재조합 핵심 히스톤에서 뉴 클레오 배열과 뉴 클레오 솜 위치 DNA의 조립
Summary
방법은 재조합 핵심 히스톤에서 모델 뉴 클레오 어레이의 재구성 및 tandemly 반복 뉴 클레오 솜 위치의 DNA에 표시됩니다. 또한 분석에서 초 원심 침강 속도 실험, 및 원자 힘 현미경 (AFM)을 재구성 후의 뉴 클레오 배열 포화 정도를 모니터링하는 데 사용되는 방법을 설명한다.
Abstract
반복적 DNA 분자를 따라 간격이 핵심 히스톤 octamers는 뉴 클레오 배열이라고합니다. 뉴 클레오 배열은 두 가지 방법 중 하나를 얻을 수있다 : 생체 소스의 정제, 또는 재조합 핵심 히스톤에서 체외에서 재구성 및 tandemly 반복 뉴 클레오 솜 위치의 DNA. 후자의 방법은보다 구조적으로 균일 한 조립 및 정밀 위치 뉴 클레오 배열을 허용하는 이점을 갖고있다. 그들이 원심력 하에서 용액을 통해 이주하는 비율을 분석함으로써 고분자의 크기 및 형상에 대한 분석 초 원심 수율 정보에 침강 속도 실험. 이 기술은, 원자력 현미경과 함께 DNA 템플릿의 대다수는 재구성 후 뉴 클레오로 포화되는 것을 보장하는, 품질 관리에 사용될 수있다. 여기에서 우리는 길이 밀리그램 수량을 재구성 할 필요가 조성이 D 프로토콜을 설명염색질의 구조와 기능의 생화학 및 생물 물리학 연구에 적합한 efined 뉴 클레오 배열.
Introduction
진핵 생물의 게놈은 벌거 벗은 DNA가 존재하지 않고, 압축 및 결합 단백질에 의해 구성됩니다. DNA와 단백질의이 단지는 염색질로 알려져 있습니다. 염색질의 기본 반복 단위는 뉴 클레오입니다. 뉴 클레오 히스톤 옥타 약 1.6 배 1 옥타 머 히스톤 주위에 감싸 인 DNA의 146 개의 염기쌍으로 구성되어 있습니다. 히스톤 옥타는 두 개의 복사본 핵심 히스톤의 H2A, H2B, H3, H4와 각각 구성되어있다. 반복적 DNA 분자를 따라 간격이 핵심 히스톤 octamers는 뉴 클레오 배열이라고합니다. 뉴 클레오 배열의 확장 구조는 구조 "문자열에 구슬"10 나노 섬유 또는로하고, 저 염분의 조건 2에서 체외에 존재하고있다. 10 ㎚ 섬유는 배열 내부 압축 및 / 또는 인터 – 배열 올리고머 (2)를 통해 고차 구조로 집광 할 수있다. 이러한 고차 구조, 염의 존재하에 유발 될 수있다또는 뉴 클레오 배열 3,4에 염색질 건축 단백질의 결합을 통해 영향을받을 수있다. 염색질 압축의 수준은 반비례 생체 5,6의 전사 율과 상관된다. 최근의 연구는 분화, 암 발생 및 기타 7,8 같은 공정에서 게놈의 조직 구조의 중요성을 강조한다. 염색질의 구조와 기능을 연구하는 뉴 클레오 배열의 사용은 널리되고있다. 여기에서 우리는 재조합 핵심 히스톤과 뉴 클레오 솜 위치의 DNA에서 뉴 클레오 배열의 조립하는 방법을 설명합니다.
뉴 클레오 솜 위치 시퀀스의 탠덤 반복으로 재조합 DNA를 사용하여 정기적으로 간격 뉴 클레오를 포함하는 배열을 재구성 할 수 있습니다. 더 인기있는 위치 시퀀스의 두 5S rRNA 유전자 서열과 "601"시퀀스 9,10입니다. (601) 순서는 SELEX 실험 및 MOR에서 파생 된전자 강하게 5S 순서 11 이상의 뉴 클레오을 배치합니다. 따라서, (601) 어레이의 링커 DNA 길이는 더 균일하다. Tandemly 반복 뉴 클레오 솜 위치 DNA는 겔 여과 4,12함으로써 얻어진다. 재조합 히스톤은 E.에서 정제된다 변성 조건 13 세 미만 대장균. 재조합 히스톤의 사용은 하나의 정중 뉴 클레오 배열 히스톤 조성물을 제어 할 수있다. 예를 들어, 코어 (15, 16)은 야생형 코어 히스톤 대체 할 수있는 특정 변이 (14) 또는 번역 후 변형을 담지 히스톤.
침강 속도 실험인가 원심력 17 세 미만 용액에 고분자의 침전 속도를 모니터링 할 수 있습니다. 이것은 샘플에서 거대 분자의 크기와 형태에 대한 정보를 산출한다. 침강 속도 실험 따라서 염색질 섬유 용액 상태의 변경 사항을 공부에 적합한 도구입니다크로 마틴 응축 18에 의한 구조. 중요한 것은 뉴 클레오 배열 재구성의 품질 관리 단계로서 침강 속도 실험을 사용하는 것이 우선 필요하다. DNA와 뉴 클레오는 적절한 몰비 결합하지 않는 경우, 배열 또는 과다 포화 핵심 히스톤있을 수 있습니다. 따라서, 침강 속도 실험으로부터 얻은 정보는 DNA가 적절히 뉴 클레오로 포화되는 것을 보장하기 위해 사용된다. 그것은 이전에 uncharacterized DNA 템플릿 작업 특히, 뉴 클레오와 DNA의 채도를 추정하는 다른 방법을 사용하는 것이 중요합니다. 그러므로, 우리는 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 뉴 클레오 어레이 분석 방법을 설명한다. AFM은 수있는 강력한 기술이다 같은 포화 레벨, 히스톤 변형의 존재의 효과 또는 MgCl2를 19, 20의 효과와 같은 매개 변수의 개수의 효과를 가시화. AFM은 응용하고있다ED는 시간 경과 영상 (21)를 사용하여 뉴 클레오 역학을 연구한다. 시험관들이 AFM 이미징 22 적당한 크기의 범위에 속하기 때문에 뉴 클레오 12 메르 배열 AFM 연구에 특히 의무가 있습니다 조립. 본 연구에서 우리는 품질 관리뿐만 아니라 ( "보는 것이 믿는 것") AUC의 데이터를 긍정하는 수단으로 뉴 클레오 배열의 AFM을 사용했습니다. 간단한 시각화 외에도, AFM은 추가적인 메트릭과 같은 샘플의 높이 프로파일의 측정을 허용한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
모델 뉴 클레오 어레이는 염색질 구조와 기능의 시험 관내 연구에 매우 유용한 도구이다. 예를 들어, 널리 용액 30-34에서 염색질 섬유 축합 메카니즘을 연구하는 데 사용하고, 그것이 가능 tetranucleosome (35)의 x-선 구조를 구하는되었습니다. 최근에 그들은 특정 핵심 히스톤 변형, 돌연변이 전사 후 수정 14-16,36의 구조적 효과를 해독에 유용 입증했다. 여기에서 우리는 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 보조금 GM45916 및 GM66834 JCH 및이 작품을 AK하는 국제 레트 증후군 재단의 화목에 의해 지원되었다는 NIH가 GM088409와 하워드 휴즈 의학 연구소에게 KL 공헌을 부여에 의해 지원되었다
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648-100ML | |
| 6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 21-152-5 | |
| HiLoad Superdex 200 16/60 Column | GE | 17-1069-01 | |
| Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator | Sartorius | VS2031 | |
| 12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 08-667A | |
| Illustra Sephacryl S-1000 Superfine | GE | 17-0476-01 | |
| XL-A/I Analytical Ultracentrifuge | Beckman-Coulter |
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