A técnica de microfluídica para sondar Deformabilidade celular
Summary
Nós demonstramos um ensaio baseado em microfluídica para medir a escala de tempo para que as células de trânsito através de uma seqüência de constrições em escala mícron.
Abstract
Aqui nós detalhe do desenho, fabrico e utilização de um dispositivo de microfluidos para avaliar a capacidade de deformação de um grande número de células individuais de uma maneira eficiente. Tipicamente, os dados de 10 ~ 2 células pode ser adquirida num experimento 1 hr. Um programa automatizado de análise de imagem permite que a análise pós-experimento eficiente de dados de imagem, permitindo o processamento a ser completa dentro de algumas horas. Nossa geometria do dispositivo é único na medida em que as células têm de se deformar através de uma série de constrições escala mícron, permitindo assim a deformação inicial e dependente do tempo de relaxamento de células individuais a serem ensaiadas. A aplicabilidade deste método para leucemia promielocítica humana (HL-60) células é demonstrada. Células Conduzindo a deformar através constrições micro-escala, utilizando fluxo orientado a pressão, observamos que promielocítica humana (HL-60) células ocluir momentaneamente a primeira constrição por um período médio de 9,3 ms antes passaging mais rapidamente através da constrição posterioríons com um tempo de trânsito médio de 4,0 ms por constrição. Por outro lado, todo-trans-retinóico tratadas com ácido (tipo neutrófilos) células HL-60 ocluir a primeira constrição para apenas 4,3 ms antes passaging através das constrições subsequentes com um tempo de trânsito mediana de 3,3 ms. Este método pode fornecer insights sobre a natureza viscoelástica de células e, finalmente, revelar as origens moleculares desse comportamento.
Introduction
Alterações na forma de células são críticas em muitos contextos biológicos. Por exemplo, hemácias e leucócitos deformar através dos capilares, que são menores do que seu próprio diâmetro 1. Em metástase, as células cancerosas deve deformar-se através de aberturas estreitas intersticiais, bem como vasos tortuosos e redes linfáticos para semear em sites secundários 2. Para investigar o comportamento físico das células individuais, dispositivos microfluídicos apresentar uma plataforma ideal que pode ser personalizado para estudar uma série de comportamentos de células, incluindo a sua capacidade de migrar através de aberturas estreitas 3 e deformar passivamente através constrições em escala mícron 3- 9. PDMS (polidimetilsiloxano) dispositivos microfluídicos são opticamente transparentes, permitindo deformações celulares para ser visualizado através de microscopia de luz e analisados utilizando ferramentas básicas de processamento de imagem. Além disso, as matrizes de constrições pode ser definido com precisão, permitindo a análise de várias células simultaneamente com umrendimento que excede muitas técnicas existentes 10,11.
Aqui apresentamos um protocolo experimental detalhado para deformabilidade celular usando o dispositivo micro 'celular Deformer' PDMS sondagem. O dispositivo é projetado de modo que as células passagem por constrições seqüenciais; esta geometria é comum em contextos fisiológicos, tais como o leito capilar pulmonar 12. Para medir a capacidade de deformação das células, tempo de trânsito fornece uma métrica conveniente que seja facilmente medido, como o tempo necessário para uma célula individual de trânsito através de uma única 4,6 constrição. Para manter uma queda de pressão constante através dos canais de constrição durante o trânsito celular, usamos o fluxo orientado a pressão. Nosso protocolo inclui instruções detalhadas sobre o desenho e fabricação do dispositivo, a operação do dispositivo accionado por pressão de fluxo, e a preparação de células de imagiologia, assim como o processamento de imagens para medir o tempo para as células para se deformar através de uma série de constrições. Nós incluímosambos os projetos de dispositivos e código de processamento de dados como arquivos de visão suplementar. Como um exemplo representativo de dados, que mostra o tempo de trânsito das células através de uma série de constrições como uma função do número de constrições subculturas. Análise da escala de tempo para que as células de trânsito que constrições estreitas de um dispositivo de microfluidos pode revelar as diferenças na capacidade de deformação de uma variedade de tipos de células 4,5,13. O dispositivo demonstrado aqui examina exclusivamente trânsito célula através de uma série de constrições escala mícron; este projeto emula o caminho tortuoso que as células experiência em circulação e também permite sondar características físicas adicionais de células, tais como tempo de relaxamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui nós fornecemos um procedimento experimental abrangente para analisar a deformação das células que transitam através dos canais microfluídicos constricted usando fluxo orientado a pressão. Um script MATLAB permite o processamento automático de dados (Material complementar); uma versão atualizada do código é mantida ( www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). Mais amplamente, as técnicas aqui apresentadas podem ser adaptadas em muitos ensaios microflu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer Lloyd Ung para entrada construtiva nas primeiras versões dessa técnica, o Dr. Jeremy Agresti para dicas de design da tampa de pressão, e Dr. Dongping Qi por sua ajuda na fabricação da tampa de pressão. Somos gratos aos laboratórios de M. Teitell e P. Gunaratne para fornecer uma variedade de amostras de células para testes. Somos gratos à Fundação Nacional de Ciências (Prémio Carreira DBI-1254185), o Comprehensive Cancer Center da UCLA Jonsson, ea UCLA Clinical and Translational Science Institute para apoiar este trabalho.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant | Fisher Scientific | 8409400 | Produced by BASF, also available through Sigma |
| PDMS base and crosslinker | Essex Brownell | DC-184-1.1 | Product commonly named Sylgard 184 Elastomer |
| Oxygen plasma discharge unit | Enercon | Dyne-A-Mite 3D Treater | |
| Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Fingertight Ferrule, 1/32" | Upchurch Scientific | UP-F-113 | |
| Fingertight III Fitting, 10-32 | Upchurch Scientific | UP-F-300X | |
| polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm | Valco | TPK.515-25M | |
| polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm | Becton Dickinson | 427406 | |
| Pressure regulator | Airgas or Praxair | ||
| Polyurethane tubing, 5/32” OD | McMaster Carr | 5648K284 | |
| Push-to-connect fittings | McMaster Carr | 5111K91 | |
| Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter | Omega | IP413-020 | |
| 16-bit,250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ | National Instruments | NI PCI 6225-779295-01 | |
| Analog Connector Block-Screw Terminal | National Instruments | SCB-68-776844-01 | |
| LabView System Design Software | National Instruments | ||
| Matlab Software | The MathWorks, Inc. | Matlab R2012a | Code requires the Image Processing Toolbox |
| Shielded Cable | National Instruments | SHC68-68 |
References
- Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung. Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the `seed and soil’ hypothesis revisited. Nature Reviews Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 2 (11-12), 648-658 (2010).
- Hou, H. W., Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Kumar, A. P., Ong, C. N., Lim, C. T. Deformability study of breast cancer cells using microfluidics. Biomedical microdevices. 11 (3), 557-564 (2009).
- Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a chip. 8 (7), 1062-1070 (2008).
- Chen, J., et al. Classification of cell types using a microfluidic device for mechanical and electrical measurement on single cells. Lab on a Chip. 11 (18), 3174 (2011).
- Zheng, Y., Shojaei-Baghini, E., Azad, A., Wang, C., Sun, Y. High-throughput biophysical measurement of human red blood cells. Lab on a Chip. 12 (14), 2560 (2012).
- Zheng, Y., Nguyen, J., Wang, C., Sun, Y. Electrical measurement of red blood cell deformability on a microfluidic device. Lab on a Chip. 13 (16), 3275 (2013).
- Hogg, J. C. Neutrophil kinetics and lung injury. Journal of applied physiology. 67 (4), 1249-1295 (1987).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
- Yap, B., Kamm, R. D. Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow channels. Journal of applied physiology. 99 (6), 2323-2330 (2005).
- Bow, H., et al. A microfabricated deformability-based flow cytometer with application to malaria. Lab on a Chip. 11 (6), 1065-1073 (2011).
- Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. The European Physical Journal Special Topics. 204 (1), 85-101 (2012).
- Doll, J. C., et al. SU-8 force sensing pillar arrays for biological measurements. Lab on a Chip. 9, 1449-1454 (2009).
- Huntington, M. D., Odom, T. W. A Portable, Benchtop Photolithography System Based on a Solid-State Light Source. Small. 7 (22), 3144-3147 (2011).
- Grimes, A., Breslauer, D. N., Long, M., Pegan, J., Lee, L. P., Khine, M. Shrinky-Dink microfluidics: rapid generation of deep and rounded patterns. Lab on a chip. 8 (1), 170-172 (2008).
- Rowat, A. C., Weitz, D. A. Chips & Tips: see where to punch holes easily in a PDMS microfluidic device. Lab on a Chip. 8, 1888-1895 (2008).
- Meyer, P., Kleinschnitz, C. Retinoic Acid Induced Differentiation and Commitment in HL-60 cells. Environmental Health Perspectives. 88, 179-182 (1990).
- Olins, A., Herrmann, H., Lichter, P., Olins, D. E. Retinoic Acid Differentiation of HL-60 Cells Promotes Cytoskeletal Polarization. Experimental Cell Research. 254 (1), 130-142 (2000).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability . Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
- Tsai, M., Waugh, R., Keng, P. Changes in HL-60 cell deformability during differentiation induced by DMSO. Biorheology. 33 (1), 1-15 (1996).
- Rowat, A. C., et al. Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions. Journal of Biological Chemistry. 288 (12), 8610-8618 (2013).
- Lam, W. A., Rosenbluth, M. J., Fletcher, D. A. Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness. Blood. 109 (8), 3505-3508 (2007).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
