מH2A ההיסטונים ליבה, H2B, H3 ו-H4. octamers היסטון ליבה שהם מרווחים שוב ושוב לאורך מולקולת הדנ"א נקרא מערכי nucleosomal. המבנה המורחב של מערכי nucleosomal כבר מכונה סיבי 10 ננומטר או "חרוזים על חוט" מבנה ונמצא במבחנה בתנאים דלי מלח 2. סיבי 10 ננומטר הוא מסוגלים עיבוי לתוך מבנים מסדר גבוה יותר באמצעות דחיסה תוך מערך ו / או בין המערך oligomerization 2. יכולים להיגרם מבנים מסדר גבוה יותר אלה בנוכחותם של מלחים,או יכול להיות מושפע באמצעות מחייב של חלבונים אדריכליים הכרומטין למערך nucleosomal 3,4. רמות של דחיסת הכרומטין מתואמות באופן הפוך לשיעור של שעתוק ב5,6 vivo. המחקרים אחרונים מדגיש את החשיבות של הארגון המבני של הגנום בתהליכים כגון בידול, התפתחות הסרטן, ואחרים 7,8. השימוש במערכי nucleosomal ללמוד מבנה הכרומטין ותפקוד הפך נפוצים. כאן אנו מתארים שיטה להרכבה של מערכי nucleosomal מההיסטונים ליבת רקומביננטי ו-DNA מיצוב הנוקלאוזום.
באמצעות DNA רקומביננטי בחוזר טנדם של רצפי מיצוב הנוקלאוזום מאפשר לכינון מחדש של מערכים המכילים nucleosomes במרווח קבוע. שניים מהרצפים יותר הפופולריים המיצוב הם רצף גן 5S rRNA ו9,10 "601" הרצף. רצף 601 נגזר מהניסויים Selex ומורדואר בחריפות עמדות nucleosomes מאשר רצף 5S 11. כתוצאה מכך, אורך ה-DNA מקשר של 601 המערכים הוא הומוגנית יותר. ה-DNA מיצוב הנוקלאוזום חוזר Tandemly מתקבלת על ידי סינון ג'ל 4,12. ההיסטונים רקומביננטי הם מטוהרים מE. coli בתנאי denaturing 13. השימוש של ההיסטונים רקומביננטי מאפשר לשלוט בזהירות את הרכב היסטון של מערכי nucleosomal. לדוגמא, ליבת ההיסטונים נושאות מוטציות ספציפיות 14 או לאחר translational שינויים 15,16 יכול להיות תחליף ההיסטונים ליבה מסוג בר.
ניסויי מהירות שקיעה לפקח על קצב השיקוע של מקרומולקולות בתמיסה תחת כוח הצנטריפוגלי הוחל 17. זה מניב מידע על הגודל וצורה של מקרומולקולות במדגם. ניסויי מהירות שקיעה הם אפוא כלי מתאים לחקר שינויי מדינת פתרון בסיבים הכרומטיןמבנה בשל עיבוי הכרומטין 18. חשוב מכך, יש צורך קודם כל להשתמש בניסויי מהירות שקיעה כצעד בקרת איכות בכינון מחדש מערך nucleosomal. אם ה-DNA וnucleosomes אינם משולבים ביחס טוחנת הראוי, המערכים עשויים להיות מתחת או עם ההיסטונים ליבה מעל הרווי. לפיכך, המידע שנצבר מניסויים מהירות שקיעה משמש כדי להבטיח כי ה-DNA הוא רווי כראוי עם nucleosomes. חשוב להשתמש בשיטות חלופיות כדי להעריך את הרוויה של DNA עם nucleosomes, במיוחד אם עובד עם תבנית ה-DNA uncharacterized בעבר. לכן, אנו גם מתארים שיטה לניתוח של מערכי nucleosomal באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). AFM הוא טכניקה רבת עוצמה המאפשרת הדמיה של ההשפעות של מספר הפרמטרים, כגון הרמה של רוויה, השפעה של הנוכחות של וריאנטים היסטון או את ההשפעות של MgCl 2 19,20. AFM כבר גם appliאד ללמוד דינמיקת הנוקלאוזום באמצעות זמן לשגות הדמיה 21. במבחנה התאסף מערכי 12-mer nucleosomal הם נוחים במיוחד למחקרי AFM בטווח הגודל הנכון עבור ההדמיה AFM 22 כי הם שייכים. במחקר הנוכחי השתמשנו AFM של מערכי nucleosomal כמו בקרת איכות, כמו גם כאמצעי המאשר את הנתונים מAUC ("לראות זה להאמין"). בנוסף להדמיה פשוטה, AFM מאפשר מדידה של פרופילי גובה של דגימות כמדד נוסף.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכי nucleosomal מודל הם כלי מאוד שימושי עבור המחקר במבחנה של מבנה הכרומטין ותפקוד. לדוגמא, הם היו בשימוש נרחב כדי ללמוד את המנגנון של עיבוי הכרומטין סיבים בפתרון 30-34, ועשו את זה ניתן להשיג מבנה צילום רנטגן של tetranucleosome 35. לאחרונה הם הוכיחו שימושיים בפענוח ה…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקי GM45916 וGM66834 לJCH ומלגה מהקרן הבינלאומית תסמונת רט לAK עבודה זו נתמכה גם על ידי מענק NIH GM088409 והמכון רפואי הווארד יוז תרומות לKL
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648-100ML | |
| 6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 21-152-5 | |
| HiLoad Superdex 200 16/60 Column | GE | 17-1069-01 | |
| Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator | Sartorius | VS2031 | |
| 12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 08-667A | |
| Illustra Sephacryl S-1000 Superfine | GE | 17-0476-01 | |
| XL-A/I Analytical Ultracentrifuge | Beckman-Coulter |
References
- Luger, K., Mader, A., Richmond, R., Crystal Sargent, D. structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 7, (1997).
- Hansen, J. C. Conformational dynamics of the chromatin fiber in solution: determinants, mechanisms, and functions. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 361-392 (2002).
- McBryant, S., Adams, V., Hansen, J. Chromatin architectural proteins. Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).
- Hansen, J. C., Ausio, J., Stanik, V. H., van Holde, K. E. Homogeneous reconstituted oligonucleosomes, evidence for salt-dependent folding in the absence of histone H1. Biochimie. 28 (23), 9129-9136 (1989).
- Szerlong, H. J., Prenni, J. E., Nyborg, J. K., Hansen, J. C. Activator-dependent p300 acetylation of chromatin in vitro: enhancement of transcription by disruption of repressive nucleosome-nucleosome interactions. The Journal of Biological Chemistry. 285 (42), 31954-31964 (2010).
- Cirillo, L. A., Lin, F. R., Cuesta, I., Friedman, D., Jarnik, M., Zaret, K. S. Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4. Molecular Cell. 9 (2), 279-289 (2002).
- Nguyen, C., Gonzales, F. chromatin structure associated with methylation-induced gene silencing in cancer cells: correlation of accessibility, methylation, MeCP2 binding and acetylation. Nucleic Acids Research. 29 (22), 4598-4606 (2001).
- Cuesta, I., Zaret, K. S., Santisteban, P. The forkhead factor FoxE1 binds to the thyroperoxidase promoter during thyroid cell differentiation and modifies compacted chromatin structure. Molecular and Cellular Biology. 27 (20), 7302-7314 (2007).
- Simpson, R. T., Stafford, D. W. Structural features of a phased nucleosome core particle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 80 (1), 51-55 (1983).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
- Lowary, P., Widlund, H., Cao, H. Sequence motifs and free energies of selected natural and non-natural nucleosome positioning DNA sequences. Journal of Molecular Biology. 288, 213-229 (1999).
- Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C. The Core Histone N-terminal Tail Domains Function Independently and Additively during Salt-dependent Oligomerization of Nucleosomal Arrays *. The Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 33701-33706 (2005).
- Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 119 (4), 1-16 (1999).
- McBryant, S. J., Klonoski, J., et al. Determinants of histone H4 N-terminal domain function during nucleosomal array oligomerization: roles of amino acid sequence, domain length, and charge density. The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16716-16722 (2009).
- Ma Shogren-Knaak, ., Fry, C. J., Peterson, C. L. A native peptide ligation strategy for deciphering nucleosomal histone modifications. The Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15744-158 (2003).
- Lu, X., Simon, M. The effect of H3K79 dimethylation and H4K20 trimethylation on nucleosome and chromatin structure. Nat Struct Mol Biol. 15 (10), 1122-1124 (2008).
- Ausio, J. Analytical Ultracentrifugation for the Analysis of Chromatin Structure. Biophysical Chemistry. 86 (2-3), 141-153 (2000).
- Hansen, J., Kreider, J., Demeler, B., Fletcher, T. Analytical ultracentrifugation and agarose gel electrophoresis as tools for studying chromatin folding in solution. Methods. 12 (1), 62-72 (1997).
- Montel, F., Menoni, H., et al. The dynamics of individual nucleosomes controls the chromatin condensation pathway: direct atomic force microscopy visualization of variant chromatin. Biophysical Journal. 97 (2), 544-5453 (2009).
- Muthurajan, U. M., McBryant, S. J., Lu, X., Hansen, J. C., Luger, K. The linker region of macroH2A promotes self-association of nucleosomal arrays. The Journal of Biological Chemistry. 286 (27), 23852-23864 (2011).
- Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. Biochimie. 48 (33), 7842-7848 (2009).
- Lohr, D., Bash, R., Wang, H., Yodh, J., Lindsay, S. Using atomic force microscopy to study chromatin structure and nucleosome remodeling. Methods (San Diego, Calif). 41 (3), 333-341 (2007).
- Dyer, P. N., Edayathumangalam, R. S., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
- Sambrook, J., Russell, D. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2001).
- Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. J. Vis. Exp. (33), e1530 (2009).
- Demeler, B. UltraScan: a comprehensive data analysis software package for analytical ultracentrifugation experiments. Modern Analytical Ultracentrifugation: Techniques. , 210-230 (2005).
- Holde, K. V., Weischet, W. Boundary analysis of sedimentation velocity experiments with monodisperse and paucidisperse solutes. Biopolymers. 17 (6), 1387-1403 (1978).
- Demeler, B., van Holde, K. E. Sedimentation velocity analysis of highly heterogeneous systems. Analytical Biochemistry. 335, 279-288 (2004).
- Hansen, J., Lohr, D. Assembly and structural properties of subsaturated chromatin arrays. Journal of Biological Chemistry. 8, 5840-5848 (1993).
- Routh, A., Sandin, S., Rhodes, D. Nucleosome repeat length and linker histone stoichiometry determine chromatin fiber structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 105 (26), 8872-8877 (2008).
- Zhou, J., Fan, J. Y., Rangasamy, D., Tremethick, D. J. The nucleosome surface regulates chromatin compaction and couples it with transcriptional repression. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 1070-1076 (2007).
- Dorigo, B., Schalch, T., Kulangara, A., Duda, S., Schroeder, R. R., Richmond, T. J. Nucleosome arrays reveal the two-start organization of the chromatin fiber. Science (New York, N.Y.). 306 (5701), 1571-1573 (2004).
- Correll, S. J., Schubert, M. H., Grigoryev, S. a Short nucleosome repeats impose rotational modulations on chromatin fibre folding. The EMBO Journal. 31 (10), 2416-2426 (2012).
- Mcbryant, S. J., Krause, C., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. The Silent Information Regulator 3 Protein , SIR3p , Binds to Chromatin Fibers and Assembles a Hypercondensed Chromatin Architecture in the Presence of Salt. Molecular and Cellular Biology. 28 (11), 3563-3572 (2008).
- Schalch, T., Duda, S., Sargent, D. F., Richmond, T. J. X-ray structure of a tetranucleosome and its implications for the chromatin fibre. Nature. 436 (7047), 138-1341 (2005).
- Fan, J. Y., Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C., Tremethick, D. J. The essential histone variant H2A.Z regulates the equilibrium between different chromatin conformational states. Nature Structural Biology. 9 (3), 172-176 (2002).
- Carruthers, L. M., Bednar, J., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. Linker histones stabilize the intrinsic salt-dependent folding of nucleosomal arrays: mechanistic ramifications for higher-order chromatin folding. Biochimie. 37 (42), 14776-14787 (1998).
- Huynh, V. A. T., Robinson, P. J. J., Rhodes, D. A Method for the In Vitro Reconstitution of a Defined "30 nm" Chromatin Fibre Containing Stoichiometric Amounts of the Linker Histone. Journal of Molecular Biology. 345 (5), 957-968 (2005).
- Dorigo, B., Schalch, T. Chromatin fiber folding: requirement for the histone H4 N-terminal tail. J. Mol. Biol. 2836 (03), 85-96 (2003).
- Qian, R. L., Liu, Z. X., et al. Visualization of chromatin folding patterns in chicken erythrocytes by atomic force microscopy (AFM. Cell Research. 7 (2), 143-150 (1997).
