Ассамблея нуклеосомной массивов из рекомбинантных стержневых гистонов и позиционированием нуклеосом ДНК
Summary
Представлен метод для восстановления модельных нуклеосомных массивов из рекомбинантных стержневых гистонов и тандемно повторного ДНК нуклеосом позиционирования. Мы также описать, как эксперименты скорости оседания в аналитической ультрацентрифуге и атомно-силовой микроскопии (АСМ) используются для мониторинга масштабов нуклеосомной насыщения массива после восстановления.
Abstract
Основные гистонов октамеры, которые повторно расположенных вдоль молекулы ДНК называют нуклеосомной массивы. Нуклеосомной массивы, полученные в одном из двух способов: очищение от естественных условиях источников в, или восстановление в пробирке из рекомбинантных стержневых гистонов и тандемно повторил ДНК нуклеосом позиционирования. Последний метод имеет то преимущество, что позволяет для сборки более композиционно форме и точно позиционируется нуклеосомной массива. Эксперименты скорости седиментации в аналитической информации текучести ультрацентрифуге о размере и форме макромолекул путем анализа скорости, с которой они мигрируют через раствора под действием центробежной силы. Этот метод, а также атомно-силовой микроскопии, могут быть использованы для контроля качества, гарантируя, что большинство ДНК-матриц насыщены нуклеосом после восстановления. Здесь мы опишем протоколы, необходимые для восстановления миллиграмм количества длину и композиционно Defined нуклеосомной массивы, пригодные для биохимических и биофизических исследований структуры хроматина и функции.
Introduction
Геномах эукариот не существуют как чистую ДНК, а уплотняются и организован связанных белков. Эти комплексы ДНК и белка известны как хроматина. Основная повторяющееся звено хроматина является нуклеосома. Нуклеосом состоит из гистона октамера и 146 пар оснований ДНК, обернутой вокруг гистона октамер примерно в 1,6 раза 1. Гистон октамер состоит из двух копий каждого из стержневых гистонов H2A, H2B, H3 и H4,. Основные гистонов октамеры, которые повторно расположенных вдоль молекулы ДНК называют нуклеосомной массивы. Расширенная структура нуклеосомных массивов был передан в качестве 10 нм волокна или "бусины на нитке" структуры и присутствует в пробирке в условиях низких соли 2. 10 нм волокна способен конденсации в высших порядков структур через внутри массива уплотнения и / или между массива олигомеризации 2. Эти структуры более высокого порядка может быть индуцирован в присутствии солей,или может быть под влиянием через связывание хроматина архитектурных белков в нуклеосомной массива 3,4. Уровни хроматина уплотнения являются обратно коррелирует со скоростью транскрипции в естественных условиях 5,6. Недавние исследования подчеркивает важность структурной организации геномов в таких процессах, как дифференциации, развитию рака и других 7,8. Использование нуклеосомных массивов изучать структуру хроматина и функции стала широко распространенной. Здесь мы опишем метод для сборки нуклеосомных массивов из рекомбинантных стержневых гистонов и ДНК нуклеосом позиционирования.
Использование рекомбинантной ДНК с тандемных повторов нуклеосомных последовательностей позиционирования позволяет восстановления массивов, которые содержат регулярно расположенных нуклеосом. Два из наиболее популярных последовательностей позиционирования являются последовательность гена 5S рРНК и "601" последовательность 9,10. Последовательность 601 была получена из SELEX экспериментов и море сильно позиционирует нуклеосом, чем последовательности 5S 11. Следовательно, длина линкера ДНК из 601 массивов является более однородным. Тандемно повтор ющиес нуклеосом ДНК позиционирование полученный с помощью гель-фильтрации 4,12. Рекомбинантные гистоны очищенный от E. палочка в условиях денатурирующих 13. Использование рекомбинантных гистонов позволяет тщательно контролировать гистонов состав нуклеосомных массивов. Например, стержневых гистонов принимая специфические мутации 14 или пост-трансляционные модификации 15,16 может быть заменен на дикого типа стержневых гистонов.
Эксперименты скорости оседания контролировать скорость осаждения макромолекул в растворе при приложенном центробежной силы 17. Это дает информацию о размере и форме макромолекул в образце. Таким образом, эксперименты скорости оседания являются подходящим инструментом для изучения изменения состояния решения в хроматина волокнаСтруктура из-за конденсации хроматина 18. Важно отметить, что в первую очередь необходимо использовать эксперименты седиментации скорости как шаг контроля качества в нуклеосомной восстановления массива. Если ДНК и нуклеосомы не объединяются в надлежащее молярном соотношении, массивы могут быть недо-или перенасыщен стержневых гистонов. Таким образом, информация, полученная из экспериментов седиментации скорости используется для того, чтобы должным образом ДНК нуклеосомы насыщен. Важно использовать альтернативные методы оценки насыщенности ДНК с нуклеосом, особенно при работе с ранее неохарактеризованной ДНК-матрицы. Таким образом, мы также описывают способ анализа нуклеосомных массивах, используя атомно-силовой микроскопии (АСМ). АСМ является мощная техника, которая позволяет визуализация эффектов ряда параметров, таких как уровень насыщенности, эффекта присутствия вариантов гистонов или последствий MgCl 2 19,20. АСМ также был Appliред изучать динамику нуклеосом используя промежуток времени визуализации 21. Экстракорпоральное собраны нуклеосомной массивы 12-мерные особенно поддаются АСМ исследований, потому что они принадлежат в правильном диапазоне размеров для АСМ-изображений 22. В настоящем исследовании мы использовали АСМ из нуклеосомных массивов как контроль качества, а также средства утверждения данные из AUC ("увижу, не поверю»). В дополнение к простой визуализации, АСМ позволяет измерять профилей высоты образцов в качестве дополнительного показателя.
Protocol
Representative Results
Discussion
Модель массивы нуклеосомной являются очень полезным инструментом для изучения в пробирке структуры хроматина и функции. Например, они широко используются для изучения механизма образования конденсата хроматина волокна в растворе 30-34, и позволило получить структуру рентге…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH гранты GM45916 и GM66834 к JCH и общения с Международной Ретта синдром Фонда AK Эта работа также была поддержана NIH грант GM088409 и Медицинского института Говарда Хьюза вклад в KL
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648-100ML | |
| 6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 21-152-5 | |
| HiLoad Superdex 200 16/60 Column | GE | 17-1069-01 | |
| Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator | Sartorius | VS2031 | |
| 12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 08-667A | |
| Illustra Sephacryl S-1000 Superfine | GE | 17-0476-01 | |
| XL-A/I Analytical Ultracentrifuge | Beckman-Coulter |
References
- Luger, K., Mader, A., Richmond, R., Crystal Sargent, D. structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 7, (1997).
- Hansen, J. C. Conformational dynamics of the chromatin fiber in solution: determinants, mechanisms, and functions. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 361-392 (2002).
- McBryant, S., Adams, V., Hansen, J. Chromatin architectural proteins. Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).
- Hansen, J. C., Ausio, J., Stanik, V. H., van Holde, K. E. Homogeneous reconstituted oligonucleosomes, evidence for salt-dependent folding in the absence of histone H1. Biochimie. 28 (23), 9129-9136 (1989).
- Szerlong, H. J., Prenni, J. E., Nyborg, J. K., Hansen, J. C. Activator-dependent p300 acetylation of chromatin in vitro: enhancement of transcription by disruption of repressive nucleosome-nucleosome interactions. The Journal of Biological Chemistry. 285 (42), 31954-31964 (2010).
- Cirillo, L. A., Lin, F. R., Cuesta, I., Friedman, D., Jarnik, M., Zaret, K. S. Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4. Molecular Cell. 9 (2), 279-289 (2002).
- Nguyen, C., Gonzales, F. chromatin structure associated with methylation-induced gene silencing in cancer cells: correlation of accessibility, methylation, MeCP2 binding and acetylation. Nucleic Acids Research. 29 (22), 4598-4606 (2001).
- Cuesta, I., Zaret, K. S., Santisteban, P. The forkhead factor FoxE1 binds to the thyroperoxidase promoter during thyroid cell differentiation and modifies compacted chromatin structure. Molecular and Cellular Biology. 27 (20), 7302-7314 (2007).
- Simpson, R. T., Stafford, D. W. Structural features of a phased nucleosome core particle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 80 (1), 51-55 (1983).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
- Lowary, P., Widlund, H., Cao, H. Sequence motifs and free energies of selected natural and non-natural nucleosome positioning DNA sequences. Journal of Molecular Biology. 288, 213-229 (1999).
- Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C. The Core Histone N-terminal Tail Domains Function Independently and Additively during Salt-dependent Oligomerization of Nucleosomal Arrays *. The Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 33701-33706 (2005).
- Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 119 (4), 1-16 (1999).
- McBryant, S. J., Klonoski, J., et al. Determinants of histone H4 N-terminal domain function during nucleosomal array oligomerization: roles of amino acid sequence, domain length, and charge density. The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16716-16722 (2009).
- Ma Shogren-Knaak, ., Fry, C. J., Peterson, C. L. A native peptide ligation strategy for deciphering nucleosomal histone modifications. The Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15744-158 (2003).
- Lu, X., Simon, M. The effect of H3K79 dimethylation and H4K20 trimethylation on nucleosome and chromatin structure. Nat Struct Mol Biol. 15 (10), 1122-1124 (2008).
- Ausio, J. Analytical Ultracentrifugation for the Analysis of Chromatin Structure. Biophysical Chemistry. 86 (2-3), 141-153 (2000).
- Hansen, J., Kreider, J., Demeler, B., Fletcher, T. Analytical ultracentrifugation and agarose gel electrophoresis as tools for studying chromatin folding in solution. Methods. 12 (1), 62-72 (1997).
- Montel, F., Menoni, H., et al. The dynamics of individual nucleosomes controls the chromatin condensation pathway: direct atomic force microscopy visualization of variant chromatin. Biophysical Journal. 97 (2), 544-5453 (2009).
- Muthurajan, U. M., McBryant, S. J., Lu, X., Hansen, J. C., Luger, K. The linker region of macroH2A promotes self-association of nucleosomal arrays. The Journal of Biological Chemistry. 286 (27), 23852-23864 (2011).
- Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. Biochimie. 48 (33), 7842-7848 (2009).
- Lohr, D., Bash, R., Wang, H., Yodh, J., Lindsay, S. Using atomic force microscopy to study chromatin structure and nucleosome remodeling. Methods (San Diego, Calif). 41 (3), 333-341 (2007).
- Dyer, P. N., Edayathumangalam, R. S., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
- Sambrook, J., Russell, D. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2001).
- Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. J. Vis. Exp. (33), e1530 (2009).
- Demeler, B. UltraScan: a comprehensive data analysis software package for analytical ultracentrifugation experiments. Modern Analytical Ultracentrifugation: Techniques. , 210-230 (2005).
- Holde, K. V., Weischet, W. Boundary analysis of sedimentation velocity experiments with monodisperse and paucidisperse solutes. Biopolymers. 17 (6), 1387-1403 (1978).
- Demeler, B., van Holde, K. E. Sedimentation velocity analysis of highly heterogeneous systems. Analytical Biochemistry. 335, 279-288 (2004).
- Hansen, J., Lohr, D. Assembly and structural properties of subsaturated chromatin arrays. Journal of Biological Chemistry. 8, 5840-5848 (1993).
- Routh, A., Sandin, S., Rhodes, D. Nucleosome repeat length and linker histone stoichiometry determine chromatin fiber structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 105 (26), 8872-8877 (2008).
- Zhou, J., Fan, J. Y., Rangasamy, D., Tremethick, D. J. The nucleosome surface regulates chromatin compaction and couples it with transcriptional repression. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 1070-1076 (2007).
- Dorigo, B., Schalch, T., Kulangara, A., Duda, S., Schroeder, R. R., Richmond, T. J. Nucleosome arrays reveal the two-start organization of the chromatin fiber. Science (New York, N.Y.). 306 (5701), 1571-1573 (2004).
- Correll, S. J., Schubert, M. H., Grigoryev, S. a Short nucleosome repeats impose rotational modulations on chromatin fibre folding. The EMBO Journal. 31 (10), 2416-2426 (2012).
- Mcbryant, S. J., Krause, C., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. The Silent Information Regulator 3 Protein , SIR3p , Binds to Chromatin Fibers and Assembles a Hypercondensed Chromatin Architecture in the Presence of Salt. Molecular and Cellular Biology. 28 (11), 3563-3572 (2008).
- Schalch, T., Duda, S., Sargent, D. F., Richmond, T. J. X-ray structure of a tetranucleosome and its implications for the chromatin fibre. Nature. 436 (7047), 138-1341 (2005).
- Fan, J. Y., Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C., Tremethick, D. J. The essential histone variant H2A.Z regulates the equilibrium between different chromatin conformational states. Nature Structural Biology. 9 (3), 172-176 (2002).
- Carruthers, L. M., Bednar, J., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. Linker histones stabilize the intrinsic salt-dependent folding of nucleosomal arrays: mechanistic ramifications for higher-order chromatin folding. Biochimie. 37 (42), 14776-14787 (1998).
- Huynh, V. A. T., Robinson, P. J. J., Rhodes, D. A Method for the In Vitro Reconstitution of a Defined "30 nm" Chromatin Fibre Containing Stoichiometric Amounts of the Linker Histone. Journal of Molecular Biology. 345 (5), 957-968 (2005).
- Dorigo, B., Schalch, T. Chromatin fiber folding: requirement for the histone H4 N-terminal tail. J. Mol. Biol. 2836 (03), 85-96 (2003).
- Qian, R. L., Liu, Z. X., et al. Visualization of chromatin folding patterns in chicken erythrocytes by atomic force microscopy (AFM. Cell Research. 7 (2), 143-150 (1997).
