Mikroakışkan Tekniği Hücre deformabilitesi Probe
Summary
Bu mikron çaplı daralması bir düzeni sekansından geçerken hücre için gereken süreden daha ölçmek için mikroflüidik bazlı analiz göstermektedir.
Abstract
Burada verimli bir şekilde tek tek hücrelerin çok sayıda deforme değerlendirilmesi için ayrıntılı bir mikroakışkan cihazın tasarımı, imalat, ve Kullanım. Tipik olarak, 10 ~ 2 hücreleri için veriler, 1 saat deney içinde elde edilebilir. Otomatik bir görüntü analiz programı ile birkaç saat içinde tamamlanması için olanak sağlama, görüntü verilerinin etkili deney sonrası analiz sağlar. Bizim cihaz geometri hücreleri böylece, ilk ve tek tek hücrelerin deformasyon zamana bağlı gevşeme denenecek sağlayan mikron çaplı boğumların bir dizi deforme gerekmesi açısından benzersizdir. Insan promiyelositik lösemi (HL-60) hücreleri, bu yöntemin uygulanabilirliği gösterilmiştir. Basınçla çalışan akışı kullanılarak mikron çaplı daralması vasıtasıyla deforme hücrelerin sürüş, insan promiyelositik (HL-60) hücreleri kısa bir süre sonra tazyik boyunca daha hızlı bir şekilde pasaj önce 9.3 msn bir ortalama süre boyunca birinci daralma tıkanmıştır gözlemlemekdaralma başına 4.0 msn medyan transit süre ile iyonları. Tersine, all-trans retinoik asit ile tedavi edilmiş (nötrofil tipi) HL-60 hücreleri 3.3 msn bir ortalama geçiş zamanı ile hemen boğumlar boyunca pasaj önce veya 4.3 ms için birinci daralma tıkamak. Bu yöntem hücrelerin viskoelastik doğası içgörü sağlamak ve sonuçta bu davranışın moleküler kökenlerini ortaya çıkarabilir.
Introduction
Hücre şeklinde değişikliklere çok biyolojik bağlamlarda kritik önem taşımaktadır. Örneğin, eritrositler ve lökositler kendi çapından daha küçük olan 1 kılcal kısımlar boyunca deforme olurlar. Metastaz kanser hücrelerinin ikincil siteler 2 de tohum dar interstisyel boşluklar yanı sıra dolambaçlı damar ve lenfatik ağlar aracılığıyla deforme gerekir. Tek tek hücrelerin fiziksel davranış prob için, mikrofluidik cihazlar yeteneklerine dar boşluklar 3 aracılığıyla göç ve pasif mikron çaplı daralmaları 3 ile 9 deforme dahil hücre davranışları bir dizi çalışma özelleştirilebilir ideal bir platform sunuyoruz. Polidimetilsiloksan (PDMS) mikroakışkan cihazlar, hücre deformasyonlar ışık mikroskobu kullanılarak görüntülendi ve temel görüntü işleme araçları kullanılarak analiz edilmesi sağlanarak, optik şeffaf. Ayrıca, boğumların dizileri tam bir ile eş zamanlı olarak birden fazla hücre analiz sağlayarak, tanımlanabilirBirçok mevcut teknikleri 10,11 aşıyor çıktı.
Burada 'Hücre Deformer' PDMS mikroakışkan cihazı kullanılarak hücre deformablite sondalama için detaylı bir deneysel protokol mevcut. Cihaz tasarlanmış sıralı daralması vasıtasıyla hücreler pasaj şekilde karıştırılır; Bu geometri 12 yatak pulmoner kılcal gibi fizyolojik ortamlarda, yaygındır. Hücre deforme ölçmek için, geçiş zamanı kolaylıkla tek bir daralma 4,6 transit için tek bir hücre için gereken süre olarak ölçülen, uygun bir ölçü sağlar. Hücre taşıma sırasında daralmış kanalları boyunca sabit bir basınç düşüşü korumak için, biz basınç tahrikli akış kullanın. Bizim protokol hücreleri daralmaları bir dizi deforme için zamanı ölçmek için basınç tahrikli akış, hazırlanması ve hücre görüntüleme yanı sıra görüntü işleme ile cihaz tasarımı ve imalatı, cihazın çalışması hakkında detaylı talimatları içerir. Biz dahilCihaz tasarımları ve ek dosyaları gibi görme veri işleme kodu hem de. Verilerin temsil edici bir örneği olarak, pasajlama boğumların sayısının bir fonksiyonu olarak daralması, bir dizi hücre geçiş süresini gösterir. Transit hücreler için zaman çizelgesi analizi bir mikroakışkan cihazın dar büzülmesina hücre tipleri 4,5,13 çeşitli deformabilitesi farklılıkları ortaya olsa. Burada gösterilen cihaz benzersiz mikron çaplı daralmaları bir dizi hücre geçişi araştırmaz; Bu tasarım hücreler dolaşıma deneyim ve aynı zamanda gevşeme zamanı gibi hücrelerin ek fiziksel özelliklerini sondalama sağlayan dolambaçlı bir yol benzetilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada basınç tahrikli akışını kullanarak büzüldü microfluidic kanallardan transit hücrelerinin deformasyonu analiz etmek için kapsamlı bir deneysel prosedür sağlar. MATLAB komut otomatik veri işleme (Ek Malzeme) sağlar; kod güncelleştirilmiş bir sürümü (korunur www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). Daha genel olarak, burada sunulan teknikler sitoskeletal etkisi ve nükleer sertleştirme ajanlan 24,23 hem de kanserli hücre tiple…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu tekniğin erken sürümlerinde yapıcı girişi için Lloyd ung kabul etmek istiyorum, basınç kapağını imalatı yaptığı yardım için basınçlı kap tasarım ipuçları için Dr Jeremy Agresti, ve Dr Dongping Qi. Biz test için hücre örneklerinin çeşitli sağlayan M. Teitell ve P. Gunaratne laboratuvarlarında minnettarız. Biz bu çalışmayı desteklemek için Ulusal Bilim Vakfı (KARİYER Ödül DBI-1.254.185), UCLA Jonsson Kapsamlı Kanser Merkezi'nde ve Klinik UCLA ve Translational Bilim Enstitüsü müteşekkiriz.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant | Fisher Scientific | 8409400 | Produced by BASF, also available through Sigma |
| PDMS base and crosslinker | Essex Brownell | DC-184-1.1 | Product commonly named Sylgard 184 Elastomer |
| Oxygen plasma discharge unit | Enercon | Dyne-A-Mite 3D Treater | |
| Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Fingertight Ferrule, 1/32" | Upchurch Scientific | UP-F-113 | |
| Fingertight III Fitting, 10-32 | Upchurch Scientific | UP-F-300X | |
| polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm | Valco | TPK.515-25M | |
| polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm | Becton Dickinson | 427406 | |
| Pressure regulator | Airgas or Praxair | ||
| Polyurethane tubing, 5/32” OD | McMaster Carr | 5648K284 | |
| Push-to-connect fittings | McMaster Carr | 5111K91 | |
| Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter | Omega | IP413-020 | |
| 16-bit,250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ | National Instruments | NI PCI 6225-779295-01 | |
| Analog Connector Block-Screw Terminal | National Instruments | SCB-68-776844-01 | |
| LabView System Design Software | National Instruments | ||
| Matlab Software | The MathWorks, Inc. | Matlab R2012a | Code requires the Image Processing Toolbox |
| Shielded Cable | National Instruments | SHC68-68 |
References
- Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung. Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the `seed and soil’ hypothesis revisited. Nature Reviews Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 2 (11-12), 648-658 (2010).
- Hou, H. W., Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Kumar, A. P., Ong, C. N., Lim, C. T. Deformability study of breast cancer cells using microfluidics. Biomedical microdevices. 11 (3), 557-564 (2009).
- Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a chip. 8 (7), 1062-1070 (2008).
- Chen, J., et al. Classification of cell types using a microfluidic device for mechanical and electrical measurement on single cells. Lab on a Chip. 11 (18), 3174 (2011).
- Zheng, Y., Shojaei-Baghini, E., Azad, A., Wang, C., Sun, Y. High-throughput biophysical measurement of human red blood cells. Lab on a Chip. 12 (14), 2560 (2012).
- Zheng, Y., Nguyen, J., Wang, C., Sun, Y. Electrical measurement of red blood cell deformability on a microfluidic device. Lab on a Chip. 13 (16), 3275 (2013).
- Hogg, J. C. Neutrophil kinetics and lung injury. Journal of applied physiology. 67 (4), 1249-1295 (1987).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
- Yap, B., Kamm, R. D. Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow channels. Journal of applied physiology. 99 (6), 2323-2330 (2005).
- Bow, H., et al. A microfabricated deformability-based flow cytometer with application to malaria. Lab on a Chip. 11 (6), 1065-1073 (2011).
- Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. The European Physical Journal Special Topics. 204 (1), 85-101 (2012).
- Doll, J. C., et al. SU-8 force sensing pillar arrays for biological measurements. Lab on a Chip. 9, 1449-1454 (2009).
- Huntington, M. D., Odom, T. W. A Portable, Benchtop Photolithography System Based on a Solid-State Light Source. Small. 7 (22), 3144-3147 (2011).
- Grimes, A., Breslauer, D. N., Long, M., Pegan, J., Lee, L. P., Khine, M. Shrinky-Dink microfluidics: rapid generation of deep and rounded patterns. Lab on a chip. 8 (1), 170-172 (2008).
- Rowat, A. C., Weitz, D. A. Chips & Tips: see where to punch holes easily in a PDMS microfluidic device. Lab on a Chip. 8, 1888-1895 (2008).
- Meyer, P., Kleinschnitz, C. Retinoic Acid Induced Differentiation and Commitment in HL-60 cells. Environmental Health Perspectives. 88, 179-182 (1990).
- Olins, A., Herrmann, H., Lichter, P., Olins, D. E. Retinoic Acid Differentiation of HL-60 Cells Promotes Cytoskeletal Polarization. Experimental Cell Research. 254 (1), 130-142 (2000).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability . Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
- Tsai, M., Waugh, R., Keng, P. Changes in HL-60 cell deformability during differentiation induced by DMSO. Biorheology. 33 (1), 1-15 (1996).
- Rowat, A. C., et al. Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions. Journal of Biological Chemistry. 288 (12), 8610-8618 (2013).
- Lam, W. A., Rosenbluth, M. J., Fletcher, D. A. Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness. Blood. 109 (8), 3505-3508 (2007).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
