Rekombinant çekirdek histon nükleozomal Diziler ve Nükleozom Konumlandırma DNA Meclisi
Summary
Bir yöntem olup, yeniden birleştirici çekirdek histon ikinci modeli nükleozomal dizilerin sulandırma ve tandem tekrar nükleozom konumlandırma DNA için sunulmuştur. Biz de analitik ultrasantrifüjdeki sedimantasyon hızı deneyleri, ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) hazırlandıktan sonra nucleosomal dizi doygunluk düzeyini izlemek için nasıl kullanıldığını açıklar.
Abstract
Burada tekrar tekrar bir DNA molekülü boyunca aralıklı olan Çekirdek histon octamers nükleozomal dizileri olarak adlandırılır. Nükleozomal diziler iki yoldan birinde elde edilmiştir: in vivo kaynaklardan saflaştırılması, yeniden birleştirici ya da çekirdek histon in vitro olarak yeniden oluşum ve tandem tekrar nükleozom konumlandırma DNA. Bu ikinci yöntem daha bileşim bakımından düzenli montajı ve kesin bir konuma sahip nükleozomal dizisi için izin verme avantajına sahiptir. Bu santrifüj kuvveti altında çözelti içinden geçiş hızını analiz ederek makro moleküllerin büyüklüğü ve şekli ile ilgili analitik ultrasantrifüj verim bilgilerde sedimantasyon hızının deneyleri. Bu teknik, atomik kuvvet mikroskopisi ile birlikte, DNA şablonları çoğunluğu sulandırıldıktan sonra nükleozom doymuş olmasının sağlanması, kalite kontrol için kullanılabilir. Burada uzunluğu miligram miktarları yeniden yapılandırmak için gerekli ve bileşim açısından tarif d protokollerikromatin yapısı ve fonksiyonu biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmalar için uygun efined nucleosomal diziler.
Introduction
Ökaryotik genomları gibi çıplak DNA yoktur, ama yerine sıkıştırılmış ve bağlı proteinler tarafından organize edilir. DNA ve protein Bu kompleksler, kromatin olarak bilinir. Kromatinlerin temel tekrarlanan ünite nucleosome olduğunu. Bir nucleosome histon oktamer ve yaklaşık 1,6 kat 1 oktamer histona sarılı DNA 146 baz çiftinden oluşmuştur. Histon oktamer iki kopya çekirdek histon H2A, H2B, H3 ve H4 her oluşmaktadır. Burada tekrar tekrar bir DNA molekülü boyunca aralıklı olan Çekirdek histon octamers nükleozomal dizileri olarak adlandırılır. Nükleozomal dizilerinin yapısı, uzatılmış bir yapı "ipe dizili boncuklar" 10 nm ya da lif olarak adlandırılır ve düşük tuz koşulları altında 2, in vitro olarak mevcut olmuştur. 10 nm fiber içi dizi sıkıştırma ve / veya arası dizi oligomerizasyonu 2 vasıtasıyla daha yüksek düzeyde yapılar içine yoğunlaştırma yeteneğine sahip olduğunu. Bu yüksek sıralanmaları, tuzların mevcudiyetinde indüklenebilirveya nükleozomal dizi 3,4 kromatin mimari proteinlerin bağlanma yoluyla etkilenebilir. Kromatin sıkıştırma düzeyleri ters vivo 5,6 transkripsiyon oranı ile ilişkilidir. Son araştırmalar, farklılaşma, kanser gelişimi ve diğerleri 7,8 gibi süreçlerde Genomların yapısal kuruluşun önemini vurgulamaktadır. Kromatin yapısını ve işlevini incelemek için nucleosomal dizilerin kullanımı yaygın hale gelmiştir. Burada rekombinant çekirdek histon ve nucleosome konumlandırma DNA'dan nucleosomal dizilerin montajı için bir yöntem açıklanmaktadır.
Nükleozom konumlandırma dizilerin tandem tekrarı ile rekombinant DNA kullanarak düzenli olarak aralıklı nükleozom içeren dizilerin yeniden oluşturulması için izin verir. Daha popüler konumlandırma dizilerin iki 5S rRNA gen sekansı ve "601" sekans 9,10 bulunmaktadır. 601 dizisi SELEX deneyler ve mor elde edildie güçlü 5S dizisi 11 daha nükleozom konumlandırır. Sonuç olarak, 601 dizilerinin, bağlayıcı DNA uzunluğu daha homojendir. Tandem tekrar nükleozom konumlandırma DNA jel filtrasyonu 4,12 ile elde edilir. Rekombinant E. histonlar saflaştınlır denatüre edici koşullar altında 13 coli. Rekombinant histonların kullanımı bir dikkatle nucleosomal dizilerin histon kompozisyonunu kontrol etmenizi sağlar. Örneğin, çekirdek 15,16 yabani tip çekirdek histon ikame edilebilir spesifik mutasyonlar 14 ya da post-translasyonel modifikasyonlar taşıyan histonlar.
Çökeltme hız deneyleri uygulanan santrifüj kuvveti altında 17 çözeltisi içinde makromoleküllerin sedimantasyon hızını izler. Bu, bir numunede makromoleküllerin büyüklüğü ve şekli hakkında bilgi verir. Sedimantasyon hızı deneyleri böylece kromatin lif çözüm durum değişiklikleri incelemek için uygun bir araçtırkromatin yoğunlaşması 18 yapısı nedeniyle. Önemlisi, nucleosomal dizi sulandırma bir kalite kontrol adım olarak sedimantasyon hızı deneyleri kullanmak için ilk gerekli olan. DNA ve nükleozom uygun mol oranında birleştirilir değilseniz, diziler altında veya aşırı doymuş bir çekirdek histon sahip olabilir. Böylece, sedimantasyon hızının deneylerden elde edilen bilgiler, DNA uygun bir şekilde nükleozom ile doymuş olduğunu sağlamak için kullanılır. Bu, daha önce karakterize edilmemiş DNA şablonu ile çalışan, özellikle nükleozom ile DNA'nın doygunluk tahmin etmek için alternatif yöntemler kullanmak önemlidir. Bu nedenle, daha da atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ile nükleozomal dizilerin analizi için bir yöntem tarif eder. AFM sağlayan güçlü bir tekniktir bu doyma seviyesi, histon varyantlarının varlığı etkisi ya da MgCI2 19,20 etkileri gibi parametreler, bir dizi etkilerinin görselleştirilmesi. AFM da başvurunun olmuştured zaman atlamalı görüntüleme 21 kullanılarak nucleosome dinamiklerini incelemek için. In vitro onlar AFM görüntüleme 22 için doğru boyut aralığındaki ait çünkü nucleosomal 12-mer diziler AFM çalışmalara özellikle yatkındır toplandı. Bu çalışmada, bir kalite kontrol gibi ("Görmek inanmaktır") AUC verileri onaylayan bir aracı olarak nucleosomal dizilerin AFM kullandık. Basit bir görselleştirme ek olarak, AFM ek bir ölçüt olarak numune yüksekliği profilleri ölçülmesini sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Model nucleosomal diziler kromatin yapısı ve fonksiyonu in vitro çalışma için çok yararlı bir araçtır. Örneğin, yaygın olarak çözelti 30-34 kromatin fiber yoğuşma mekanizmasını incelemek için kullanılan ve mümkün bir tetranucleosome 35 bir x-ışını yapı elde etmek için yapılmıştır. Daha yakın zamanlarda bu, belirli çekirdek histon varyantları, mutantlan ve posttranslasyonel modifikasyonlar 14-16,36 yapısal etkileri çözmekte yararlı olduğu …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH hibe GM45916 ve GM66834 Hi'de ve bu işi Ak Uluslararası Rett Sendromu Vakfı bir burs ile desteklenmiştir da NIH GM088409 ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü KL katkıları hibe tarafından desteklenen
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648-100ML | |
| 6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 21-152-5 | |
| HiLoad Superdex 200 16/60 Column | GE | 17-1069-01 | |
| Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator | Sartorius | VS2031 | |
| 12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 08-667A | |
| Illustra Sephacryl S-1000 Superfine | GE | 17-0476-01 | |
| XL-A/I Analytical Ultracentrifuge | Beckman-Coulter |
References
- Luger, K., Mader, A., Richmond, R., Crystal Sargent, D. structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 7, (1997).
- Hansen, J. C. Conformational dynamics of the chromatin fiber in solution: determinants, mechanisms, and functions. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 361-392 (2002).
- McBryant, S., Adams, V., Hansen, J. Chromatin architectural proteins. Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).
- Hansen, J. C., Ausio, J., Stanik, V. H., van Holde, K. E. Homogeneous reconstituted oligonucleosomes, evidence for salt-dependent folding in the absence of histone H1. Biochimie. 28 (23), 9129-9136 (1989).
- Szerlong, H. J., Prenni, J. E., Nyborg, J. K., Hansen, J. C. Activator-dependent p300 acetylation of chromatin in vitro: enhancement of transcription by disruption of repressive nucleosome-nucleosome interactions. The Journal of Biological Chemistry. 285 (42), 31954-31964 (2010).
- Cirillo, L. A., Lin, F. R., Cuesta, I., Friedman, D., Jarnik, M., Zaret, K. S. Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4. Molecular Cell. 9 (2), 279-289 (2002).
- Nguyen, C., Gonzales, F. chromatin structure associated with methylation-induced gene silencing in cancer cells: correlation of accessibility, methylation, MeCP2 binding and acetylation. Nucleic Acids Research. 29 (22), 4598-4606 (2001).
- Cuesta, I., Zaret, K. S., Santisteban, P. The forkhead factor FoxE1 binds to the thyroperoxidase promoter during thyroid cell differentiation and modifies compacted chromatin structure. Molecular and Cellular Biology. 27 (20), 7302-7314 (2007).
- Simpson, R. T., Stafford, D. W. Structural features of a phased nucleosome core particle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 80 (1), 51-55 (1983).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
- Lowary, P., Widlund, H., Cao, H. Sequence motifs and free energies of selected natural and non-natural nucleosome positioning DNA sequences. Journal of Molecular Biology. 288, 213-229 (1999).
- Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C. The Core Histone N-terminal Tail Domains Function Independently and Additively during Salt-dependent Oligomerization of Nucleosomal Arrays *. The Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 33701-33706 (2005).
- Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 119 (4), 1-16 (1999).
- McBryant, S. J., Klonoski, J., et al. Determinants of histone H4 N-terminal domain function during nucleosomal array oligomerization: roles of amino acid sequence, domain length, and charge density. The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16716-16722 (2009).
- Ma Shogren-Knaak, ., Fry, C. J., Peterson, C. L. A native peptide ligation strategy for deciphering nucleosomal histone modifications. The Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15744-158 (2003).
- Lu, X., Simon, M. The effect of H3K79 dimethylation and H4K20 trimethylation on nucleosome and chromatin structure. Nat Struct Mol Biol. 15 (10), 1122-1124 (2008).
- Ausio, J. Analytical Ultracentrifugation for the Analysis of Chromatin Structure. Biophysical Chemistry. 86 (2-3), 141-153 (2000).
- Hansen, J., Kreider, J., Demeler, B., Fletcher, T. Analytical ultracentrifugation and agarose gel electrophoresis as tools for studying chromatin folding in solution. Methods. 12 (1), 62-72 (1997).
- Montel, F., Menoni, H., et al. The dynamics of individual nucleosomes controls the chromatin condensation pathway: direct atomic force microscopy visualization of variant chromatin. Biophysical Journal. 97 (2), 544-5453 (2009).
- Muthurajan, U. M., McBryant, S. J., Lu, X., Hansen, J. C., Luger, K. The linker region of macroH2A promotes self-association of nucleosomal arrays. The Journal of Biological Chemistry. 286 (27), 23852-23864 (2011).
- Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. Biochimie. 48 (33), 7842-7848 (2009).
- Lohr, D., Bash, R., Wang, H., Yodh, J., Lindsay, S. Using atomic force microscopy to study chromatin structure and nucleosome remodeling. Methods (San Diego, Calif). 41 (3), 333-341 (2007).
- Dyer, P. N., Edayathumangalam, R. S., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
- Sambrook, J., Russell, D. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2001).
- Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. J. Vis. Exp. (33), e1530 (2009).
- Demeler, B. UltraScan: a comprehensive data analysis software package for analytical ultracentrifugation experiments. Modern Analytical Ultracentrifugation: Techniques. , 210-230 (2005).
- Holde, K. V., Weischet, W. Boundary analysis of sedimentation velocity experiments with monodisperse and paucidisperse solutes. Biopolymers. 17 (6), 1387-1403 (1978).
- Demeler, B., van Holde, K. E. Sedimentation velocity analysis of highly heterogeneous systems. Analytical Biochemistry. 335, 279-288 (2004).
- Hansen, J., Lohr, D. Assembly and structural properties of subsaturated chromatin arrays. Journal of Biological Chemistry. 8, 5840-5848 (1993).
- Routh, A., Sandin, S., Rhodes, D. Nucleosome repeat length and linker histone stoichiometry determine chromatin fiber structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 105 (26), 8872-8877 (2008).
- Zhou, J., Fan, J. Y., Rangasamy, D., Tremethick, D. J. The nucleosome surface regulates chromatin compaction and couples it with transcriptional repression. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 1070-1076 (2007).
- Dorigo, B., Schalch, T., Kulangara, A., Duda, S., Schroeder, R. R., Richmond, T. J. Nucleosome arrays reveal the two-start organization of the chromatin fiber. Science (New York, N.Y.). 306 (5701), 1571-1573 (2004).
- Correll, S. J., Schubert, M. H., Grigoryev, S. a Short nucleosome repeats impose rotational modulations on chromatin fibre folding. The EMBO Journal. 31 (10), 2416-2426 (2012).
- Mcbryant, S. J., Krause, C., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. The Silent Information Regulator 3 Protein , SIR3p , Binds to Chromatin Fibers and Assembles a Hypercondensed Chromatin Architecture in the Presence of Salt. Molecular and Cellular Biology. 28 (11), 3563-3572 (2008).
- Schalch, T., Duda, S., Sargent, D. F., Richmond, T. J. X-ray structure of a tetranucleosome and its implications for the chromatin fibre. Nature. 436 (7047), 138-1341 (2005).
- Fan, J. Y., Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C., Tremethick, D. J. The essential histone variant H2A.Z regulates the equilibrium between different chromatin conformational states. Nature Structural Biology. 9 (3), 172-176 (2002).
- Carruthers, L. M., Bednar, J., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. Linker histones stabilize the intrinsic salt-dependent folding of nucleosomal arrays: mechanistic ramifications for higher-order chromatin folding. Biochimie. 37 (42), 14776-14787 (1998).
- Huynh, V. A. T., Robinson, P. J. J., Rhodes, D. A Method for the In Vitro Reconstitution of a Defined "30 nm" Chromatin Fibre Containing Stoichiometric Amounts of the Linker Histone. Journal of Molecular Biology. 345 (5), 957-968 (2005).
- Dorigo, B., Schalch, T. Chromatin fiber folding: requirement for the histone H4 N-terminal tail. J. Mol. Biol. 2836 (03), 85-96 (2003).
- Qian, R. L., Liu, Z. X., et al. Visualization of chromatin folding patterns in chicken erythrocytes by atomic force microscopy (AFM. Cell Research. 7 (2), 143-150 (1997).
