Montering av Nucleosomal Arrays fra Rekombinant kjerne Histoner og nukleosom Positioning DNA

Summary

En metode er presentert for tilberedning av modell nucleosomal arrays fra rekombinante kjerne histoner og tandem gjentas nukleosom posisjonering DNA. Vi beskriver også hvordan sedimente velocity eksperimenter i den analytiske ultrasentrifuge, og atomic force mikroskopi (AFM) er brukt til å overvåke omfanget av nucleosomal rekke metning etter tilberedning.

Abstract

Kjerne histone octamers som gjentagelser fordelt langs en DNA-molekyl kalles nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays oppnås på én av to måter: rensing fra in vivo-kilder, eller rekonstituering in vitro fra rekombinante kjerne histoner og tandem gjentas nukleosom posisjonering DNA. Den sistnevnte metode har fordelen av å tillate for sammenstilling av en mer ensartet sammensetningsmessig og nøyaktig plassert nucleosomal array. Sedimentehastighetsforsøk i den analytiske ultrasentrifuge utbytte informasjon om størrelsen og formen av makromolekyler ved å analysere den hastigheten som de vandrer gjennom løsningen under sentrifugalkraft. Denne teknikken, sammen med atomic force microscopy, kan anvendes for kvalitetskontroll, noe som sikrer at de fleste DNA-maler er mettet med nucleosomes etter rekonstituering. Her beskriver vi de protokoller som er nødvendige for å rekonstituere milligram mengder lengde og kompositorisk defined nucleosomal arrays egnet for biokjemiske og biofysiske studier av kromatin struktur og funksjon.

Introduction

Eukaryote genomer ikke eksistere som nakent DNA, men i stedet blir komprimert og organisert av bundne proteiner. Disse komplekser av DNA og protein er kjent som kromatin. Den grunnleggende repeterende enhet av kromatin er nucleosome. En nukleosom består av histone octamer og 146 basepar av DNA pakket rundt histone octamer ca 1,6 ganger ^en. Den histone octamer er sammensatt av to eksemplarer hver av kjerne histoner H2A, H2B, H3 og H4. Kjerne histone octamers som gjentagelser fordelt langs en DNA-molekyl kalles nucleosomal arrays. Den utvidede strukturen nucleosomal matriser er blitt referert til som 10 nm fiber eller "perler på en snor"-struktur, og er til stede in vitro ved lave saltforhold ^to. Den 10 nm fiber er i stand til kondensering inn i høyere ordens strukturer gjennom intra-matrisekompaktering og / eller inter-matrise ^{2-oligomerisering.} Disse høyere ordens strukturer kan induseres i nærvær av salter,eller kan påvirkes gjennom binding av kromatin arkitektoniske proteiner til nucleosomal matrise ^3,4. Nivåer av kromatin komprimering er omvendt korrelert med frekvensen av transkripsjon in vivo ^5,6. Nyere forskning fremhever viktigheten av den strukturelle organiseringen av genomet ved prosesser slik som differensiering, kreftutvikling, og andre ^7,8. Bruken av nucleosomal matriser for å studere kromatin struktur og funksjon er blitt utbredt. Her beskriver vi en metode for montering av nucleosomal arrays fra rekombinante kjerne histoner og nukleosom posisjonering DNA.

Ved hjelp av rekombinant DNA med tandem gjentar av nucleosome posisjonering sekvenser åpner for tilberedning av arrays som inneholder regelmessig avstand nucleosomes. To av de mer populære posisjonerings sekvenser er de 5S rRNA gensekvensen og "601"-sekvensen ^9,10. Den 601-sekvensen ble avledet fra SELEX eksperimenter og more sterkt posisjonerer nucleosomes enn 5S sekvens ^11. Følgelig er linker DNA lengden av de 601 rekker mer homogen. Tandem gjentas nukleosom posisjonering DNA oppnås ved gel filtrering ^4,12. Rekombinante histoner er renset fra E. coli henhold denaturing forhold ^13. Bruk av rekombinante histoner gjør det mulig å nøye kontrollere histone sammensetningen av nucleosomal matriser. For eksempel, histoner kjerne som bærer spesifikke mutasjoner ¹⁴ eller post-translasjonelle modifikasjoner ^15,16 kan erstatte vill-type kjerne histoner.

Sedimentehastighetsforsøk overvåke hastigheten av sedimentering av makromolekyler i løsningen under et anvendt sentrifugalkraft ^17.. Dette gir informasjon om størrelsen og formen av makromolekyler i en prøve. Sedimente velocity eksperimenter er dermed et egnet verktøy for å studere løsnings statlige endringer i kromatin fiberstruktur på grunn av kromatin kondens ^18. Viktigere, er det først nødvendig å bruke sedimente velocity eksperimenter som en kvalitetskontroll skritt i nucleosomal rekke tilberedning. Dersom DNA og nucleosomes ikke er kombinert i rett molare forhold, kan oppstillingene være under-eller over-mettet med kjerne histoner. Således blir informasjonen oppnådd fra sedimentehastighetsforsøk benyttes til å sikre at DNA er riktig mettet med nucleosomes. Det er viktig å bruke alternative metoder for å beregne den metning av DNA med nucleosomes, spesielt hvis arbeide med en på forhånd uncharacterized DNA-templat. Derfor har vi også beskrive en metode for analyse av nucleosomal matriser ved hjelp atomic force mikroskopi (AFM). AFM er en kraftfull teknikk som tillater visualisering av virkningene av en rekke parametre, som for eksempel metningsnivået, effekten av tilstedeværelsen av histon-varianter eller virkningene av MgCl ₂ ^19,20. AFM har også vært søkereed å studere nucleosome dynamikken bruke tid lapse bildebehandling ^21. In vitro montert nucleosomal 12-mer arrays er spesielt mottagelig for AFM studier fordi de tilhører i riktig størrelse rekkevidde for AFM bildebehandling ^22. I den foreliggende undersøkelse har vi benyttet AFM av nucleosomal matriser som en kvalitetskontroll, så vel som et middel til å bekrefte dataene fra AUC ("se er å tro"). I tillegg til enkel visualisering, tillater AFM måling av høydeprofiler av prøver som en ekstra beregning.

Protocol

En. Montering av rekombinant Kjerne Histoner inn Octamers Begrunnelse: Det første trinnet i nucleosomal rekke rekonstituering er å forberede innfødte kjerne histone octamers fra frysetørrede rekombinante kjerne histoner. Histonproteinene er kombinert i like molare mengder, og satt sammen til histon octamers ved dialysering av prøvene ut av en denaturerende buffer til refolding buffer. Rens og Lyofiliser rekombinante kjerne histoner (H2A, H2B, H3, H4) som beskrevet 13.</s…

Representative Results

For å illustrere protokollen vi rekonstituerte nucleosomal arrays fra rekombinante Xenopus kjerne histoner og DNA som består av 12 tandem 207 bp gjentakelser av 601 posisjonering sekvens (601 207 x 12). Vi først montert innfødte octamers fra frysetørrede kjerne histoner og deretter renset de octamers etter FPLC hjelp av en S200 kolonne (figur 1A). Større komplekser elueres tidligere fra S200 kolonnen. Histoner generelt elueres i denne rekkefølgen: uspesifikke histone aggregate…

Discussion

Modell nucleosomal arrays er et svært nyttig verktøy for in vitro studie av kromatin struktur og funksjon. For eksempel har de vært mye brukt for å studere mekanismen for kromatin fiber kondensasjon i løsning ^{30 til 34,} og gjorde det mulig å oppnå et røntgenstruktur av et tetranucleosome ^35.. Mer nylig har de vist seg nyttig i å tyde de strukturelle effekter av spesifikke kjerne histone varianter, mutanter og posttranslational modifikasjoner ^14-16,36. Her beskriver vi e…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	A3648-100ML
6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing	Fisher	21-152-5
HiLoad Superdex 200 16/60 Column	GE	17-1069-01
Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator	Sartorius	VS2031
12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing	Fisher	08-667A
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine	GE	17-0476-01
XL-A/I Analytical Ultracentrifuge	Beckman-Coulter