Summary
공 초점 현미경에 의해 포식 누룩 곰팡이 포자의 성장을 제어하는 절연 쥐 폐포 대식 세포의 능력을 평가하는 방법.
Abstract
폐는 숙주 세포가 정기적으로 미생물 및 미생물 제품에 노출되는 인터페이스입니다. 폐포 대 식세포는 흡입 버섯 및 기타 미생물 처음 나올 줄 식세포의 세포입니다. 대 식세포 등 면역 세포는 병원체 인식 수용체에 의해 아스 페르 길 루스 모티브를 인식하고 다운 스트림 염증 반응을 시작합니다. 식세포의 NADPH 산화 효소는 활성 산소 중간체 (로아)을 생성 및 호스트 방어에 중요합니다. NADPH 산화 효소가 중요하지만 호중구 매개 숙주 방어 - 1 (3), 대 식세포의 NADPH 산화 효소의 중요성은 잘 정의되어 있지 않습니다. 이 연구의 목적은 A.에 대한 숙주 방어를 매개로 대 식세포의 NADPH 산화 효소의 특정 역할을 묘사했다 미가 투스. 우리는 폐포 대 식세포에서 NADPH 산화 효소가 포식 A.의 성장을 제어하는 것을 발견 미가 투스 4 포자. 여기서, 우리는 마우스의 능력을 평가하는 방법을 서술포식 누룩 곰팡이 포자 (분 생자)의 성장을 제어하기 lveolar 식세포 (AMS). 폐포 대식 세포는 생체 내에서 스테인드 및 10 일 후 기관지 폐포 세척액 (BAL)에 의해 생쥐에서 격리됩니다. 대 식세포는 유리 커버 슬립에 도금되어, 다음 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현 A.을 시드 미가 투스 포자. 지정된 시간에, 세포를 고정 및 포식 포자 그대로 식세포의 수는 공 초점 현미경에 의해 평가된다.
Introduction
폐포 대 식세포는 흡입 미생물 처음 나올 줄 식세포의 세포입니다. 대 식세포는 병원체 인식 수용체에 의해 아스 페르 길 루스 모티브를 인식 섭취 및 흡입 포자 (분생 포자)의 성장을 제한하고 염증 반응을 시작합니다. 식세포의 NADPH 산화 효소는 슈퍼 옥사이드 음이온 및 다운 스트림 활성 산소 중간체 (로아)에 산소 분자를 변환합니다. 만성 육아 종성 질환 (CGD)는 심각한 세균 및 곰팡이 감염에 의해 과도한 염증 반응이 특징 NADPH 산화 효소의 유전 질환이다.
NADPH 산화 효소가 중요하지만 호중구 매개 숙주 방어 - 1 (3), 대 식세포의 NADPH 산화 효소의 중요성은 잘 정의되어 있지 않습니다. 이전 연구는 호중구가 주로 균사의 단계 5를 대상으로하는 반면 폐포 대 식세포가 섭취 및 아스 페르 길 루스 포자를 죽이는 것으로 나타났습니다. 그러나, 충돌 resul가 있었다A.의 성장을 억제하는 대 식세포의 NADPH 산화 효소의 역할에 같은 TS 미가 투스는 6, 7, 포자.
이 방법의 목적은 A.에 대한 숙주 방어를 매개로 대 식세포의 NADPH 산화 효소의 특정 역할을 묘사했다 미가 투스 포자. 우리는 폐포 대 식세포에서 NADPH 산화 효소가 포식 A.의 성장을 제어하는 것을 발견 미가 투스 4 포자. 가장 밀접하게 흡입 곰팡이에 대한 호스트 응답을 모델링하기 위해, 우리는 비자극 마우스에서 바로 희생 다음과 같은 기관지 세척하여 수확 폐포 대 식세포를 사용했습니다. 고립 된 폐포 대 식세포의 사용은 생체 내에서 아스 페르 길 루스에 대한 방어 다른 면역 세포 (예를 들어, 모집 호중구)의 부재에 자신의 항진균 활성에 초점을 할 수있었습니다. 이 방법에서는, 폐포 대 식세포가 수확 후 조작의 양을 최소화하기 위해 수확 전에 생체 내에서 염색 하였다. </ P>
이 프로토콜의 또 다른 장점은 GFP-발현 A.의 사용이다 미가 투스의 변형. 이 균류는 균사의 단계를 통해 포자 단계에서 GFP를 표현하고 추가 염색에 대한 필요가 없습니다. 더 상세한 이미지를 얻으려면, 우리는 얻은 이미지로부터 3 차원 구조의 재구성을 가능하게 공 초점 현미경을 선택했다. 입체 재건 균사가 대 식세포 또는 통해 주위에 성장보다는 구별 할 수있는 기능을 제공합니다. 분생 포자는 세포 대 세포로 정확하게 구별 할 수 있습니다.
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Protocol
이 연구에서 동물에 수행 된 모든 절차는 로스웰 파크 암 연구소의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 연방의 모든 상태, 준수, 보건 규정의 국립 연구소했다.
1. 생체 내 대 식세포 라벨링
참고 : PHK26은 (IV) 정맥 투여시 혈액 순환 및 조직에 모두 식세포에 의해 흡수 될 친 유성 염료입니다. PKH26는 대식구의 수확 후 조작의 양을 최소화하는 생체 표지에 사용 하였다. PKH-26은 안정적으로 장기간에 걸쳐 폐포 대 식세포의 축적의 장점이 있습니다. 십일 투여 후 기다리는 PKH26 8, 9 만 폐포 대 식세포 안정적으로 레이블을 떠나 순환의 모든 레이블 세포의 정리를 할 수 있습니다. PKH26는 여기 (551 NM) 및 방출 (567 nm의) 특성 호환이 빨간색 형광 색소입니다로다 민 또는 피코 에리 트린 탐지 시스템과. 모든 라벨 절차는 생존 능력의 손실을 포함, 유물을 소개 할 수있다. 우리는 다른 마우스 유전자형에서 대 식세포의 표시에 대해 동일한 방법을 사용하기 때문에, (예를 들어, WT 대 NADPH 산화 효소 결핍),이 유물의 효과가 균일하다.
- PKH26의 원액 (에탄올에 1 × 10 -3 M) 제조업체에서 제공하는 희석제 C에서 1:5 희석.
- 각 마우스의 1 / 2 ml의 인슐린 주사기 (29 G x 1 / 2 ")에 희석 PKH26의 부하 100 μL.
- 수확하기 최소 10 일 전에 정맥 주사 (꼬리 정맥 또는 복고풍 궤도 중 하나)에 의해 마우스로 관리 할 수 있습니다.
폐포 2. 수확 폐포 대 식세포 (BAL)
실험에 사용하는 마우스의 수는 달라질 수있다. 비자극 마우스로부터 전형적인 수율은 3-5 × 105 폐포의 대 식세포의 범위이고, 그러나이 숫자는 BAS 크게 달라질 수이러한 세척을 수행하는 사람의 마우스, 경험의 크기 및 세척액과 폐로부터 회수 볼륨 instillations의 수와 같은 요인에 ED. 이 프로토콜에서 폐 세척을 반복 1 ㎖의 lavages와 함께 세포 수율을 향상하는 데 도움이 폐쇄 흉강으로 수행된다.
- 멸균 용액을 유지하기 위해 무균 조건을 사용 AVERTIN 마취제 치사량 (12.5 mg)을 복강 내 (IP)을 투여하여 마우스를 안락사.
- 70 % 에탄올로 철저하게 마우스 스프레이.
- 흉부 (그림 1A)를 노출 동물의 두개골 끝으로부터 피부를 제거합니다.
- 다만 다이어프램 아래 피부에 작은 상처를 확인합니다.
- 컷에 손가락을 삽입하고 멀리 동물 (그림 1A)의 두개골 끝에서 피부를 잡아 당깁니다.
- 목의 복부 측면 (그림 1A)를 확장, 머리에 약간 밀어.
- 흉곽을 통해 작은 구멍을 잘라흉부의 오른쪽에 폐를 수축하고 또한 다음 단계에서 폐의 시각화를 허용합니다.
- 기관을 찾아 조심스럽게 주위 조직을 멀리 해부하다.
- 곡선 집게로 침샘, sternohyoid 근육과 후두 등을 제거합니다.
- 조심스럽게 곡선 집게로 들어 올려 가위로 기본 고리 연골 구조를 드러내기도 (외막)를 덮고있는 얇은 조직을 절개.
- 기관에 카테터를 삽입합니다.
- 곡선 집게를 사용하여 기관 (에 지느러미) 뒤에 봉합을 배치하고 개방을 통해 10 cm 길이를 당깁니다.
- 윤상 (연골의 농축 링) 위에 시작하는 것은 신중 기관은 흉골 뒤에 사라지는 중지 기관의 아래 22 G 카테터를 안내합니다.
- 단단히 아늑한 적합을위한 기관 및 카테터 주위 봉합을 묶어. 카테터에서 바늘을 제거합니다.
- 4 방향 코크를 조립합니다.
- 기입하나 6 ㎖를 DPBS, 1 % FBS 주사기와 그림 (b)에 나타낸 바와 같이 4 방향 꼭지에 연결합니다.
- 4 방향 꼭지 (그림 1B)에 표시된 위치에 빈 6 ML의 주사기를 연결합니다.
- 카테터에 4 방향 꼭지 (그림 1B)에 열린 포트를 연결합니다. 기관에서 도관을 제거하지 않도록주의하십시오.
- 폐에서 세척 유체를 수집합니다.
참고 : 수사는 조직 손상의 가능성을 최소화하기 위해 세척 유체의 하부 볼륨을 사용하도록 선택할 수있다. 그것은 동일한 방식 일관 모든 마우스 그룹에 적용하는 것이 중요하다.- 그래서 빈 주사기가 닫혀 꼭지의 핸들을 돌려 천천히 폐를 팽창시키는 ~ 1 ㎖의 DPBS, 1 % FBS를 주입. 2.4 단계에있는 구멍 컷을 통해 폐의 팽창을 준수하십시오.
- 폐를 overinflate하지 않도록주의하십시오.
- 전체 주사기를 닫을 수 있도록 마개의 핸들을 돌려 조심스럽게 독감 철회 폐의 ID입니다.
- 폐 단계 1.4의 홀 가공을 통해 폐의 관찰합니다. 카테터는 좋은 무승부를 얻기 위해 약간 앞뒤로 이동해야 할 수 있습니다. 기관 내에서 카테터를 유지하기 위해 특별한 예방 조치를 취할.
- 반복 FBS 1 %를 주입하고 폐 단종 된 모든 DPBS까지 2.8.1-2.8.4 5 배의 단계를 반복합니다. 참고 : 폐 유체의 복구가 주입 액의 100 %되지 않습니다.
- 50 ML 원뿔 튜브에 세척 유체 빈 주사기. 상온에서 전지를 보관하십시오.
- 실온에서 5 분 300 XG에 원심 분리하여 펠렛은 세포 상층 액을 붓는다. 원하는 경우에 사이토 카인 분석을 위해 저장 될 수 있습니다.
- 10 % FBS와 1 ~ 5 ㎖의 RPMI 1640 세포를 재현 탁하고 혈구를 계산합니다. 비자극 마우스에서는 BAL 의해 수확 된 세포의> 95 %는 세포 검사에 의해 확인 될 수있는 대 식세포가 될 것으로 예상된다.
3. 배양 및 수확 버섯
">이 프로토콜에 사용되는 아스 페르 길 루스 푸 미가 투스의 수명주기의 모든 단계에 걸쳐 GFP를 표현 :. 포자, germlings 및 균사이 곰팡이 균주 박사 마고 무어, 사이먼 프레이저 대학, 버나비, BC, 캐나다에 의해 제공되었다.- 클로람페니콜 (0.05 g / L) 및 겐타 마이신 (0.5 g / L)와 기울기 한천 사부로 뇌 심장 주입 (BHI)에 GFP를 표현 아스 페르 길 루스 푸 미가 투스 균주의 플레이트 생포.
- 느슨하게 실온에서 7~10일에 덮인 어둠 속에서 품어.
- DPBS 0.01 % 트윈 20 10 ㎖로 세척 경사에 의해 수확 생포. 살짝 느슨하게 stripette와 곰팡이를 다 쳤어요. 수율을 높이기 위해 경사를 여러 번 씻어.
- 50 ML 원뿔에 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 포자 현탁액을 전달합니다.
- 10 분 동안 400 XG에서 원심 분리하여 펠렛의 생포.
- 을 Resuspend 50 ㎖의 DPBS에서 생포 및 혈구를 사용하여 계산합니다.
- DPBS로 두 번 세척하고 원하는 집중 한에 희석록해.
4. 곰팡이 도전과 공 초점 현미경
숙주 방어 식세포 NADPH 산화 효소의 역할을 조사하기 위해, 포식 누룩 곰팡이 포자의 성장을 제어하기위한 세 가지 유전자형 생쥐로부터 격리 폐포 대 식세포의 능력을 평가 하였다. 이 연구에 사용 된 유전자형은 다음과 같습니다; 자연적으로 발생하는 Ncf1 돌연변이 (Ncf1 그들에게 NADPH 산화 효소의 결핍을 떠나 P47의 phox, 식세포의 NADPH 산화 효소의 필수 구성 요소)에 대한 인코딩, 3) Ncf1 * / 1) 야생형 마우스, 2) Ncf1 * / * MN-마우스 * + Mn이 형질 전환 마우스 NADPH 옥시 다제 활성은 단핵구 / 대 식세포 인구 (10, 11)에서 재구성 된 (MN은 인간 CD68 프로모터의 제어하에 야생형 Ncf1 은닉 유전자를 나타낸다.)
공 초점 현미경은 최고의 인해 존재로이 분석에 적합그리고 슬라이드에 비 포식 분생 포자의 성장. 공 초점 현미경은 Z 축 내 개인 비행기의 시각화를 허용하고, 대식 세포 내부보다는 주위에 성장하는 곰팡이 사이에 차별화를 가능하게 할 것이다. 모든 공 촛점 이미지는 63X 기름 침지 렌즈를 사용하여 획득된다. Z-스택은 2.5의 전자 줌 배율로 획득됩니다. Z-스택의 두께는, 필드의 상단 및 하단을 찾을 DAPI 및 명 시야 이미지를 사용하여 결정된다. Z-스택은 ~ 1 μm의 두께 (14)로부터 개별 조각 24 μm의였다. 대식 세포의 정량, 1X 전자 줌의 단일 스캔은 유전자형 당 10 필드를 수행 하였다. 본래 식세포 각각 PKH26 및 멤브레인과 핵의 DAPI 염색에 근거 확인되었다. 분생 포자는 FITC 표현과 시야 이미지를 기반으로 확인되었다.
- 불임의 coverslips와 접시를 준비합니다
- 생물 안전 캐비닛에서 70 % 에타의 22 X 22mm 유리 커버 슬립을 흡수5 ~ 10 분 동안 L.
- 멸균 PBS에 커버 슬립을 씻어.
- 멸균 집게를 사용하여 부드럽게 멸균 단독으로 포장 된 6 - 웰 플레이트의 각 웰의 바닥에 하나의 커버 슬립을 배치합니다.
- 씨 ~ 1 × 10 6 PKH26 각 커버 슬립에 폐포 RPMI 1640 300 μL에 현탁 식세포, 10 % FBS를 표시 수확. 정확한 수는 수확 수율에 따라 달라질 수 있습니다.
- 대식 세포는 밤새 5 % CO 2와 37 ° C에서 배양하여 부착 할 수 있습니다.
- 다음 날 아침, ~ 1 × 10 7 GFP - 표현 A.에게 추가 미가 투스의 포자는 100 ㎕의 예열 (37 ℃) RPMI 1640, 10 % FBS에서 일시 중단.
- 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에 플레이트를 반환합니다.
- 세포를 4 ℃의 실온에서 하룻밤 2 시간의 최소 고정되어야한다 같은 각각 2 %, 포름 알데히드의 양 아니라 (최종 농도 1 %의 포름 알데히드)을 추가하여 3, 7, 14 시간 수정 세포에서. 장소 플레이트4 ° C 하룻밤에 이른 시점. 최종 시점 (14 시간)의 경우, 실온에서 2 시간 동안 세포를 고정한다.
- 고정 후, 부드럽게 집게를 사용하여 커버 슬립을 제거하고 DPBS에 헹군다.
- 접힌 킴 와이프에 커버 슬립의 가장자리를 배치하여 여분의 액체를 제거합니다.
- 유리 현미경 슬라이드에 DAPI와 6 μL 형광 설치 매체를 적용합니다.
- 슬라이드 커버 슬립 중 하나 가장자리를 놓고 부드럽게 장착 매체로 아래로 셀 측에 놓습니다. 매체를 장착하면 확산 커버 슬립 아래도 층을 형성 할 것이다. 커버 슬립에 누를 필요가 없습니다.
- 명확한 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉하고 공기 건조 할 수 있습니다.
- 상점은 공 초점 현미경으로 분석 할 준비가 될 때까지 실온에서 (빛으로부터 보호) 슬라이드 상자에 슬라이드를 준비했다.
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Representative Results
비자극 생쥐에서 BAL에 의해 폐포 대 식세포를 수집하는 것은 세포 검사를 기반으로> 95 % 순수한 인구가 발생합니다. 3과 7 시간 (그림 2) 시점은 곰팡이 성장의 균사 무대 앞에와 유전자형 사이에서 분생 포자의 식세포의 효율성 비교를 할 수 있습니다. 유전자형이 조직 침습 균사 스테이지 포식 분생 포자의 전이 (도 3)를 억제하는 능력에 대하여 비교 될 수있는 14 시간 시점이다. 본래 식세포는 각각 막과 핵 PKH26 및 DAPI 염색 (도 2 및도 3)에 기초하여 공 초점 현미경에 의해 식별 될 수있다. 분생 포자와 균사는 GFP 표현 (그림 2와 3)에 따라 식별됩니다.
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그림 1. 해부 방향 참조 및 4 방향 조절판.) 마우스에 대한 해부학 적 방향 참조가 표시됩니다. 꼬리는 꼬리의 방향에있는 동안은 뇌, 머리의 방향이다. 등쪽이 확대 또는 동물. B)의 상면 4 방향 스톱 콕은 세 루어 연결부를 가지며 핸들을 향하면서 사족의 복부 측면은 배꼽 또는 동물의 하부면을 향 회전 360 ° 마개를 통해 유체의 흐름을합니다. 빈 주사기, 전체 주사기와 카테터의 위치가 표시됩니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
A. 그림 2. 식균 작용 미가 투스 포자는 12 시간을 연속적으로 유전자형 사이에 유사하다. (A) 야생형, (B) Ncf1 * / * Mn이 +, 및 (C, 포식 분생 포자의 성장을 제한하는 NADPH 옥시 다제 활성을 가진 절연 폐포 대 식세포의 기능을 평가하기 위해 ) Ncf1 * / * 망간 - 마우스는 정맥 PKH26을 투여 하였다. 폐포 대 식세포 10 일 후 BAL에 의해 수확 GFP - 표현 A의 분생 포자와 씨앗을 품고 있었다 미가 투스. 세포는 3, 7에 고정하고, 14 시간 분생 첨가 한 후 하였다. 3에서 (데이터가 표시되지 않음) 7 시간 총 대식 세포의 수와 대식 세포 ≥ 1 모두 비슷한 식균 작용의 효율성을 반영, 세 가지 유전자형 사이에 유사했다 분생 포자 (화살표) 포식. 그대로 식세포는 PKH26 (빨강) 및 DAPI 막 (블루) 염색을 기준으로 식별됩니다각각 차 핵. 하나의 Z-평면에서 형광 이미지는 시야의 이미지와 겹쳐있다. 시야 이미지는 전체 표본을 통해 투과 된 광으로 구성되어 있으며 형광 Z-일반에 overlain 그래서 전체 Z-스택 내에서 세포와 분생 포자의 시각화를 할 수 있습니다. 스케일 바, 19 μm의는. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3. 식세포 NADPH 옥시 다제는 A.의 성장을 제어 할 필요 . (A, D)의 미가 투스 포자 공 초점 현미경 야생 형, (B, E) Ncf1 * / * 망간 +, 및 (C, F) Ncf1 * / * 망간 - < GFP + A로 파종 후 14 시간에서 / SUP> 폐포 대 식세포 미가 투스 생포. 그대로 대식 세포는 각각 PKH26 (빨강) 및 DAPI 세포막과 핵 (파란색) 염색을 기반으로 식별됩니다. 실선 화살표는 적어도 하나의 포식 분생 포자와 빈 화살표는 균사를 가리와 그대로 식세포를 보여줍니다. 적어도 1 다수의 AMS는 포자는 야생형 및 Ncf1 * / * 망간 + 세포를 관찰 포식 있지만 NADPH 산화 효소가 결핍 된 세포. 균사의 GFP 신호가 변수 전체 Z-스택 내에서 세포의 시각화 및 균사를 활성화 시야 이미지와 하나의 Z-평면에서. AC) 형광 이미지를 나타내는 Z-스택 이미지의 평면을 기준으로했다. DF) 형광 이미지 하나의 Z-평면에서 밝은 필드 배경없이 세포의 식별을 가능하게하지만 다른 Z-평면 셀과 곰팡이의 공간 관계. 스케일 바, 19 μm의..jove.com/files/ftp_upload/51678/51678fig3highres.jpg "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
함께 생체 진균 챌린지와 대 식세포의 항균 활성의 생체 외 분석을 위해 이러한 접근법을 사용하여, 우리는 이전 식세포의 NADPH 산화 효소는 A. 방어에서 중요한 역할을한다는 것을 입증 미가 투스 4. 고립 된 폐포 대 식세포의 사용은 생체 내에서 아스 페르 길 루스에 대한 방어 다른 면역 세포 (예를 들어, 호중구 모집)의 부재에서 자신의 항진균 활성에 초점을 우리를 할 수 있습니다.
다양한 시각화 전략은 생체 내 및 생체 외 (ex vivo)에서 대식구 항진균 활성을 평가하는데 사용되었다. 루터 등., 인간의 (폐 이식 환자에서 수확) 및 마우스 AMS (12) 아스 페르 길 루스 포자의 식균 작용을 연구하기 위해 공 초점 현미경을 사용했다. Geunes - 보이어 등. 식균 작용 다음 칸디다 크루 세이와 쥐의 대 식세포 사이의 상호 작용을 특징으로한다. 그들대식 세포주, RAW264.7 및 복막 13 차 대식 세포를 사용했습니다. 가르시아 - 로다 등. 계면 활성제 단백질-D가 결합하여 크립토 콕 쿠스 네오 포르 만 스 (14)의 식균 작용과 생존을 촉진 것으로 나타났다. SP-D 결합은 SP-D를 사용하여 생체 내에서 조사 하였다 - / - 비강 알렉사 플 루어 488 - 라벨 C. 접종 마우스 콕 쿠스 네오 포르 만 스. 폐 세척 후, AMS는 immunofluorescently 표시하고, 공 초점 현미경은 식균 작용을 분석하는 데 사용되었다.
다른 자극으로 (예를 들면, 티오 글리콜 레이트 추출 또는 체외 분화) 생성 다른 해부학 적 위치 (예를 들어, 폐포, 비장, 복막)에서 대 식세포는, 또는 세포 라인에서 (예를 들면, RAW264.7)는 극적으로 다른 항균 및 염증 반응 (15)을 가질 수 있습니다 - 18. 따라서, 가장 밀접하게 흡입 재미에 호스트 응답을 모델로GI, 우리는 즉시 희생 다음 비자극 마우스에서 기관지 폐포 세척액에 의해 수확 폐포 대 식세포를 사용했습니다.
처음에 우리는 대식 세포의 항진균 활성 4를 평가하는 라이브 세포 이미징을 사용했다. 폐포 대 식세포가 연발 유리 슬라이드에 도금 된 후 3 시간 후, 비 포식 포자가 포식 분생 포자의 방해 시각화 할 수 있도록 부드러운 세정에 의해 제거되었다. 누룩을 표현 GFP 시드. 포자의 발아는 다음 곰팡이를 시각화하는 대식 세포 및 GFP의 형광을 시각화하기 위해 밝은 빛이 이미지를 사용하여 30 분 간격으로 시간 경과 영상으로 모니터링 하였다. 이 방법은 동일한 일차 세포 배양의 순차 이미지를 획득하는 장점을 갖는다. 그러나, 대 식세포에 대한 경향은 오히려 conidiocidal 활성의 정량적 평가보다 질적 허용 취득 과정에서의 시야를 가로 질러 이동한다. 라이브 세포 이미징의 또 다른 단점은 t이다선명도와 세부 그는 부족으로 세포의 초점이 비행기에서 밖으로 이동.
더 상세 이미지를 얻기 위해 우리는 얻은 이미지로부터 3 차원 구조의 재구성을 가능하게 공 초점 현미경을 선택했다. 입체 재건 균사가 대 식세포 또는 통해 주위에 성장보다는 구별 할 수있는 기능을 제공합니다. 세 가지 차원에서 세포와 곰팡이를 볼 수있는이 능력으로, 3 시간에 비 포식 포자의 제거는 더 이상 필요한 단계입니다. 분생 포자는 세포 대 세포로 정확하게 구별 할 수 있습니다.
강화 된 시각화, 폐포 대 식세포는 PKH26와 생체 내에서 표시했다. 이 형광 염료는 안정적으로 세포막의 지질 영역으로 통합하는 긴 지방족 꼬리가있다. 정맥 주입했을 때,이 친 유성 염료가 혈류와 조직에 모두 식세포에 의해 흡수된다. 십일, LABE 후지도 식세포는 쥐의 순환에서 삭제 및 BAL 이미 표시된 폐포 대 식세포의 수집을 허용, 조직 9 만 남아있다. 생체 표지, 폐포 대 식세포의 수확 후 조작의 사용을 최소화로.
이 프로토콜의 또 다른 장점은 GFP-발현 A.의 사용이다 미가 투스의 변형. 이 균류는 균사의 단계를 통해 포자 단계에서 GFP를 표현하고 추가 염색에 대한 필요가 없습니다. 대 식세포와 아스 페르 길 루스의 이중 염색, 우리는 포식 분생 포자를 식별 할 수 있습니다.
이 프로토콜의 제한 요인은 BAL에서 대식 세포 수율이다. 비자극 마우스로부터 전형적인 수율은 3-5 × 105 폐포의 대 식세포의 범위이고, 그러나이 숫자는 세척을 수행하는 사람의 마우스, 경험의 크기 및 instillations의 수와 같은 요인에 따라 크게 달라질 수 세척 독감ID와 폐에서 철수 볼륨. 이 프로토콜에서는, 폐 세척 반복 1 ㎖의 instillations와 함께 오픈 흉강 적은 instillations에 비해 세포 수율을 향상하는 데 도움이 폐쇄 흉강으로 수행된다. 쥐의 숫자 또한 수확 수율을 증가시키기 위해 증가 될 수있다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 알레르기의 국립 연구소와 전염병 부여 R01AI079253 (BHS까지)에 의해 지원되었다에게 국립 암 연구소 암 센터 지원 그랜트 CA016056 로즈웰 파크 암 연구소에.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma | T48402 | Used to make AvertinAnesthetic |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma | A-1685 | Used to make AvertinAnesthetic |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| NH4Cl | Sigma | A0171 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| KHCO3 | Sigma | P91444 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| EDTA | Sigma | E6758 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| 22 G x 1.00 inch i.v. catheter | BD | 381523 | Insyte Autoguard Winged |
| Insulin syringes | |||
| 6 ml Syringes | |||
| 4-way stopcock | Fisher Scientific | 50-700-077 | |
| Suture thread | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes | |||
| gauze sponges (4 inch square) | |||
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | heat inactivated |
| Hema 3 Stain Set | Fisher Scientific | 22-122-911 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | |
| Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants | BD | 297252 | |
| Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein | provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada | ||
| 100 μm Cell strainers | BD Falcon | 64753-00 | |
| Scissors | |||
| Forceps | |||
| Biological Safety Cabinet Class II | |||
| Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor | |||
| Leica DM1000 light microscope | |||
| Hemocytometer | |||
| Cytospin 2 centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Cell culture incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
| 22 x 22 mm micro cover glass | VWR | 48366-227 | glass coverslips |
| 6-well Cell culture plates | Corning | 3506 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-1LP | |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Leica TCS SP2 system with a laser point scanner | Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope |
References
- Reeves, E. P., et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416, 291-297 (2002).
- Bianchi, M., et al. Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis. Blood. 114, 2619-2622 (2009).
- Vethanayagam, R. R., et al. Role of NADPH oxidase versus neutrophil proteases in antimicrobial host defense. PLoS One. 6, (2011).
- Grimm, M. J., et al. Monocyte- and Macrophage-Targeted NADPH Oxidase Mediates Antifungal Host Defense and Regulation of Acute Inflammation in Mice. The Journal of Immunology. 190, 4175-4184 (2013).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).
- Philippe, B., et al. Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates. Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).
- Cornish, E. J., et al. Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-independent resistance to Aspergillus fumigatus in alveolar macrophages. J Immunol. 180, 6854-6867 (2008).
- Jennings, J. H., Linderman, D. J., Hu, B., Sonstein, J., Curtis, J. L. Monocytes recruited to the lungs of mice during immune inflammation ingest apoptotic cells poorly. Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 108-117 (2005).
- Davidson, B. A., et al. DISCRIMINATION OF RESIDENT AND INFILTRATED ALVEOLAR MACROPHAGES BY FLOW CYTOMETRY IN INFLUENZA A VIRUS-INFECTED MICE. Experimental Lung Research. 31, 323-339 (2005).
- Gelderman, K. A., et al. Macrophages suppress T cell responses and arthritis development in mice by producing reactive oxygen species. J Clin Invest. 117, 3020-3028 (2007).
- Pizzolla, A., et al. Reactive oxygen species produced by the NADPH oxidase 2 complex in monocytes protect mice from bacterial infections. J Immunol. 188, 5003-5011 (2012).
- Luther, K., et al. Characterisation of the phagocytic uptake of Aspergillus fumigatus conidia by macrophages. Microbes and Infection. 10, 175-184 (2008).
- Geunes-Boyer, S., et al. Surfactant Protein D Increases Phagocytosis of Hypocapsular Cryptococcus neoformans by Murine Macrophages and Enhances Fungal Survival. Infection and Immunity. 77, 2783-2794 (2009).
- García-Rodas, R., González-Camacho, F., Rodríguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Zaragoza, O. The Interaction between Candida krusei and Murine Macrophages Results in Multiple Outcomes, Including Intracellular Survival and Escape from Killing. Infection and Immunity. 79, 2136-2144 (2011).
- Ryan, L. K., Vermeulen, M. W. Alveolar macrophages from C3H/HeJ mice show sensitivity to endotoxin. Am J Respir Cell Mol Biol. 12, 540-546 (1995).
- Redente, E. F., et al. Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation. J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage. Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).
- Goodridge, H. S., et al. Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells. J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).
