שיטה מוצגת לכינון מחדש של מערכי nucleosomal מודל מההיסטונים ליבת רקומביננטי ו-DNA מיצוב הנוקלאוזום חוזר tandemly. אנו גם מתארים כיצד ניסויי מהירות שקיעה בultracentrifuge האנליטיות, ומיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) משמשים לניטור לאחר הכינון מחדש את מידת הרוויה מערך nucleosomal.
octamers היסטון ליבה שהם מרווחים שוב ושוב לאורך מולקולת הדנ"א נקרא מערכי nucleosomal. מערכי nucleosomal מתקבלים באחת משתי דרכים: טיהור מin vivo מקורות, או הכינון מחדש במבחנה מההיסטונים ליבת רקומביננטי ו-DNA מיצוב הנוקלאוזום חוזר tandemly. השיטה השנייה יש את היתרון של המאפשר הרכבה של מדים compositionally יותר ומערך nucleosomal ממוקם בדיוק. ניסויי מהירות שקיעה במידע תשואת ultracentrifuge אנליטיים בערך בגודל ובצורה של מקרומולקולות על ידי ניתוח בקצב שבו הם נודדים דרך פתרון מתחת לכוח הצנטריפוגלי. טכניקה זו, יחד עם מיקרוסקופ כוח אטומי, יכולה לשמש לבקרת איכות, על מנת להבטיח כי הרוב המכריע של תבניות DNA רווי בnucleosomes לאחר הכינון מחדש. כאן אנו מתארים את הפרוטוקולים הדרושים כדי לשקם את כמויות מיליגרם של אורך וcompositionally דמערכי nucleosomal efined מתאימים למחקרים ביוכימיים וbiophysical של מבנה הכרומטין ותפקוד.
הגנום אוקריוטים לא קיים DNA עירום כ, אלא הם נדחסו ומאורגנים על ידי חלבונים מאוגדים. מתחמים אלה של ה-DNA וחלבונים ידועים כמו הכרומטין. היחידה החוזרת הבסיסית של הכרומטין היא הנוקלאוזום. הנוקלאוזום מורכב מoctamer היסטון ו146 זוגות בסיסים של DNA העטוף סביב octamer היסטון על פי 1.6 1. Octamer היסטון מורכב משני עותקים כל אחד מH2A ההיסטונים ליבה, H2B, H3 ו-H4. octamers היסטון ליבה שהם מרווחים שוב ושוב לאורך מולקולת הדנ"א נקרא מערכי nucleosomal. המבנה המורחב של מערכי nucleosomal כבר מכונה סיבי 10 ננומטר או "חרוזים על חוט" מבנה ונמצא במבחנה בתנאים דלי מלח 2. סיבי 10 ננומטר הוא מסוגלים עיבוי לתוך מבנים מסדר גבוה יותר באמצעות דחיסה תוך מערך ו / או בין המערך oligomerization 2. יכולים להיגרם מבנים מסדר גבוה יותר אלה בנוכחותם של מלחים,או יכול להיות מושפע באמצעות מחייב של חלבונים אדריכליים הכרומטין למערך nucleosomal 3,4. רמות של דחיסת הכרומטין מתואמות באופן הפוך לשיעור של שעתוק ב5,6 vivo. המחקרים אחרונים מדגיש את החשיבות של הארגון המבני של הגנום בתהליכים כגון בידול, התפתחות הסרטן, ואחרים 7,8. השימוש במערכי nucleosomal ללמוד מבנה הכרומטין ותפקוד הפך נפוצים. כאן אנו מתארים שיטה להרכבה של מערכי nucleosomal מההיסטונים ליבת רקומביננטי ו-DNA מיצוב הנוקלאוזום.
באמצעות DNA רקומביננטי בחוזר טנדם של רצפי מיצוב הנוקלאוזום מאפשר לכינון מחדש של מערכים המכילים nucleosomes במרווח קבוע. שניים מהרצפים יותר הפופולריים המיצוב הם רצף גן 5S rRNA ו9,10 "601" הרצף. רצף 601 נגזר מהניסויים Selex ומורדואר בחריפות עמדות nucleosomes מאשר רצף 5S 11. כתוצאה מכך, אורך ה-DNA מקשר של 601 המערכים הוא הומוגנית יותר. ה-DNA מיצוב הנוקלאוזום חוזר Tandemly מתקבלת על ידי סינון ג'ל 4,12. ההיסטונים רקומביננטי הם מטוהרים מE. coli בתנאי denaturing 13. השימוש של ההיסטונים רקומביננטי מאפשר לשלוט בזהירות את הרכב היסטון של מערכי nucleosomal. לדוגמא, ליבת ההיסטונים נושאות מוטציות ספציפיות 14 או לאחר translational שינויים 15,16 יכול להיות תחליף ההיסטונים ליבה מסוג בר.
ניסויי מהירות שקיעה לפקח על קצב השיקוע של מקרומולקולות בתמיסה תחת כוח הצנטריפוגלי הוחל 17. זה מניב מידע על הגודל וצורה של מקרומולקולות במדגם. ניסויי מהירות שקיעה הם אפוא כלי מתאים לחקר שינויי מדינת פתרון בסיבים הכרומטיןמבנה בשל עיבוי הכרומטין 18. חשוב מכך, יש צורך קודם כל להשתמש בניסויי מהירות שקיעה כצעד בקרת איכות בכינון מחדש מערך nucleosomal. אם ה-DNA וnucleosomes אינם משולבים ביחס טוחנת הראוי, המערכים עשויים להיות מתחת או עם ההיסטונים ליבה מעל הרווי. לפיכך, המידע שנצבר מניסויים מהירות שקיעה משמש כדי להבטיח כי ה-DNA הוא רווי כראוי עם nucleosomes. חשוב להשתמש בשיטות חלופיות כדי להעריך את הרוויה של DNA עם nucleosomes, במיוחד אם עובד עם תבנית ה-DNA uncharacterized בעבר. לכן, אנו גם מתארים שיטה לניתוח של מערכי nucleosomal באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). AFM הוא טכניקה רבת עוצמה המאפשרת הדמיה של ההשפעות של מספר הפרמטרים, כגון הרמה של רוויה, השפעה של הנוכחות של וריאנטים היסטון או את ההשפעות של MgCl 2 19,20. AFM כבר גם appliאד ללמוד דינמיקת הנוקלאוזום באמצעות זמן לשגות הדמיה 21. במבחנה התאסף מערכי 12-mer nucleosomal הם נוחים במיוחד למחקרי AFM בטווח הגודל הנכון עבור ההדמיה AFM 22 כי הם שייכים. במחקר הנוכחי השתמשנו AFM של מערכי nucleosomal כמו בקרת איכות, כמו גם כאמצעי המאשר את הנתונים מAUC ("לראות זה להאמין"). בנוסף להדמיה פשוטה, AFM מאפשר מדידה של פרופילי גובה של דגימות כמדד נוסף.
מערכי nucleosomal מודל הם כלי מאוד שימושי עבור המחקר במבחנה של מבנה הכרומטין ותפקוד. לדוגמא, הם היו בשימוש נרחב כדי ללמוד את המנגנון של עיבוי הכרומטין סיבים בפתרון 30-34, ועשו את זה ניתן להשיג מבנה צילום רנטגן של tetranucleosome 35. לאחרונה הם הוכיחו שימושיים בפענוח ה…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקי GM45916 וGM66834 לJCH ומלגה מהקרן הבינלאומית תסמונת רט לAK עבודה זו נתמכה גם על ידי מענק NIH GM088409 והמכון רפואי הווארד יוז תרומות לKL
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648-100ML | |
6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 21-152-5 | |
HiLoad Superdex 200 16/60 Column | GE | 17-1069-01 | |
Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator | Sartorius | VS2031 | |
12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing | Fisher | 08-667A | |
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine | GE | 17-0476-01 | |
XL-A/I Analytical Ultracentrifuge | Beckman-Coulter |