Assemblea dei nucleosomal matrici da ricombinanti core istoni e nucleosomi posizionamento DNA
Summary
Un metodo viene presentato per la ricostituzione del modello nucleosomal array di istoni fondamentali ricombinanti e tandem ripetute di DNA posizionamento dei nucleosomi. Abbiamo anche descrivono come gli esperimenti di velocità di sedimentazione nel ultracentrifuga analitica e microscopia a forza atomica (AFM) vengono utilizzati per monitorare il grado di saturazione matrice nucleosomal dopo la ricostituzione.
Abstract
Octamers istoni core che sono ripetitivamente distanziati lungo una molecola di DNA sono chiamati matrici nucleosomal. Array nucleosomi sono ottenuti in uno dei due modi: la purificazione da fonti in vivo, o la ricostituzione in vitro da istoni fondamentali ricombinanti e tandem ripetute di DNA posizionamento dei nucleosomi. Il secondo metodo ha il vantaggio di consentire il montaggio di una più uniforme composizionale e matrice nucleosomal posizionamento preciso. Esperimenti velocità di sedimentazione del ultracentrifuga informazioni resa analitica circa le dimensioni e la forma delle macromolecole analizzando il tasso al quale migrano attraverso la soluzione sotto la forza centrifuga. Questa tecnica, insieme con microscopia a forza atomica, può essere utilizzato per il controllo di qualità, garantendo che la maggioranza dei modelli di DNA sono saturi di nucleosomi dopo ricostituzione. Qui si descrivono i protocolli necessari per ricostituire quantità milligrammo di lunghezza e compositivamente darray nucleosomal efined adatte per gli studi biochimici e biofisici della struttura e funzione della cromatina.
Introduction
Genomi eucariotici non esistono DNA nudo, ma piuttosto vengono compattati e organizzati da proteine legate. Questi complessi di DNA e proteine sono noti come cromatina. L'unità di ripetizione di base della cromatina è il nucleosoma. Un nucleosoma è costituito da istoni ottamero e 146 paia di basi di DNA avvolto intorno al istoni ottamero circa 1,6 volte 1. Il ottamero istone è composto di due copie ciascuna delle istoni H2A nucleo, H2B, H3, e H4. Octamers istoni core che sono ripetitivamente distanziati lungo una molecola di DNA sono chiamati matrici nucleosomal. La struttura ampliata di matrici nucleosomal è stato definito come la fibra 10 nm o le "perle su una stringa" struttura ed è presente in vitro in condizioni di scarsa sale 2. La fibra 10 nm è in grado di condensare in strutture di ordine superiore attraverso intra-array compattazione e / o inter-array di oligomerizzazione 2. Queste strutture di ordine superiore possono essere indotte in presenza di sali,o possono essere influenzati tramite il legame di proteine architettoniche cromatina all'array nucleosomal 3,4. I livelli di compattazione della cromatina sono inversamente correlati con il tasso di trascrizione in vivo 5,6. Recenti ricerche evidenzia l'importanza della organizzazione strutturale di genomi in processi quali il differenziamento, lo sviluppo del cancro, e altri 7,8. L'uso di matrici nucleosomal per studiare la struttura e la funzione della cromatina è diffusa. Qui si descrive un metodo per l'assemblaggio di array nucleosomal da istoni fondamentali ricombinanti e nucleosoma posizionamento DNA.
Utilizzo di DNA ricombinante con ripetizioni in tandem di sequenze di posizionamento nucleosome consente la ricostituzione degli array che contengono nucleosomi intervalli regolari. Due delle sequenze di posizionamento più popolari sono la sequenza del gene rRNA 5S e la "601" sequenza 9,10. La sequenza 601 è stato derivato da esperimenti SELEX e more posizioni molto nucleosomi rispetto alla sequenza 5S 11. Di conseguenza, la lunghezza del DNA linker delle matrici 601 è più omogeneo. Ripetute in tandem nucleosome posizionamento DNA è ottenuta mediante gel filtrazione 4,12. Istoni ricombinanti sono purificati da E. coli in condizioni denaturanti 13. L'uso di istoni ricombinanti permette di controllare accuratamente la composizione istone delle matrici nucleosomal. Ad esempio, il nucleo istoni recante specifiche mutazioni 14 o modificazioni post-traslazionali 15,16 può essere sostituito istoni principali wild type.
Esperimenti di velocità di sedimentazione di monitorare il tasso di sedimentazione delle macromolecole in soluzione sotto una forza centrifuga applicata 17. Questo fornisce informazioni circa la dimensione e la forma di macromolecole in un campione. Esperimenti di velocità di sedimentazione sono quindi uno strumento adeguato per lo studio di soluzioni cambiamenti di stato in fibra di cromatinastruttura a causa di condensazione della cromatina 18. Soprattutto, è necessario prima utilizzare gli esperimenti di velocità di sedimentazione come un passo di controllo di qualità in nucleosomal matrice ricostituzione. Se il DNA e nucleosomi non sono combinati al corretto rapporto molare, le matrici possono essere sotto-o sovra-saturo di istoni core. Pertanto, le informazioni ottenute dagli esperimenti di velocità di sedimentazione viene utilizzato per garantire che il DNA sia correttamente saturo di nucleosomi. È importante utilizzare metodi alternativi per stimare la saturazione di DNA con nucleosomi, soprattutto se si lavora con uno stampo di DNA precedentemente uncharacterized. Pertanto, abbiamo anche descritto un metodo per l'analisi di matrici nucleosomal utilizzando microscopia a forza atomica (AFM). AFM è una tecnica potente che permette la visualizzazione degli effetti di una serie di parametri, quali il livello di saturazione, effetto della presenza di varianti dell'istone o gli effetti di MgCl 2 19,20. AFM è stato anche applied a studiare le dinamiche nucleosome utilizzando lasso di tempo di imaging 21. In vitro assemblati nucleosomal array di 12-mer sono particolarmente suscettibili agli studi AFM perché appartengono nell'intervallo giusta dimensione per imaging AFM 22. Nel presente studio abbiamo utilizzato AFM di array nucleosomal come controllo di qualità, nonché un mezzo di confermare i dati di AUC ("vedere per credere"). Oltre alla visualizzazione semplice, AFM permette la misurazione di profili altezza di campioni come metrica supplementare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nucleosomal array modello sono uno strumento molto utile per lo studio in vitro della struttura e funzione della cromatina. Ad esempio, sono stati ampiamente utilizzati per studiare il meccanismo di fibra condensazione della cromatina in soluzione 30-34, e reso possibile ottenere una struttura a raggi X di un Tetranucleosome 35. Più di recente si sono dimostrate utili a decifrare gli effetti strutturali delle varianti specifiche dell'istone nucleo, mutanti e modificazioni post-14…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH sovvenzioni GM45916 e GM66834 di JCH e una borsa di studio dalla Sindrome di Rett Fondazione Internazionale per ak Questo lavoro è stato anche sostenuto da NIH concedere GM088409 e Howard Hughes Medical Institute contributi a KL
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648-100ML | |
| 6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 21-152-5 | |
| HiLoad Superdex 200 16/60 Column | GE | 17-1069-01 | |
| Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator | Sartorius | VS2031 | |
| 12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 08-667A | |
| Illustra Sephacryl S-1000 Superfine | GE | 17-0476-01 | |
| XL-A/I Analytical Ultracentrifuge | Beckman-Coulter |
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