Een Microfluïdische Techniek om Cell Vervormbaarheid Probe
Summary
We demonstreren een-microfluidics gebaseerde test om de termijn voor de cellen om de doorvoer te meten door middel van een opeenvolging van micron-schaal vernauwingen.
Abstract
Hier hebben gedetailleerd ontwerp, fabricage en het gebruik van een microfluïdische apparaat om de vervormbaarheid van een groot aantal afzonderlijke cellen te evalueren op een efficiënte wijze. Meestal kan gegevens ~ 10 2 cellen verkregen bij een experiment 1 uur. Een geautomatiseerde beeldanalyse programma maakt efficiënte post-experiment analyse van beeldgegevens, zodat verwerking voltooid binnen enkele uren is. De geometrie inrichting is uniek in die cellen moeten vervormen door een reeks van micron-schaal vernauwingen, waardoor het mogelijk de initiële vervorming en tijd-afhankelijke relaxatie van individuele cellen te testen. De toepasbaarheid van deze methode op menselijke promyelocytische leukemie (HL-60) cellen aangetoond. Rijden cellen vervormen door micronschaal vernauwingen behulp drukgedreven flow, zien we dat de mens promyelocytaire (HL-60) cellen tijdelijk af te sluiten de eerste vernauwing voor een mediane tijd van 9,3 msec voordat sneller passage door de daaropvolgende vernauwenionen met een mediane transittijd van 4,0 msec per vernauwing. Daarentegen, all-trans retinoic zuur behandelde (neutrofiel-type) HL-60 cellen occluderen de eerste vernauwing slechts 4,3 msec voor passage door de daaropvolgende vernauwingen met een gemiddelde looptijd van 3,3 msec. Deze methode kan inzicht verschaffen in de visco-elastische aard van de cellen, en uiteindelijk onthullen de moleculaire oorsprong van dit gedrag.
Introduction
Veranderingen in de cel vorm zijn van cruciaal belang in tal van biologische contexten. Bijvoorbeeld, erytrocyten en leukocyten vervormen door capillairen die kleiner zijn dan hun eigen diameter 1. In metastase, moeten kankercellen vervormen door smalle spleten interstitiële alsook kronkelige vaten en lymfatische netwerken om zaad op secundaire locaties 2. Om het fysieke gedrag van individuele cellen te onderzoeken, microfluïdische apparaten presenteren een ideaal platform dat kan worden aangepast aan een reeks van cel gedrag met inbegrip van hun vermogen om te migreren door smalle openingen 3 en passief vervormen door micronschaal vernauwingen 3 9 bestuderen. Polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluïdische apparaten zijn optisch transparant, waardoor cel vervormingen worden gevisualiseerd met behulp van een lichtmicroscoop en het gebruik van de basisfuncties voor beeldbewerking gereedschap geanalyseerd. Bovendien kunnen reeksen van vernauwingen nauwkeurig worden ingesteld, zodat de analyse van meerdere cellen tegelijk metthroughput dat veel bestaande technieken 10,11 overschrijdt.
Hier presenteren we een gedetailleerde experimentele protocol voor het sonderen cel vervormbaarheid met behulp van de 'Cell Deformer' PDMS microfluïdische apparaat. De inrichting is zo ontworpen dat cellen passage door opeenvolgende vernauwingen; deze geometrie is gebruikelijk in fysiologische context, zoals de pulmonaire capillaire bed 12. Naar cel vervormbaarheid peilen, transittijd biedt een handige metric die gemakkelijk wordt gemeten als de tijd die nodig is voor een individuele cel voor doorvoer door een enkele vernauwing 4,6. Om een constante drukval over de vernauwde kanalen tijdens cel doorgang te behouden, maken we gebruik van drukgedreven flow. Onze protocol bevat gedetailleerde instructies apparaat ontwerp en fabricage, werking van het apparaat door druk aangedreven stroming, voorbereiding en beeldvorming van cellen, alsook beeldverwerking van de tijd gedurende cellen vervormen door een reeks insnoeringen meten. Wij zijn onder anderezowel apparaat ontwerpen en visie gegevensverwerking code als aanvullende bestanden. Als representatieve steekproef van gegevens, tonen wij cel reistijd door een reeks insnoeringen in functie van het aantal vernauwingen gepasseerd. Analyse van de tijdschaal cellen voor doorvoer hoewel smalle vernauwingen van een microfluïdische inrichting kan verschillen in vervormbaarheid van verschillende celtypen 4,5,13 onthullen. Het apparaat hier gedemonstreerd unieke enquêtes cel doorvoer door een reeks van micron-schaal vernauwingen; dit ontwerp emuleert het kronkelige pad dat cellen ervaren in circulatie en maakt ook vervolma fysieke kenmerken van de cellen zoals relaxatietijd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier bieden we een uitgebreide experimentele procedure voor het analyseren van de vervorming van de cellen op doorreis in ingesnoerd microfluïdische kanalen met behulp van druk-driven flow. Een MATLAB script maakt geautomatiseerde gegevensverwerking (Aanvullend materiaal); een bijgewerkte versie van de code wordt gehandhaafd ( www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). Meer algemeen kan de hier gepresenteerde technieken worden aangepast in vele cellen gebaseerde ass…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Lloyd Ung erkennen voor constructieve inbreng in de eerste versies van deze techniek, Dr Jeremy Agresti voor druk cap design tips, en Dr Dongping Qi voor zijn hulp bij het fabriceren van de druk cap. We zijn dankbaar voor de laboratoria van M. Teitell en P. Gunaratne voor het verstrekken van een verscheidenheid aan mobiele monsters voor het testen. We zijn dankbaar voor de National Science Foundation (Career Award DBI-1254185), de UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, en de UCLA Clinical and Translational Science Institute voor de ondersteuning van dit werk.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant | Fisher Scientific | 8409400 | Produced by BASF, also available through Sigma |
| PDMS base and crosslinker | Essex Brownell | DC-184-1.1 | Product commonly named Sylgard 184 Elastomer |
| Oxygen plasma discharge unit | Enercon | Dyne-A-Mite 3D Treater | |
| Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Fingertight Ferrule, 1/32" | Upchurch Scientific | UP-F-113 | |
| Fingertight III Fitting, 10-32 | Upchurch Scientific | UP-F-300X | |
| polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm | Valco | TPK.515-25M | |
| polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm | Becton Dickinson | 427406 | |
| Pressure regulator | Airgas or Praxair | ||
| Polyurethane tubing, 5/32” OD | McMaster Carr | 5648K284 | |
| Push-to-connect fittings | McMaster Carr | 5111K91 | |
| Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter | Omega | IP413-020 | |
| 16-bit,250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ | National Instruments | NI PCI 6225-779295-01 | |
| Analog Connector Block-Screw Terminal | National Instruments | SCB-68-776844-01 | |
| LabView System Design Software | National Instruments | ||
| Matlab Software | The MathWorks, Inc. | Matlab R2012a | Code requires the Image Processing Toolbox |
| Shielded Cable | National Instruments | SHC68-68 |
References
- Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung. Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the `seed and soil’ hypothesis revisited. Nature Reviews Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 2 (11-12), 648-658 (2010).
- Hou, H. W., Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Kumar, A. P., Ong, C. N., Lim, C. T. Deformability study of breast cancer cells using microfluidics. Biomedical microdevices. 11 (3), 557-564 (2009).
- Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a chip. 8 (7), 1062-1070 (2008).
- Chen, J., et al. Classification of cell types using a microfluidic device for mechanical and electrical measurement on single cells. Lab on a Chip. 11 (18), 3174 (2011).
- Zheng, Y., Shojaei-Baghini, E., Azad, A., Wang, C., Sun, Y. High-throughput biophysical measurement of human red blood cells. Lab on a Chip. 12 (14), 2560 (2012).
- Zheng, Y., Nguyen, J., Wang, C., Sun, Y. Electrical measurement of red blood cell deformability on a microfluidic device. Lab on a Chip. 13 (16), 3275 (2013).
- Hogg, J. C. Neutrophil kinetics and lung injury. Journal of applied physiology. 67 (4), 1249-1295 (1987).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
- Yap, B., Kamm, R. D. Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow channels. Journal of applied physiology. 99 (6), 2323-2330 (2005).
- Bow, H., et al. A microfabricated deformability-based flow cytometer with application to malaria. Lab on a Chip. 11 (6), 1065-1073 (2011).
- Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. The European Physical Journal Special Topics. 204 (1), 85-101 (2012).
- Doll, J. C., et al. SU-8 force sensing pillar arrays for biological measurements. Lab on a Chip. 9, 1449-1454 (2009).
- Huntington, M. D., Odom, T. W. A Portable, Benchtop Photolithography System Based on a Solid-State Light Source. Small. 7 (22), 3144-3147 (2011).
- Grimes, A., Breslauer, D. N., Long, M., Pegan, J., Lee, L. P., Khine, M. Shrinky-Dink microfluidics: rapid generation of deep and rounded patterns. Lab on a chip. 8 (1), 170-172 (2008).
- Rowat, A. C., Weitz, D. A. Chips & Tips: see where to punch holes easily in a PDMS microfluidic device. Lab on a Chip. 8, 1888-1895 (2008).
- Meyer, P., Kleinschnitz, C. Retinoic Acid Induced Differentiation and Commitment in HL-60 cells. Environmental Health Perspectives. 88, 179-182 (1990).
- Olins, A., Herrmann, H., Lichter, P., Olins, D. E. Retinoic Acid Differentiation of HL-60 Cells Promotes Cytoskeletal Polarization. Experimental Cell Research. 254 (1), 130-142 (2000).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability . Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
- Tsai, M., Waugh, R., Keng, P. Changes in HL-60 cell deformability during differentiation induced by DMSO. Biorheology. 33 (1), 1-15 (1996).
- Rowat, A. C., et al. Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions. Journal of Biological Chemistry. 288 (12), 8610-8618 (2013).
- Lam, W. A., Rosenbluth, M. J., Fletcher, D. A. Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness. Blood. 109 (8), 3505-3508 (2007).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
