تقنية ميكروفلويديك للتحقيق التشوه خلية
Summary
علينا أن نبرهن على أساس مقايسة على microfluidics لقياس الزمني للخلايا لعبور سلسلة من التشنج ميكرون النطاق.
Abstract
نحن هنا التفاصيل تصميم وتصنيع واستخدام جهاز ميكروفلويديك لتقييم التشوه من عدد كبير من الخلايا الفردية بطريقة فعالة. عادة، يمكن الحصول على البيانات الخاصة ب ~ 10 2 الخلايا داخل تجربة 1 ساعة. يتيح برنامج تحليل الصور آليا بعد تحليل التجربة كفاءة من بيانات الصورة، مما يتيح تجهيز أن يكتمل في غضون ساعات قليلة. هندسة الجهاز لدينا هي فريدة من نوعها في أن الخلايا يجب أن تشوه من خلال سلسلة من التشنج ميكرون النطاق، وبالتالي تمكين تشوه الأولي وتعتمد على الوقت للاسترخاء من الخلايا الفردية أن يعاير. ويتجلى مدى انطباق هذا الأسلوب لاللوكيميا البشري (HL-60) الخلايا. القيادة الخلايا لتشوه من خلال التشنج ميكرون النطاق باستخدام تدفق ضغط يحركها، نلاحظ أن البرولمفوسيت البشري (HL-60) خلايا تسد حظات انقباض الأول لفترة وسيطة من 9.3 ميللي ثانية قبل الركض بسرعة أكبر من خلال انقباض لاحقالأيونات مع الوقت عبور المتوسط من 4.0 ميللي ثانية في انقباض. على النقيض من ذلك، جميع العابر حمض الريتينويك المعالجة (العدلات من نوع) HL-60 خلايا تسد انقباض الأول فقط 4.3 مللي ثانية قبل الركض من خلال التشنج اللاحقة مع الوقت عبور المتوسط من 3.3 ميللي ثانية. هذه الطريقة يمكن توفير نظرة ثاقبة لطبيعة اللزجة من الخلايا، وتكشف في النهاية أصول الجزيئية من هذا السلوك.
Introduction
التغييرات في شكل الخلية هي الحاسمة في السياقات البيولوجية عديدة. على سبيل المثال، كريات الدم الحمراء وكريات الدم البيضاء تشوه من خلال الشعيرات الدموية التي تكون أصغر من قطر الخاصة بهم 1. في ورم خبيث، يجب أن تشوه الخلايا السرطانية من خلال الثغرات الضيقة الخلالي وكذلك الأوعية الدموية متعرج والشبكات اللمفاوية البذور في مواقع الثانوية 2. للتحقيق في السلوك المادي للخلايا فردية، وأجهزة ميكروفلويديك تمثل منصة مثالية التي يمكن تخصيصها لدراسة مجموعة من السلوكيات الخلية بما في ذلك قدرتهم على الهجرة من خلال الثغرات الضيقة 3 وتشوه بشكل سلبي من خلال التشنج ميكرون النطاق 3- 9. Polydimethylsiloxane (PDMS) أجهزة ميكروفلويديك شفافة بصريا، مما التشوهات الخلية المراد تصور باستخدام المجهر الضوئي وتحليلها باستخدام أدوات معالجة الصور الأساسية. وعلاوة على ذلك، صفائف التشنج يمكن تعريفها بدقة، مما يتيح تحليل خلايا متعددة في وقت واحد معالإنتاجية التي تتجاوز العديد من التقنيات القائمة 10،11.
هنا نقدم بروتوكول تجريبي مفصل لبحث التشوه الخلية باستخدام جهاز ميكروفلويديك في "خلية Deformer" PDMS. الجهاز مصمم بحيث خلايا المرور عبر التشنج متتابعة. هذه الهندسة هو شائع في سياقات الفسيولوجية، مثل الشعيرات الرئوية سرير 12. لقياس التشوه خلية، وقت العبور يوفر متري مريحة أن تقاس بسهولة والوقت اللازم للخلية الفردية لعبور خلال 4،6 انقباض واحد. للحفاظ على انخفاض الضغط المستمر عبر قنوات ضيقة أثناء العبور خلية، ونحن نستخدم تدفق ضغط يحركها. ويتضمن بروتوكول لدينا تعليمات مفصلة عن تصميم الجهاز وتصنيع وتشغيل الجهاز عن طريق ضغط يحركها تدفق وإعداد وتصوير من الخلايا، وكذلك معالجة الصور لقياس الوقت للخلايا لتشويه من خلال سلسلة من التشنج. ندرجكلا التصاميم جهاز ورمز معالجة البيانات كملفات رؤية تكميلية. على عينة تمثيلية من البيانات، وتبين لنا خلية العبور مرة من خلال سلسلة من التشنج بوصفها وظيفة من عدد من التشنج passaged. تحليل الجدول الزمني للخلايا لعبور الرغم من التشنج الضيقة للجهاز ميكروفلويديك يمكن أن تكشف عن الاختلافات في التشوه مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا 4،5،13. الجهاز أثبت هنا يستكشف فريد عبور الخلية من خلال سلسلة من التشنج ميكرون الحجم؛ هذا التصميم يحاكي مسار متعرج تلك التجربة الخلايا في الدورة الدموية وتمكن أيضا سبر الخصائص الفيزيائية إضافية من الخلايا مثل وقت الاسترخاء.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا توفير إجراء تجريبي شامل لتحليل تشوه الخلايا تمر عبر قنوات ميكروفلويديك مقيدة باستخدام تدفق ضغط يحركها. وهناك سيناريو MATLAB يمكن معالجة البيانات الآلي (المواد التكميلية). يتم الاحتفاظ نسخة محدثة من قانون ( www.ibp.ucla.edu/research/rowat )….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن نعترف لويد اونغ لإدخال بناء في الإصدارات الأولى من هذه التقنية، والدكتور جيريمي Agresti لغطاء الضغط نصائح التصميم، والدكتور دونغبينغ تشى لمساعدته في افتعال غطاء الضغط. نحن ممتنون للمختبرات M. Teitell وP. Gunaratne لتوفير مجموعة متنوعة من العينات خلية للاختبار. نحن ممتنون لمؤسسة العلوم الوطنية (التوظيف جائزة DBI-1254185)، ومركز جونسون الشامل للسرطان في جامعة كاليفورنيا، وجامعة كاليفورنيا ومعهد العلوم السريرية بالحركة لدعم هذا العمل.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant | Fisher Scientific | 8409400 | Produced by BASF, also available through Sigma |
| PDMS base and crosslinker | Essex Brownell | DC-184-1.1 | Product commonly named Sylgard 184 Elastomer |
| Oxygen plasma discharge unit | Enercon | Dyne-A-Mite 3D Treater | |
| Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Fingertight Ferrule, 1/32" | Upchurch Scientific | UP-F-113 | |
| Fingertight III Fitting, 10-32 | Upchurch Scientific | UP-F-300X | |
| polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm | Valco | TPK.515-25M | |
| polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm | Becton Dickinson | 427406 | |
| Pressure regulator | Airgas or Praxair | ||
| Polyurethane tubing, 5/32” OD | McMaster Carr | 5648K284 | |
| Push-to-connect fittings | McMaster Carr | 5111K91 | |
| Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter | Omega | IP413-020 | |
| 16-bit,250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ | National Instruments | NI PCI 6225-779295-01 | |
| Analog Connector Block-Screw Terminal | National Instruments | SCB-68-776844-01 | |
| LabView System Design Software | National Instruments | ||
| Matlab Software | The MathWorks, Inc. | Matlab R2012a | Code requires the Image Processing Toolbox |
| Shielded Cable | National Instruments | SHC68-68 |
References
- Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung. Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the `seed and soil’ hypothesis revisited. Nature Reviews Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 2 (11-12), 648-658 (2010).
- Hou, H. W., Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Kumar, A. P., Ong, C. N., Lim, C. T. Deformability study of breast cancer cells using microfluidics. Biomedical microdevices. 11 (3), 557-564 (2009).
- Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a chip. 8 (7), 1062-1070 (2008).
- Chen, J., et al. Classification of cell types using a microfluidic device for mechanical and electrical measurement on single cells. Lab on a Chip. 11 (18), 3174 (2011).
- Zheng, Y., Shojaei-Baghini, E., Azad, A., Wang, C., Sun, Y. High-throughput biophysical measurement of human red blood cells. Lab on a Chip. 12 (14), 2560 (2012).
- Zheng, Y., Nguyen, J., Wang, C., Sun, Y. Electrical measurement of red blood cell deformability on a microfluidic device. Lab on a Chip. 13 (16), 3275 (2013).
- Hogg, J. C. Neutrophil kinetics and lung injury. Journal of applied physiology. 67 (4), 1249-1295 (1987).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
- Yap, B., Kamm, R. D. Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow channels. Journal of applied physiology. 99 (6), 2323-2330 (2005).
- Bow, H., et al. A microfabricated deformability-based flow cytometer with application to malaria. Lab on a Chip. 11 (6), 1065-1073 (2011).
- Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. The European Physical Journal Special Topics. 204 (1), 85-101 (2012).
- Doll, J. C., et al. SU-8 force sensing pillar arrays for biological measurements. Lab on a Chip. 9, 1449-1454 (2009).
- Huntington, M. D., Odom, T. W. A Portable, Benchtop Photolithography System Based on a Solid-State Light Source. Small. 7 (22), 3144-3147 (2011).
- Grimes, A., Breslauer, D. N., Long, M., Pegan, J., Lee, L. P., Khine, M. Shrinky-Dink microfluidics: rapid generation of deep and rounded patterns. Lab on a chip. 8 (1), 170-172 (2008).
- Rowat, A. C., Weitz, D. A. Chips & Tips: see where to punch holes easily in a PDMS microfluidic device. Lab on a Chip. 8, 1888-1895 (2008).
- Meyer, P., Kleinschnitz, C. Retinoic Acid Induced Differentiation and Commitment in HL-60 cells. Environmental Health Perspectives. 88, 179-182 (1990).
- Olins, A., Herrmann, H., Lichter, P., Olins, D. E. Retinoic Acid Differentiation of HL-60 Cells Promotes Cytoskeletal Polarization. Experimental Cell Research. 254 (1), 130-142 (2000).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability . Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
- Tsai, M., Waugh, R., Keng, P. Changes in HL-60 cell deformability during differentiation induced by DMSO. Biorheology. 33 (1), 1-15 (1996).
- Rowat, A. C., et al. Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions. Journal of Biological Chemistry. 288 (12), 8610-8618 (2013).
- Lam, W. A., Rosenbluth, M. J., Fletcher, D. A. Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness. Blood. 109 (8), 3505-3508 (2007).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
