Summary

Ein Mikrofluidiktechnik to Cell Verformbarkeit Sonde

Published: September 03, 2014
doi:

Summary

Wir zeigen eine Mikrofluidik-basierten Assay, um die Zeitskala für Zellen für den Transit durch eine Sequenz von Mikrometermaßstab Verengungen zu messen.

Abstract

Hier werden wir ausführlich die Konstruktion, Herstellung und Verwendung von Mikrofluid-Vorrichtung, um die Verformbarkeit der eine große Anzahl von einzelnen Zellen in einer effizienten Weise zu bewerten. Typischerweise können Daten für ~ 10 2 Zellen in einem 1 h Experiment gewonnen werden. Ein automatisiertes Bildanalyseprogramm ermöglicht die effiziente Post Experiment Analyse von Bilddaten, so dass die Verarbeitung innerhalb weniger Stunden zu sein. Unsere Vorrichtung Geometrie ist einzigartig, da Zellen müssen durch eine Reihe von Mikrometermaßstab Einschnürungen zu verformen, wodurch die anfängliche Verformung und zeitabhängige Relaxation von einzelnen Zellen, die untersucht werden. Die Anwendbarkeit dieses Verfahrens auf die menschliche promyelozytische Leukämie (HL-60-Zellen) nachgewiesen wird. Fahren Zellen durch Mikrometermaßstab Verengungen mit druckgetriebenen Strömung verformen, beobachten wir, dass die menschliche Promyelozyten (HL-60-Zellen) kurzzeitig verschließen die erste Engstelle für eine mittlere Zeit von 9,3 ms vor schneller Passage durch die nachfolgenden constrictIonen mit einer mittleren Laufzeit von 4,0 ms pro Verengung. Dagegen all-trans-Retinsäure-behandelten (Neutrophile-Typ) HL-60-Zellen zu verschließen, die erste Einschnürung für nur 4,3 ms vor Passage durch die nachfolgenden Einschnürungen mit einer mittleren Durchgangszeit von 3,3 msec. Diese Methode kann Einblick in die viskoelastischen Eigenschaften von Zellen zu schaffen, und schließlich zeigen die molekularen Ursachen für dieses Verhalten.

Introduction

Veränderungen in der Zellform kritisch in zahlreichen biologischen Kontext. Beispielsweise Erythrozyten und Leukozyten zu verformen durch die Kapillaren, die kleiner ist als ihre eigenen Durchmesser 1 sind. Bei der Metastasierung, müssen Krebszellen durch die engen Zwischenräume sowie gewundenen Gefäßsystem und lymphatischen Netze zu verformen, um an sekundären Standorten 2 Samen. Um das physikalische Verhalten einzelner Zellen zu untersuchen, präsentieren mikrofluidischen Systemen eine ideale Plattform, die individuell auf eine Reihe von Zellverhalten einschließlich ihrer Fähigkeit, durch enge Spalte 3 zu migrieren und zu passiv durch Mikrometermaßstab Verengungen 3 9 verformen studieren. Polydimethylsiloxan (PDMS) Mikrofluidik-Vorrichtungen optisch transparent sind, so dass Zellverformungen mittels Lichtmikroskopie sichtbar gemacht und unter Verwendung von Bildverarbeitungshilfsmittel analysiert werden. Darüber hinaus können Anordnungen von Verengungen genau definiert werden, wodurch Analyse von mehreren Zellen gleichzeitig mit einerDurch dass viele bestehende Techniken 10,11 übersteigt.

Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Versuchsprotokoll zur Sondierung Zelle Verformbarkeit mit der "Handy-Deformer" PDMS mikrofluidischen Vorrichtung. Die Vorrichtung ist so ausgelegt, dass die Zellen durch sequentielle Passage Einschnürungen; Diese Geometrie ist in physiologischen Zusammenhängen, wie beispielsweise Lungen Kapillarbett 12 gemeinsam. Um die Zell Verformbarkeit messen, bietet Laufzeit eine bequeme Metrik, die leicht als die Zeit für eine individuelle Zelle dazu, durch eine einzige Engstelle 4,6 erforderlich ist, gemessen. Um einen konstanten Druckabfall über die verengten Kanäle während der Zell Transit zu gewährleisten, verwenden wir druckgetriebenen Strömung. Unser Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zur Einrichtung Konstruktion und Herstellung, Betrieb der Vorrichtung durch Druck angetriebenen Strömungs, Aufbereitung und Darstellung von Zellen, als auch die Bildverarbeitung, um die Zeit für Zellen, die durch eine Reihe von Verengungen verformen messen. Wir sindbeide Geräteausführungen und Vision der Datenverarbeitung als Zusatzcode-Dateien. Als ein repräsentatives Beispiel von Daten, zeigen wir Zelldurchgangszeit durch eine Reihe von Verengungen in Abhängigkeit von der Anzahl der Einschnürungen agiert. Analyse der Zeitskala für Zellen Transit wenn schmale Verengungen einer mikrofluidischen Vorrichtung kann Unterschiede in der Verformbarkeit von einer Vielzahl von Zelltypen 4,5,13 offenbaren. Die hier gezeigte Gerät eindeutig blickt Zelle Transit durch eine Reihe von Mikrometermaßstab Einschnürungen; Dieses Design emuliert den gewundenen Weg, die Zellen zu erleben im Umlauf und ermöglicht auch zusätzliche Sondierung physikalischen Eigenschaften der Zellen, wie zB Entspannungszeit.

Protocol

1. Mikrofluidik-Geräte-Design- HINWEIS: Das Gerätedesign hat vier grundlegende Funktionsbereiche: Eingangsöffnung, Zellenfilter, Verengung Array und Austrittsöffnung (Abbildung 1). Der Gesamtaufbau kann auf eine Vielzahl von Zelltypen angewendet werden, mit geringfügigen Anpassungen Dimensionen. Hier vorgesehen sind ein paar grundlegende Gestaltungsempfehlungen zusammen mit Geräteparameter, die wirksam für eine Auswahl von primären und immortalisierten Zellen sind. </p…

Representative Results

Um die Verformbarkeit der verschiedenen Zelltypen, Menschen myeloischen Leukämie-Zellen (HL-60), differenziert neutrophilen Zellen, Maus-Lymphozyten-Zellen und menschlichen Eierstockkrebszelllinien (OVCAR8, HEYA8) untersuchen werden mit der "Handy-Deformer" Mikrofluidik-Technik ausgewertet. Repräsentative Ergebnisse für die Laufzeit des HL-60 und Neutrophilen-Typ HL-60-Zellen zeigen den Zeitplan für eine einzelne Zelle dazu, durch eine Reihe von Engstellen, wie in Abbildung 6 dargestellt. …

Discussion

Hier bieten wir eine umfassende experimentelle Verfahren zur Analyse der Verformung von Zellen im Transit durch schnürt mikrofluidischen Kanälen mit druckgetriebenen Strömung. Ein MATLAB-Skript ermöglicht die automatisierte Datenverarbeitung (ergänzendes Material); eine aktualisierte Version des Codes eingehalten wird ( www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). Im weiteren Sinne können die hier vorgestellten Techniken in vielen Zellbasis mikrofluidischen Tests…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren bedanken sich bei Lloyd Ung für konstruktiven Input in frühen Versionen dieser Technik anerkennen, Dr. Jeremy Agresti für Druckdeckel Design-Tipps und Dr. Dongping Qi für seine Hilfe bei der Herstellung der Druckkappe. Wir sind dankbar, dass die Labors von M. und P. Teitell Gunaratne für die Bereitstellung einer Vielzahl von Zellproben zum Testen. Wir danken der National Science Foundation (Career Award DBI-1254185), der UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center und der UCLA klinische und translationale Wissenschaft Institut für die Unterstützung dieser Arbeit.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant  Fisher Scientific  8409400 Produced by BASF, also available through Sigma
PDMS base and crosslinker Essex Brownell DC-184-1.1 Product commonly named Sylgard 184 Elastomer
Oxygen plasma discharge unit Enercon Dyne-A-Mite 3D Treater
Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) Ted Pella, Inc. 15072
Fingertight Ferrule, 1/32" Upchurch Scientific UP-F-113
Fingertight III Fitting, 10-32 Upchurch Scientific UP-F-300X
polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm Valco TPK.515-25M
polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm Becton Dickinson 427406
Pressure regulator Airgas or Praxair
Polyurethane tubing, 5/32” OD McMaster Carr 5648K284
Push-to-connect fittings McMaster Carr 5111K91
Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter Omega IP413-020
16-bit,250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ National Instruments NI PCI 6225-779295-01
Analog Connector Block-Screw Terminal National Instruments SCB-68-776844-01
LabView System Design Software National Instruments
Matlab Software The MathWorks, Inc. Matlab R2012a Code requires the Image Processing Toolbox
Shielded Cable National Instruments SHC68-68

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Citer Cet Article
Hoelzle, D. J., Varghese, B. A., Chan, C. K., Rowat, A. C. A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability. J. Vis. Exp. (91), e51474, doi:10.3791/51474 (2014).

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