Микрожидкостных Техника для исследования клеток деформируемости
Summary
Мы демонстрируют Microfluidics основе анализа измерить временные рамки для клеток к транзиту через последовательность микронного масштаба перетяжек.
Abstract
Здесь мы подробно на проектирование, изготовление и использование микрофлюидном устройства для оценки деформируемости большого количества отдельных клеток в эффективным образом. Как правило, данные за ~ 10 2 клеток могут быть приобретены в рамках эксперимента на 1 час. Автоматизированная программа анализа изображения позволяет проводить эффективный анализ после эксперимента данных изображения, что позволяет обработку на полноту в течение нескольких часов. Наша геометрии устройство уникально тем, что клетки должны деформироваться через серию микронного масштаба сужений, тем самым позволяя начальная деформация и зависит от времени релаксации отдельных клеток, которые будут проанализированы. Применимость этого метода к человеческой промиелоцитарного лейкоза (HL-60) клеток демонстрируется. Вождение клетки деформироваться через микронного масштаба перетяжек с использованием потока давления приводом, заметим, что человек промиелоцитарного (HL-60) клетки моментально закрывают первую сужение для средней продолжительностью 9,3 мс до пассажей быстрее через последующей сужаютионы с медианой времени пролета 4,0 мс в сужении. В отличие от этого, полностью транс-ретиноевой кислоты, обработанных (нейтрофилов-тип) HL-60 клетки закрывают первую сужение для всего 4,3 мс, прежде чем пассирования через последующие сужений со средним временем пролета 3,3 мсек. Этот метод может дать представление о вязкоупругой природы клеток, и в конечном итоге выявить молекулярные истоки такого поведения.
Introduction
Изменения формы клеток имеют решающее значение в многочисленных биологических контекстах. Например, эритроциты и лейкоциты деформации через капилляры, которые меньше, чем их собственный диаметром 1. В метастазов, раковые клетки должны деформироваться в узких интерстициальных пробелов, а также извилистый сосудистой и лимфатической сетей, чтобы отобрать в средних сайтов 2. Чтобы исследовать физическое поведение отдельных клеток, микрофлюидных устройства представляют собой идеальную платформу, которую можно настроить для изучения ряд клеточных поведения в том числе их способности мигрировать через узкие щели 3 и пассивно деформироваться через микронного масштаба перетяжек 3- 9. Полидиметилсилоксан (PDMS) микрофлюидных устройства оптически прозрачны, что позволяет клеточные деформации быть визуализированы с помощью световой микроскопии и проанализированы с помощью базовых инструментов обработки изображений. Кроме того, массивы перетяжек может быть точно определены, что позволяет анализ нескольких ячеек одновременно спропускная что превосходит многие существующие методы 10,11.
Здесь мы представляем подробный экспериментальный протокол для зондирования клеток деформируемость используя микрожидкостных устройств 'Сотовый Deformer' PDMS. Устройство предназначено так, чтобы клетки проход через последовательных сужений; Эта геометрия является общей в физиологических условиях, таких как легочный капиллярный слой 12. Чтобы оценить клеточный деформируемость, время прохождения обеспечивает удобный метрику, который легко измерить как время, необходимое для отдельной клетки транзита через одну сужения 4,6. Для поддержания постоянной перепад давления на суженных каналов во время транспортировки клеток, мы используем поток давления приводом. Наш протокол содержит подробные инструкции по конструкции прибора и изготовления, эксплуатации устройства от давления приводом потока, подготовки и визуализации клеток, а также обработки изображений для измерения времени для клетки деформироваться через серию перетяжек. Мы включаемоба проекта устройств и код обработки данных видение в качестве вспомогательных файлов. В репрезентативной выборке данных, мы показываем время сотовый транзитный через серию перетяжек в зависимости от количества перетяжек пассированными. Анализ временных сроков для клеток к транзита хотя узкие перетяжки из микрофлюидном устройства может выявить различия в деформируемости различных типов клеток 4,5,13. Устройство показали, здесь однозначно обследует транзитной камере через серию микронного масштаба сужений; Этот дизайн эмулирует извилистый путь, что клетки испытать в обращении, а также позволяет зондирования дополнительные физические характеристики клеток, таких как время релаксации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы предлагаем комплексную экспериментальную процедуру для анализа деформации клеток транзитом через суженные микроканалов используя поток давления приводом. Сценарий MATLAB позволяет автоматизированную обработку данных (дополнительного материала); Обновленная версия кода подд…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить признательность Ллойд Унг для конструктивный вклад в ранних версиях этой техники, доктор Джереми Агрести для капитализации давление советы дизайна, и д-р Dongping Ци за помощь в изготовлении герметичную крышку. Мы благодарны лабораториях М. Teitell и П. Gunaratne для предоставления разнообразных клеточных образцов для тестирования. Мы благодарны поддержке Национального научного фонда (КАРЬЕРА Award DBI-1254185), в UCLA Jonsson Всесторонний Онкологический центр, и UCLA клинической и поступательной науке Института за поддержку этой работы.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant | Fisher Scientific | 8409400 | Produced by BASF, also available through Sigma |
| PDMS base and crosslinker | Essex Brownell | DC-184-1.1 | Product commonly named Sylgard 184 Elastomer |
| Oxygen plasma discharge unit | Enercon | Dyne-A-Mite 3D Treater | |
| Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Fingertight Ferrule, 1/32" | Upchurch Scientific | UP-F-113 | |
| Fingertight III Fitting, 10-32 | Upchurch Scientific | UP-F-300X | |
| polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm | Valco | TPK.515-25M | |
| polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm | Becton Dickinson | 427406 | |
| Pressure regulator | Airgas or Praxair | ||
| Polyurethane tubing, 5/32” OD | McMaster Carr | 5648K284 | |
| Push-to-connect fittings | McMaster Carr | 5111K91 | |
| Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter | Omega | IP413-020 | |
| 16-bit,250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ | National Instruments | NI PCI 6225-779295-01 | |
| Analog Connector Block-Screw Terminal | National Instruments | SCB-68-776844-01 | |
| LabView System Design Software | National Instruments | ||
| Matlab Software | The MathWorks, Inc. | Matlab R2012a | Code requires the Image Processing Toolbox |
| Shielded Cable | National Instruments | SHC68-68 |
References
- Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung. Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the `seed and soil’ hypothesis revisited. Nature Reviews Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 2 (11-12), 648-658 (2010).
- Hou, H. W., Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Kumar, A. P., Ong, C. N., Lim, C. T. Deformability study of breast cancer cells using microfluidics. Biomedical microdevices. 11 (3), 557-564 (2009).
- Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a chip. 8 (7), 1062-1070 (2008).
- Chen, J., et al. Classification of cell types using a microfluidic device for mechanical and electrical measurement on single cells. Lab on a Chip. 11 (18), 3174 (2011).
- Zheng, Y., Shojaei-Baghini, E., Azad, A., Wang, C., Sun, Y. High-throughput biophysical measurement of human red blood cells. Lab on a Chip. 12 (14), 2560 (2012).
- Zheng, Y., Nguyen, J., Wang, C., Sun, Y. Electrical measurement of red blood cell deformability on a microfluidic device. Lab on a Chip. 13 (16), 3275 (2013).
- Hogg, J. C. Neutrophil kinetics and lung injury. Journal of applied physiology. 67 (4), 1249-1295 (1987).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
- Yap, B., Kamm, R. D. Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow channels. Journal of applied physiology. 99 (6), 2323-2330 (2005).
- Bow, H., et al. A microfabricated deformability-based flow cytometer with application to malaria. Lab on a Chip. 11 (6), 1065-1073 (2011).
- Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. The European Physical Journal Special Topics. 204 (1), 85-101 (2012).
- Doll, J. C., et al. SU-8 force sensing pillar arrays for biological measurements. Lab on a Chip. 9, 1449-1454 (2009).
- Huntington, M. D., Odom, T. W. A Portable, Benchtop Photolithography System Based on a Solid-State Light Source. Small. 7 (22), 3144-3147 (2011).
- Grimes, A., Breslauer, D. N., Long, M., Pegan, J., Lee, L. P., Khine, M. Shrinky-Dink microfluidics: rapid generation of deep and rounded patterns. Lab on a chip. 8 (1), 170-172 (2008).
- Rowat, A. C., Weitz, D. A. Chips & Tips: see where to punch holes easily in a PDMS microfluidic device. Lab on a Chip. 8, 1888-1895 (2008).
- Meyer, P., Kleinschnitz, C. Retinoic Acid Induced Differentiation and Commitment in HL-60 cells. Environmental Health Perspectives. 88, 179-182 (1990).
- Olins, A., Herrmann, H., Lichter, P., Olins, D. E. Retinoic Acid Differentiation of HL-60 Cells Promotes Cytoskeletal Polarization. Experimental Cell Research. 254 (1), 130-142 (2000).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability . Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
- Tsai, M., Waugh, R., Keng, P. Changes in HL-60 cell deformability during differentiation induced by DMSO. Biorheology. 33 (1), 1-15 (1996).
- Rowat, A. C., et al. Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions. Journal of Biological Chemistry. 288 (12), 8610-8618 (2013).
- Lam, W. A., Rosenbluth, M. J., Fletcher, D. A. Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness. Blood. 109 (8), 3505-3508 (2007).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
