Summary
Vi presenterer en fremgangsmåte for fremstilling av glimmer støttes lipid-dobbeltlag for høy oppløsning mikroskopi. Glimmer er transparent og flatt på en atomskala, men lite brukt i avbildning på grunn av håndtering av vanskeligheter; vårt preparat resulterer i jevn avsetning av glimmer-ark, og reduserer det materiale som brukes i dobbeltsjikt preparatet.
Abstract
Støttede lipid bilayers (SLBs) er mye brukt som modell for å studere membranegenskaper (fase separasjon, clustering, dynamikk) og dets interaksjon med andre forbindelser, for eksempel narkotika eller peptider. Men SLB egenskaper varierer avhengig av støtte brukes.
Vanlige teknikker for SLB bildebehandling og målinger er enkelt molekyl fluorescens mikroskopi, FCS og atomic force mikroskopi (AFM). Fordi de fleste optiske imaging studier er utført på et glass-støtte, mens AFM krever en ekstremt flat overflate (vanligvis glimmer), kan resultatene fra disse teknikkene ikke sammenlignes direkte, ettersom lade og jevnhet egenskapene til disse materialene sterkt påvirke diffusjon. Dessverre, det høye nivået av manuell dyktighet for skjæring og liming tynne skiver av glimmer til glass-slide presenterer et hinder til rutinemessig bruk av glimmer for SLB forberedelse. Selv om dette ville være den foretrukne metode, for eksempel fremstilt glimmeroverflater ofte ende opp med å bli ujevnt (bølget) og vanskelig å image, spesielt med liten arbeidsavstand, høy numerisk blenderåpning. Her presenterer vi en enkel og reproduserbar metode for å forberede tynne, flate glimmer overflater for lipidvesikkel deponering og SLB forberedelse. I tillegg krever vår skreddersydde kammer bare svært små mengder vesikler for SLB formasjon. Den generelle fremgangsmåte resulterer i en effektiv, enkel og billig produksjon av høykvalitets lipid-dobbeltlag-flater som er direkte sammenlignbare med de som brukes i AFM studier.
Introduction
Det overordnede målet for den nåværende protokollen er å vise en metode for å forberede glimmer overflater for høyoppløselig avbildning av glimmer støttet lipid dobbeltlag (SLBs) ved hjelp av optisk total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM) eller konfokalmikroskopi, som også kan kombineres med atom-kraft mikroskopi (AFM).
SLBs er en mye brukt modell for en rekke studier av lipid clustering, faseseparasjon, dynamikk tolagskomponentene eller deres interaksjon med peptider, proteiner eller andre forbindelser 1-5. Forskjellige substrater kan benyttes til SLB-formasjon (dvs. glass, glimmer, silisiumdioksid, polymerer), avhengig av arten av studien 4,6-8. Typiske studier membran avhengige av mikrosbasert avbildningsteknikker, som for eksempel TIRFM og AFM. Således, for TIRFM avbildning, er en glassoverflate et typisk valg fordi glass er gjennomsiktig. Fremstilling av glass er forholdsvis enkel, og kvaliteten av resultatet er først og fremstbestemmes ved grundig overflaterensing før avsetning av lipid-vesikler. AFM på grunn av sin høye aksial oppløsning krever glimmer overflater. Mica er et silikat mineral, med nær perfekt basal cleavage. Således er den ferske spaltes glimmer atomically flat, slik at observasjon av membranhøydeforskjeller selv ved den sub-nanometerskala 9.
Diffusjon studier ved hjelp av fremgangsmåter slik som fluorescens-korrelasjonsspektroskopi (FCS), enkelt molekyl sporing (SMT), og fluorescens restitusjon etter photobleaching (FRAP) viste imidlertid at lipid membran dynamikk avhenge sterkt av den type overflate hvorpå de er avsatt, hvorved glasset og glimmer kan gi vidt forskjellige resultater 10,11. Disse forskjellene er ikke bare de diffusjonskoeffisienter i membranen, sonder, men også påvisning av separate bestander av partikler Diffusorelementene med ulike priser, og muligens bytte mellom ulike stater.
Såledesden direkte sammenligning av resultatene som oppnås ved bruk av TIRFM og AFM teknikker er ofte problematisk, med mindre den samme overflaten (i dette tilfellet glimmer) brukes. Selv om det er noen studier hvor TIRFM og AFM bilags bildebehandling ble gjennomført på samme glimmer overflate 12,13, er glimmer sjelden brukt for optisk mikroskopi, hovedsakelig på grunn av problemer med håndteringen. Mica forberedelse krever skjæring for hånd i tynne hefter, som deretter limt til dekkglass ved hjelp av optisk lim 12. Denne metoden krever imidlertid litt øvelse for å oppnå tilfredsstillende resultater. Videre er de flater som oppnås er ofte bølget og tykk, noe som gjør dem vanskelige å bruke en lav arbeidsavstand, høy numerisk blenderåpning.
Mica overflater fremstilt som beskrevet i denne protokollen er svært tynn (~ 220 mikrometer, inkludert dekk tykkelse på 170 mikrometer) og ekstremt flat, unngå "waviness", noe som er avgjørende for vellykket høy oppløsning. De kan benyttesfor TIRFM eller confocal oppsett. Dessuten kan de samme prøvene bli overført til AFM, og avbildes også samtidig med TIRFM / confocal og AFM. Ved å kombinere disse to teknikkene tillater direkte korrelasjon av diffusjon atferd med dobbeltmembranen struktur 14. Fordi glimmer overflater er ferske kløyvde, de er rene og ikke krever tidkrevende, dårlig reproduserbar, og potensielt farlige rengjøringsprosedyrer (glass rengjøring protokoller inkluderer vanligvis kjemikalier som Piranha løsning, svovelsyre, natrium / kaliumhydroksid). Montering av et lite kammer, som også er beskrevet i protokollen, reduserer volumet av vesikler som kreves for effektiv bilagsdannelse mindre enn 50 pl. Til slutt er hele prosessen med overflateenheten ikke er tidkrevende (fremstillingen tar mindre enn 30 min), og krever ikke en høy grad av manuell dyktighet, og det gjør konvensjonell glimmer spalting og liming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Mica og Slides Forberedelse
- Sted nr 1 ½ (0,17 mm) Dekk inn farging rack.
- Sonicate i 30 minutter i 2% vaskemiddel ved 60 ° C.
- Vask 20 ganger med avionisert vann.
- Fjern lysbilder ved hjelp av pinsett og blås tørt med trykkluft eller nitrogen.
- Skjær glimmer ark i 10 x 10 mm kvadratiske brikker bruker saks eller barberblad.
- Skjær hver glimmer stykke inn 2-3 tynnere brosjyrer ved hjelp av barberblad.
MERK: Dette trinnet krever bruk av skarp kniv.
2. Mica Assembly og Chamber Montering
- Clean mikroskopisk glass slide med etanol.
- Lim vedlegget glimmer kutte i trinn 1,6 til objektglass ved hjelp av optisk lim. Lav viskositet lim anbefales å bedre spre slipp og lim glimmer.
- Cure under UV lampe, 10 min.
MERK: Klebe herdes ved UV-lys med maksimal absorpsjon i området fra 350 til 380 nm, og den anbefalte energi requIRED for full herding er 4,5 J / cm 2. Imidlertid kan forskjellige lyskilder anvendes for dette trinnet (se materialer leveres av klebeleverandør). - Expose en ren glimmer overflate ved å fjerne de første lagene med Scotch tape.
- Plasser liten dråpe (ca. 20 mm) av optisk lim på glimmer overflate.
MERK: På dette trinnet, er høy viskositet lim med lav autofluorescence nivå anbefales. Erfaringen har vist at ved bruk av kombinasjonen av lav (trinn 2.2) og høye viskositet av klebemidler øker signifikant effektiviteten av glimmer splitting (trinn 2.7). - Forsiktig plassere fersk rengjort dekkglass på dråpe lim, unngå luftbobler, la takke med en min.
- Cure under UV lampe, 10 min.
MERK: Etter dette trinnet, kan den sandwich av glass-slide, glimmer og dekk lagres for en relativt lang periode (opp til noen uker). Fortsett til neste trinn før selve SLB forberedelse, for å være sikker på glimmer overflaten er frisk.
MERK: Klebe herdes ved UV-lys med maksimal absorpsjon i området fra 350 til 380 nm, og den anbefalte energi som kreves for fullstendig herding er 4.5J/cm 2. Imidlertid kan forskjellige lyskilder anvendes for dette trinnet (se materialer leveres av klebeleverandør). - Ved hjelp av en Exacto kniv, forsiktig demontere dekk fra sideglass som vist i videoen. I de fleste tilfeller vil et tynt og flatt lag av glimmer være festet på dekkglass. Glimmer er festet til glass-slide kan brukes om igjen (gjenta fra trinn 2.4).
- Sjekk kvaliteten på overflaten av blotte øye eller under et dissekere mikroskop, for å sørge for at glimmer laget er fortsatt klistret til dekkglass og ble ikke fjernet helt under splitting i trinn 2.8. Å gjøre en liten ripe med en pinsett eller dissekere nål vil bidra til å skille mellom limet som har en påviselig annerledes konsistens fra glimmer.
- Fjern gummipakning fra en 1,5 ml hetteglass cap og lim lokket opp ned til overflaten ved hjelp av optiskelim eller neglelakk, og kur med UV-lampe, eller la lufttørke 10 min, henholdsvis.
MERK: Hvis prøven er forberedt for samtidig optisk (TIRFM eller konfokalmikroskoper) med AFM bildebehandling, kan en 1,5 ml hetteglass cap være for liten til å montere AFM hodet på mikroskopet scenen. I dette tilfelle kan lokket være substituert med en hvilken som helst plast-O-ring med en større diameter, som passer for AFM hodemontasje. I tilfelle når forsøket krever fjerning av lokket, uten å skade glimmer overflate, kan silikonfett kan brukes i stedet for lim eller neglelakk.
Tre. Støttet lipidbllag (SLB) Dannelse
- Plasser nylaget liposom løsning i kammeret med overflaten. Minste volum som kreves for SLB formasjonen er ~ 30 mL.
MERK: For mer informasjon om liposomen og SLB formasjon, se publiserte protokoller, for eksempel slik som Bag et al, 2014 15.. - Fortsett med SLB formasjon ved bruk av ønsket protokoll. I løpet av inkubasjonen ogavbildning, kan kammeret være plassert i en varmeblokk eller oppvarmet objektbord for å holde temperaturen som er nødvendig for å holde de lipider som brukes over sin smeltetemperatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spredningen oppførsel av fluorescerende lipid sonder i SLBs er forskjellig avhengig av underlaget. TIRFM kombinert med SMT teknikken er en verdifull metode for visualisering av partikkelbevegelser og ekstrahere deres diffusjonskoeffisienter. Enkelt molekyl signaler om en Sphingomyelin-ATTO647N probe spre i en DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) bilayer støttes på glass og glimmer er vist på vedlagte animerte figuren. Den glimmer overflate ble fremstilt i henhold til protokollen som er presentert her. Å anslå optiske avvik, ble full bredde på halv maksimum (FWHM) målt og midlet over 20 punktspredefunksjon (PSF) bruker Mosaic 2D PSF Størrelse ImageJ plugin 16,17. Den målte FWHM for glass og glimmer var 441nm og 464nm henholdsvis (figur 1). 22nm forskjell i oppløsning mellom avbildning på glass og glimmer er ikke signifikant. I begge tilfeller kan PSF Tyngdepunktet av hver enkelt fluorescerende molekyl bli localized i etterfølgende bilder, og koblet inn partikkelbaner over tid med Mosaic Particle Tracker ImageJ plugin 16,17. Figur 2 viser eksempler på baner av partikler diffunderer over bilayer støttes på begge overflater. De gjennomsnittlige kvadrat forskyvninger (MSP) av fluorescerende probe spre i DOPC membran støttes på glass og glimmer ble plottet på Figur 3.. Grunnet sameksistens av flere bestander to populasjonsmodell ble brukt til å trekke raske og langsomme diffusjonskoeffisienter, i henhold til metoden beskrevet ved Schutz (figur 4, figur 5) 18. De diffusjonskoeffisienter og deres fraksjoner ble hentet ved hjelp TrackArt programvare 19 og er oppsummert i tabell 1.
Resultatene fra dette eksempelet bevise eksistensen av to separate stater i lykte probe: rask og langsom. Den diffusjonskoeffisienten av den raske befolknings er omtrent en0,5 ganger høyere på glimmer enn på glass. Den langsomme komponenten er imidlertid nesten ubevegelig på glass (<0,01 mikrometer 2 / sek), sammenlignet med en D på bare ~ 1/10 av fast populasjon på glimmer.
Figur 1. Gjennomsnittlig PSF størrelse. Gjennomsnittlig PSF intensitet profil for 20 flekker målt på glass (svart heltrukket linje) og glimmer (rød stiplet linje). Den fulle bredde ved halv maksimum (FWHM) på den normaliserte intensiteten for glass og glimmer ble anslått til å være 441 nm og 464 nm, hhv. Den 22nm forskjell indikerer at det er ingen signifikant nedgang i avbildningsoppløsning mellom disse to flater. PSF intensitet profilen ble målt ved hjelp av Mosaic PSF 2D Tool ImageJ plugin 16,17. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Eksempel baner. Eksempel baner av SM-ATTO647N Diffusorelementene i en DOPC lipidbilag støttes på glass (A) og glimmer (B). På glasset støttes dobbeltlag, blir sonden ofte er immobilisert på overflaten, og til å skifte til den raskt spre tilstand. Prober diffuserende på glimmer støttes dobbeltlag, i motsetning, er sjelden immobilisert på overflaten. I stedet har de en tendens til å veksle mellom rask og treg Diffuse tilstand. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Mean square forskyvninger. Mean square fortrenge menter av SM-ATTO647N partikler Diffusorelementene på et glass-(■) og glimmer-(●) støttet DOPC dobbeltlag. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 4. Kumulativ sannsynlighetsfordeling passer. Kumulativ sannsynlighetsfordeling (CPD) av firkant forskyvninger og passer for den bi-eksponential (to-populasjon) diffusjon modell av SM-ATTO647N partikler diffunderer på glass-(A)-og glimmer-(B) som støttes DOPC bilayers. Fordelinger og passer presenteres kun for femte gang-lag (Δ t = 50 ms). Beregninger og tomter er oppnådd ved bruk av TrackArt 19 programvare.lank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. MSD og fraksjons tomter. MSD tomter for rask (r 1 2) og treg (r 2 2) spre befolkning og brøkdel av den raske befolknings (F 1) beregnet fra CPD passer. Resultatene er presentert separat for SM-ATTO647N partikler Diffusorelementene på glass-(A) og glimmer-(B) støttet DOPC bilayers. Beregninger og tomter ble innhentet ved hjelp TrackArt 19 programvare. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Befolkning en (rask) | Befolkning 2 (sakte) | |||||||
| D 1 (mikrometer 2 / sek) | Fraksjon (%) | D 2 (mikrometer 2 / sek) | Fraksjon (%) | |||||
| Glass | 1.840 ± 0.031 | 65.19 ± 0.56 | 0.006 ± 0.001 | 34.81 ± 0.56 | ||||
| Mica | 53.88 ± 0.26 | 0.176 ± 0.002 | 46.12 ± 0.26 | |||||
Tabell 1. Diffusjonskoeffisienter. Oppsummering av diffusjon statistikk. Diffusjonskoeffisienter for langsomme og raske populasjoner og deres fraksjoner. Beregninger ble utført i TrackArt programvare ved hjelp av en to populasjonsmodell. Trajectories ble gjenkjent og koblet ved hjelp av Mosaic Particle Tracker ImageJ plugin.
Animert figur :. Enkle molekyler diffusjon Timelapse TIRFM film av Sphingomyelin-ATTO647N spre i en DOPC bilayer støttes på glass (til venstre) og glimmer (til høyre). Scale bar er 5 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av jevne og tynne glimmer overflater for lipid-dobbeltlag avsetning og høy oppløsning. Teknikken krever minimal håndlag, begrenset hovedsakelig til forsiktig demontering av glass-glimmer-glass-sandwich (trinn 2.8), som er kritisk for å oppnå en høy kvalitet glimmer overflate. Inspeksjon av ferskt spaltes glimmer er alltid nødvendig på dette tidspunkt, siden det er mulig for glimmeret til å løsne fra den optiske klebemiddel uten å spalte, slik at utsatte områder av optisk klebemiddel. Dette kan føre til uønsket avsetning av bilayer på klebe i stedet for på glimmer. Glimmer overflaten utarbeidet etter den metoden som er beskrevet er med få unntak parallelt med dekkflaten, skal man dømme etter den jevnt høy optisk bildekvalitet vi oppnådd; vi derfor ikke se behov for ytterligere bekreftelse.
Det siste trinnet i montering kammeret kan tilpasses. The Video opplæringen viser en1,5 ml hetteglass plasthette blir brukt som et kammer, men dette kan være substituert med en hvilken som helst gjenstand for tilsvarende form og ønskede dimensjoner, for eksempel for samtidig AFM-TIRFM/confocal avbildning, hvor prøven med holderen skal passe inn i den AFM hodet . Montering av et tilpasset kammer kan utelates, hvis avbildning skal utføres ved hjelp av en standard 35 mm metall cellekammeret. I dette tilfelle har imidlertid en 25 mm runde dekkglass som skal brukes, og et mye større volum av liposom-løsning som ville være nødvendig for SLB-formasjon.
Resultatene som presenteres her viser at enkelt molekyl bildebehandling og sporing kan enkelt gjøres på ekstremt flate glimmer overflater tynne nok til å være mottakelig for TIRFM bildebehandling, i henhold til protokollen for overflatebehandling beskrevet. Det samme preparat kan anvendes på andre teknikker, inkludert høy oppløsning optisk mikroskopi, som for eksempel total intern refleksjon fluorescens korrelasjonsspektroskopi (TIR-FCS). Viktigere, SLBs prepared på samme måte (eller til og med nøyaktig samme prøvene) kan brukes i både eksperimentelle oppsett, et vesentlig kriterium for direkte sammenligning av resultatene som er oppnådd ved hjelp av ulike metoder, f.eks AFM, SMT, FCS, og FRAP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen bekreftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | FB15051 | |
| Coverslips 24 x 50 mm - No H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III (detergent) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Mica V-1 Grade | SPI Suppliers | 1872-CA | |
| Optical Adhesive (high viscosity) | Norland Products | NOA63 | |
| Optical Adhesive (low viscosity) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyelin-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
| UV lamp | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | The lamp was set to 100% power |
References
- Giocondi, M. -C., et al.
- Garcia-Saez, A. J., Schwille, P.
- Plochberger, B., et al. Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer. Langmuir. 26, 17322-17329 (2010).
- El Kirat, K., Morandat, S., Dufrêne, Y. F. Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 750-765 (2010).
- Szmodis, A. W., Blanchette, C. D., Longo, M. L., Orme, C. A., Parikh, A. N. Thermally induced phase separation in supported bilayers of glycosphingolipid and phospholipid mixtures. Biointerphases. 5, 120-130 (2010).
- Strulson, M. K., Maurer, J. A. Microcontact printing for creation of patterned lipid bilayers on tetraethylene glycol self-assembled monolayers. Langmuir. 27, 12052-12057 (2011).
- Satriano, C., et al. Plasma oxidized polyhydroxymethylsiloxane--a new smooth surface for supported lipid bilayer formation. Langmuir. 26, 5715-5725 (2010).
- Bag, N., Sankaran, J., Paul, A., Kraut, R. S., Wohland, T. Calibration and limits of camera-based fluorescence correlation spectroscopy: a supported lipid bilayer study. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13, 2784-2794 (2012).
- Singh, S., Keller, D. J. Atomic force microscopy of supported planar membrane bilayers. Biophysical Journal. 60, 1401-1410 (1991).
- Przybylo, M., et al. Lipid Diffusion in Giant Unilamellar Vesicles Is More than 2 Times Faster than in Supported Phospholipid Bilayers under Identical Conditions. Langmuir. 22, 9096-9099 (2006).
- Scomparin, C., Lecuyer, S., Ferreira, M., Charitat, T., Tinland, B. Diffusion in supported lipid bilayers: influence of substrate and preparation technique on the internal dynamics. Eur Phys J E Soft Matter. 28, 211-220 (2009).
- Oreopoulos, J., Yip, C. M. Combined scanning probe and total internal reflection fluorescence microscopy. Methods. 46, 2-10 (2008).
- Shaw, J. E., Slade, A., Yip, C. M. Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers. J Am Chem Soc. 125, 11838-11839 (2003).
- Skaug, M. J., Faller, R., Longo, M. L. Correlating anomalous diffusion with lipid bilayer membrane structure using single molecule tracking and atomic force microscopy. J Chem Phys. 134, (2011).
- Bag, N., Yap, D. H., Wohland, T. Temperature dependence of diffusion in model and live cell membranes characterized by imaging fluorescence correlation spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta. , (2013).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. J Struct Biol. 151, 182-195 (2005).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).
- Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion. Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).
- Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7, (2014).
