Une technique microfluidique à la sonde cellulaire Déformabilité
Summary
Nous démontrons un dosage à base de microfluidique pour mesurer les délais pour les cellules de transiter par une séquence d'étranglements l'échelle du micron.
Abstract
Ici, nous décrivons la conception, la fabrication et l'utilisation d'un dispositif microfluidique pour évaluer l'aptitude à la déformation d'un grand nombre de cellules individuelles d'une manière efficace. Généralement, les données pour ~ 10 2 cellules peuvent être acquises dans le cadre d'une expérience de 1 heure. Un programme d'analyse d'image automatisée permet une analyse efficace post-expérience de données d'image, permettant un traitement pour être terminée en quelques heures. Notre géométrie du dispositif est unique en ce que les cellules doivent se déformer à travers une série de rétrécissements l'échelle du micron, ce qui permet la déformation initiale et la détente en fonction du temps de cellules individuelles à doser. L'applicabilité de cette méthode de leucémie promyélocytaire humaine (HL-60) cellules est démontrée. Cellules conduire à déformer par des constrictions l'échelle du micron en utilisant débit commandé par la pression, nous observons que promyélocytaire humaine (HL-60) cellules occlusion momentanément le premier étranglement pour une durée médiane de 9,3 msec avant repiquage plus rapidement à travers la constriction ultérieureions avec un temps de transit moyen de 4,0 ms par constriction. En revanche, (de type neutrophile) tout-trans rétinoïque traité à l'acide cellules HL-60 occlusion de la première constriction seulement 4,3 msec avant repiquage à travers les étranglements ultérieures avec un temps de transit médian de 3,3 msec. Cette méthode peut donner un aperçu de la nature viscoélastique des cellules, et finalement révéler les origines moléculaires de ce comportement.
Introduction
Les changements dans la forme des cellules sont essentielles dans de nombreux contextes biologiques. Par exemple, les erythrocytes et les leucocytes se déforment à travers des capillaires plus petits que leur diamètre 1. Dans les métastases, les cellules cancéreuses doivent se déformer à travers des espaces interstitiels étroites ainsi que des vaisseaux sinueux et des réseaux lymphatiques pour ensemencer à deux sites secondaires. Pour sonder le comportement physique des cellules individuelles, des dispositifs microfluidiques présentent une plate-forme idéale qui peut être personnalisé pour étudier une gamme de comportements cellulaires, y compris leur capacité à migrer à travers espaces étroits 3 et à déformer passivement à travers les constrictions micrométriques 3- 9. Polydiméthylsiloxane (PDMS) des dispositifs microfluidiques sont optiquement transparent, ce qui permet les déformations de la cellule pour être visualisées par microscopie à la lumière et analysées à l'aide des outils de base de traitement d'image. En outre, les tableaux de rétrécissements peuvent être définis avec précision, permettant l'analyse de plusieurs cellules simultanément avec unedébit qui dépasse de nombreuses techniques existantes 10,11.
Nous présentons ici un protocole expérimental détaillé pour sonder la déformabilité de la cellule en utilisant un dispositif microfluidique la «cellule de Deformer 'PDMS. Le dispositif est conçu de telle sorte que le passage à travers les cellules successives des étranglements; cette géométrie est commun dans les contextes physiologiques, tels que le lit capillaire pulmonaire 12. Pour mesurer la déformabilité de la cellule, le temps de transit fournit une mesure commode qui peut être facilement mesurée par le temps nécessaire à une cellule individuelle de transit à travers une seule de 4,6 constriction. Afin de maintenir une chute de pression constante à travers les canaux rétrécis pendant le transport de cellules, on utilise le débit commandé par la pression. Notre protocole comprend des instructions détaillées sur la conception de l'appareil et la fabrication, le fonctionnement du dispositif de flux, la préparation axée sur la pression et l'imagerie des cellules, ainsi que le traitement d'image pour mesurer le temps pour que les cellules se déforment à travers une série d'étranglements. Nous incluonsdeux modèles d'appareil et le code de traitement des données de vision en tant que fichiers supplémentaires. Comme un échantillon représentatif de données, nous montrons cellule de temps de transit à travers une série d'étranglements en fonction du nombre de constrictions à des passages. Analyse de l'échelle de temps de transit à travers les cellules à des constrictions étroites d'un dispositif microfluidique peut révéler des différences dans la capacité de déformation d'une variété de types de cellules 4,5,13. Le dispositif montré ici recense unique cellule de transit à travers une série de rétrécissements l'échelle du micron; cette conception émule le chemin tortueux que les cellules subissent en circulation et permet également sonder les caractéristiques physiques supplémentaires des cellules telles que les temps de relaxation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici nous fournissons une procédure expérimentale complet d'analyse de la déformation des cellules qui transitent par des canaux microfluidiques constriction en utilisant un écoulement commandé par la pression. Un script MATLAB permet le traitement automatique des données (matériel supplémentaire); une version mise à jour du code est maintenue ( www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). De façon plus générale, les techniques présentées ici peuvent ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Lloyd Ung pour contribuer de façon constructive dans les premières versions de cette technique, le Dr Jeremy Agresti pour obtenir des conseils de conception de chapeau de pression, et le Dr Dongping Qi pour son aide dans la fabrication du bouchon de pression. Nous sommes reconnaissants envers les laboratoires de M. Teitell et P. Gunaratne pour fournir une variété d'échantillons de cellules pour des tests. Nous sommes reconnaissants à la National Science Foundation (CARRIÈRE Prix DBI-1254185), l'UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, et le UCLA clinique et translationnelle Science Institute pour soutenir ce travail.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant | Fisher Scientific | 8409400 | Produced by BASF, also available through Sigma |
| PDMS base and crosslinker | Essex Brownell | DC-184-1.1 | Product commonly named Sylgard 184 Elastomer |
| Oxygen plasma discharge unit | Enercon | Dyne-A-Mite 3D Treater | |
| Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Fingertight Ferrule, 1/32" | Upchurch Scientific | UP-F-113 | |
| Fingertight III Fitting, 10-32 | Upchurch Scientific | UP-F-300X | |
| polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm | Valco | TPK.515-25M | |
| polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm | Becton Dickinson | 427406 | |
| Pressure regulator | Airgas or Praxair | ||
| Polyurethane tubing, 5/32” OD | McMaster Carr | 5648K284 | |
| Push-to-connect fittings | McMaster Carr | 5111K91 | |
| Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter | Omega | IP413-020 | |
| 16-bit,250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ | National Instruments | NI PCI 6225-779295-01 | |
| Analog Connector Block-Screw Terminal | National Instruments | SCB-68-776844-01 | |
| LabView System Design Software | National Instruments | ||
| Matlab Software | The MathWorks, Inc. | Matlab R2012a | Code requires the Image Processing Toolbox |
| Shielded Cable | National Instruments | SHC68-68 |
References
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