Exploiter la demande Bioorthogonal inverse Electron Diels-Alder Cycloaddition pour préalablement visées PET Imaging

Introduction

Au cours des trente dernières années, la tomographie par émission de positons (TEP) est devenu un outil clinique indispensable dans le diagnostic et le traitement du cancer. Des anticorps ont longtemps été considérés comme des vecteurs prometteurs pour la livraison de radio-isotopes émettant des positrons à des tumeurs en raison de leur affinité exquise et la spécificité de biomarqueurs du cancer. ^1,2 Toutefois, le relativement lents pharmacocinétique in vivo d'anticorps obligatoire l'utilisation de radio-isotopes avec multi-jours demi-vies physiques. Cette combinaison peut donner de fortes doses de rayonnement aux organes non-cibles de patients, une complication importante qui est d'une importance particulière clinique depuis radioimmunoconjugués sont injectés par voie intraveineuse et donc - contrairement partielles scans corps CT - résultat dans doses absorbées dans chaque partie du corps, quels que soient les tissus interrogés.

Afin de contourner ce problème, des efforts importants ont été consacrés à l'dévepement de stratégies d'imagerie PET dissociant le radio-isotope et la fraction de ciblage, se appuyant ainsi les propriétés avantageuses des anticorps en longeant simultanément leurs limites pharmacocinétiques intrinsèques. Ces stratégies - le plus souvent appelés préciblage ou ciblage en plusieurs étapes - utiliser habituellement quatre étapes: (1) l'administration d'un anticorps capable de se lier à la fois un antigène et un radioligand; (2) l'accumulation de l'anticorps dans le tissu cible et de son dégagement à partir du sang; (3) l'administration d'une petite radioligand molécule; et (4) la ligature in vivo du ligand radioactif à l'anticorps suivie de la clairance rapide de l'excès de radioligand. ^8.3 Dans certains cas, un agent de compensation supplémentaire est injecté entre les étapes 2 et 3 de façon à accélérer l'excrétion de tout anticorps qui n'a pas encore d'engager la tumeur et reste dans le sang. ⁵

D'une manière générale, two préciblage types de stratégies sont les plus répandus dans la littérature. Bien que les deux ont fait leurs preuves dans des modèles précliniques, ils possèdent aussi des limites clés qui ont empêché leur applicabilité clinique. La première stratégie se appuie sur la forte affinité entre les anticorps de streptavidine conjugué et radiomarqueurs de biotine modifiée; cependant, l'immunogénicité des anticorps de streptavidine modifiée se est avérée être un problème préoccupant en ce qui concerne la traduction. ^5,6,9,10 La seconde stratégie, au contraire, utilise des anticorps bispécifiques qui ont été modifiés par génie génétique pour se lier à la fois un cancer antigène de biomarqueurs et un petit haptène radiomarqué molécule. ^3,11-14 Bien que cette dernière voie est certainement créatif, sa large applicabilité est limitée par la complexité, le coût et le manque de modularité du système.

Récemment, nous avons élaboré et publié une méthode d'imagerie PET préalablement visées sur la base de la demande d'électrons inverse de Diels-Alder (IEDDA) de réaction de cycloaddition entre -cyclooctene trans (TCO) et tétrazine (Tz;. Figure 1) ¹¹ Bien que la réaction se est connu depuis des décennies, IEDDA chimie a connu une renaissance au cours des dernières années comme une technique de bioconjugaison click chemistry, comme illustré par le travail fascinant des groupes de Ralph Weissleder, Joseph Fox et Peter Conti entre autres. ^12-15 Le IEDDA cycloaddition a été appliquée dans un large éventail de paramètres, y compris l'imagerie de fluorescence avec des peptides, des anticorps, et des nanoparticules ainsi que l'imagerie nucléaire . avec les deux radiohalogens et radiométaux ^16-26 La ligature est un rendement élevé, propre, rapide (k _1> 30000 M ^-1 sec ^-1), sélective et - critique -. bioorthogonal ²⁷ Et si un certain nombre de types de chimie clic - y compris azoture alcyne cycloadditions de Cu-catalysée, cycloadditions azoture-alcyne contrainte promu, et Staudinger ligations -. bioorthogonal sont ainsi, ce est la combinaison unique de la cinétique de réaction rapides et bioorthogonality qui rend IEDDA chimie si bien adapté à préciblage applications dans des organismes entiers ^28,29 long de ces lignes, il est important de noter que le récent rapport de notre laboratoires ne était pas le premier à appliquer IEDDA chimie pour préciblage: le premier rapport de l'imagerie préalablement visées avec IEDDA née du travail de Rossin, et al et a présenté une méthodologie SPECT utilisant un ¹¹¹ tétrazine Dans marqué ^30..

Comme nous avons discuté ci-dessus, la méthodologie préciblage comporte quatre étapes assez simples (figure 2). Dans le protocole à portée de main, une stratégie préalablement visées pour l'imagerie PET du cancer colorectal qui emploie une Cu-NOTA radioligand marqué ⁶⁴ de tétrazine et un conjugué TCO modifiée de l'anticorps huA33 va être décrit. Cependant, en fin de compte la modularité de cette méthodologie est l'un de ses gractifs en mangeras, que la fraction -cyclooctene trans peuvent être ajoutés à tout anticorps non-internalisation et l'tétrazine peuvent être attachés à une grande variété de journalistes radioactives.

Protocol

ÉTHIQUE DECLARATION: Toutes les expériences in vivo d'animaux décrits ont été réalisés selon un protocole approuvé et selon les directives éthiques de la Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care et l'utilisation Comité (IACUC).

1. Synthèse de Tz-Bn-NOTA

1. Dans un petit récipient de réaction, dissoudre 7 mg NH ₂ Bn-NOTA (1,25 x 10 ^-2 mmol) dans 600 ul NaHCO ₃ tampon (0,1 M, pH 8,1). Vérifier le pH de la solution. Si nécessaire, ajuster le pH de la solution à 8,1 en utilisant de petites fractions aliquotes de 0,1 M de Na ₂ CO _3.
2. Ajouter la solution de NH ₂ Bn-NOTA à 0,5 mg Tz-NHS (1,25 x 10 ^-3 mmol) dans un tube de microcentrifugation de 1,7 ml.
   NOTE: Le TZ-NHS peut soit être pesé à sec ou ajouté à partir d'une solution mère de DMF sec ou le DMSO (<50 pi).
3. Laisser la solution de réaction résultant réagir pendant 30 min à température ambianteavec une légère agitation.
4. Après 30 min, purifier le produit en utilisant C Chromatographie ₁₈ HPLC en phase inverse pour enlever ne ayant pas réagi NH ₂ Bn-NOTA. Le NH ₂ Bn-NOTA peut être contrôlé à une longueur d'onde de 254 nm, tandis que le Tz-NHS et Tz-Bn-NOTA sont mieux suivis à une longueur d'onde de 525 nm.
   NOTE: Les temps de rétention sont évidemment fortement tributaire de la configuration de l'équipement de HPLC de chaque laboratoire (pompes, colonnes, tubes, etc.). Toutefois, pour présenter un exemple, si un gradient de 0: 100 MeCN / H ₂ O (tous deux avec 0,1% de TFA) à 100: 0 MeCN / H ₂ O de plus de 25 min et une 4,6 x 250 mm C ₁₈ colonne d'analyse est utilisé Les temps de rétention des Tz-Bn-NOTA, Tz-NHS, et NH ₂ Bn-NOTA, à environ 15 min, 16,5 min et 10 min, respectivement. Le produit peut être purifié à partir des autres composants de la réaction, soit dans un seul passage ou plusieurs passages en utilisant une colonne semi-préparative HPLC preparative ou C _18. ¹ H-RMN, analytical HPLC et ESI-MS sont toutes des méthodes qui peuvent être utilisées pour vérifier la pureté du précurseur Tz-Bn-NOTA terminé. ¹¹
5. Geler l'éluant HPLC recueillies à l'aide de l'azote liquide.
6. Enroulez le tube de prélèvement congelé dans de l'aluminium opaque.
7. Placer le tube de collecte congelé dans un récipient de lyophilisation O / N pour supprimer la phase mobile de CLHP.
8. Stocker le produit purifié (un rose vif solide) dans l'obscurité à -80 ° C.
   NOTE: Ce est un point d'arrêt acceptable dans la procédure. Le précurseur Tz-Bn-NOTA complété est stable pendant au moins 1 an dans ces conditions.

2. Préparation de huA33-TCO Immunoconjugué

1. Dans un tube de 1,7 ml à centrifuger, préparer un 1 mg / ml (2,7 mM) solution de TCO-NHS dans du DMF sec.
2. Dans un tube de microcentrifugeuse de 1,7 ml, préparer une 2 mg / ml (13,3 uM) de huA33 solution dans 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate, pH 7,4 (0,01 M PO _{4 ^3-,}
3. En utilisant de petites fractions aliquotes (<5 pi) de 0,1 M de Na ₂ CO _3, ajuster le pH de la solution d'anticorps à 8,8 à 9,0. Utilisez soit papier pH ou un pH-mètre avec une microélectrode de contrôler le pH, et faire attention de ne pas laisser le pH à élever au-dessus de pH 9,0.
4. Une fois la solution d'anticorps est à la bonne pH, ajouter un volume de la solution NHS-TCO correspondant à huit équivalents molaires de l'ester activé. Par exemple, ajouter 7,9 pi de la solution à 1 mg / ml TCO-NHS (1,07 x 10 ^-7 mol TCO-NHS) pour les 1 ml de solution à 2 mg / ml d'anticorps huA33 (1,33 x 10 ^-8 mol huA33). Ne pas dépasser 5% de DMF en volume dans la solution.
5. Mélanger doucement la solution en inversant le tube à centrifuger à plusieurs reprises.
6. Enroulez le microtube dans une feuille d'aluminium opaque.
7. Laisser la solution à incuber pendant 1 heure à température ambiante avec une légère agitation.
8. Après 1 heure à température ambiante, purifier l'immunoconjugué résultant en utilisant un siz jetable pré-emballése exclusion sur une colonne de dessalage. Premièrement, rincer la colonne d'exclusion de taille comme décrit par le fournisseur pour enlever les conservateurs présents sur la colonne pendant le stockage. Ensuite, ajouter le mélange réactionnel à la colonne d'exclusion de taille, rincer la colonne avec 1,5 ml de solution saline stérile à 0,9%, et ensuite récupérer le produit en utilisant 2 ml de solution saline stérile à 0,9% comme éluant.
   NOTE: Cette étape donnera l'huA33-TCO complété comme une solution 2 ml.
9. Mesurer la concentration de la résultante huA33-TCO sur un spectrophotomètre UV-Vis.
10. Si une concentration plus élevée est souhaitée, concentrer la solution huA33-TCO l'aide d'une unité de filtration centrifuge avec un poids moléculaire 50.000 cut-off.
    NOTE: Il est important de noter que tandis que huA33 et une variété d'autres anticorps bien connus (par exemple, le bevacizumab, le trastuzumab, le cetuximab, et J591) sont très tolérants d'être concentrée, agrégation et la précipitation peuvent se produire lors de la concentration dans les autres cas. Les chercheurs de tenter cette Procedure avec un nouvel anticorps doit faire confiance à la littérature ou leur propre connaissance de l'anticorps en question quant à savoir si ou non de concentrer l'anticorps.
11. Rangez la immunoconjugué huA33-TCO complété à 4 ° C dans l'obscurité.
    NOTE: Ce est un point d'arrêt acceptable dans la procédure. Le conjugué mAb-TCO complété doit être stable pendant au moins trois mois dans ces conditions de stockage.

3. ⁶⁴ Cu Radiomarquage de Tz-Bn-NOTA

Remarque: cette étape du protocole impliquant le traitement et la manipulation de radioactivité. Avant d'effectuer ces étapes - ou effectuer d'autres travaux par la radioactivité - les chercheurs devraient consulter avec le Département de la radioprotection de leur établissement d'origine. Prendre toutes les mesures possibles pour minimiser l'exposition aux rayonnements ionisants.

1. Dans un tube de 1,7 ml à centrifuger, préparer un 0,5 mg / ml (723 uM) solution de Tz-Bn-NOTA.
2. Dans une 1,7 ml MicroCTube entrifuge, ajouter 10 ul de la solution Tz-Bn-NOTA (5 ug) à 400 ul de 0,2 M de NH ₄ OAc tampon pH _5,5.
3. Dans l'intérêt de la note tenue radiochimique appropriée, mesurer et enregistrer la quantité de radioactivité dans l'échantillon en utilisant un calibrateur de dose avant et après les étapes qui ont suivi dans le protocole ci-dessous (03.04 à 03.08). Cela aidera à la détermination précise des rendements radiochimiques.
4. Ajouter 2,000 uCi (74 MBq) de ⁶⁴ Cu à la solution Tz-Bn-NOTA.
   NOTE: En règle générale, ^[64 Cu] CuCl ₂ est fourni dans un petit volume (<30 pi) de 0,1 N HCl, et donc que de petits volumes (<10 pi) de cette solution d'achat d'actions sont nécessaires pour la réaction de radiomarquage. Si de plus grands volumes de la ^[64 Cu] CuCl ₂ actions sont nécessaires, la réaction de radiomarquage est tolérant d'augmenter le volume global de la réaction. Cependant, le pH de la solution de réaction de radiomarquage doit être surveillée avec soin pour garantirqu'il ne tombe pas en dessous de pH 4,0.
5. Laisser la solution à incuber pendant 10 min à température ambiante avec une légère agitation.
6. Après 10 min d'incubation, purifier le produit en utilisant ₁₈ C chromatographie HPLC en phase inverse. Les temps de rétention sont évidemment fortement dépendant de la configuration de l'équipement de HPLC de chaque laboratoire (pompes, colonnes, tubes, etc.). Toutefois, pour présenter un exemple, si un gradient de 5:95 MeCN / H ₂ O (tous deux avec 0,1% de TFA) à 95: 5 MeCN / H ₂ O de plus de 15 min est utilisé, le temps de rétention de ⁶⁴ Cu-Tz- Bn-NOTA devrait être autour de 9,8 min alors libre, non complexée ⁶⁴ Cu sera élue avec le front du solvant à environ 2-4 min.
7. En utilisant un évaporateur rotatif, retirer l'éluant HPLC.
8. Reprendre le produit ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA 0,9% dans une solution saline stérile.
   NOTE: Compte tenu de l'12,7 h demi-vie physique de ⁶⁴ Cu, ce ne est pas un point d'arrêt acceptable dans la procédure. Effectuer la synthèse de ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-PASA immédiatement avant l'injection du radioligand, et suivez l'étape par étape immédiatement 3,7 4,5.

4. En Vivo préalablement visées PET Imaging

Remarque: Comme dans la section Protocole 3, cette étape du protocole impliquant le traitement et la manipulation de radioactivité. Avant d'effectuer ces étapes chercheurs devraient consulter avec le Département de la radioprotection de leur établissement d'origine. Prendre toutes les mesures possibles pour minimiser l'exposition aux rayonnements ionisants.

1. Dans une souris nude athymiques femelles, implant sous-cutanée 1 x 10 cellules du cancer du côlon SW1222 de ⁶ et de permettre à ceux-ci se développent dans une xénogreffe de 100 à 150 mm ³ (9 à 12 jours après l'inoculation). ¹¹
2. Diluer une partie aliquote de la solution huA33-TCO de service du protocole 2 à une concentration de 0,5 mg / ml dans 0,9% de solution saline stérile.
3. Injecter 200 ul de la solution huA33-TCO (100 pg) dans la veine caudale de la souris portant une xénogreffe.
4. Autoriser 24 h pour l'accumulation de la huA33-TCO dans la tumeur de la souris.
5. On dilue le ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA radioligand à une concentration de 1,5 mCi / ml dans 0,9% de solution saline stérile.
6. Injecter 200 ul de la solution de ligand radioactif Cu-Tz-Bn-NOTA ⁶⁴ (300 uCi; 11,1 MBq; 1,6 nmol de ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA, en supposant une activité spécifique de 6,7 MBq / nmol) dans la veine caudale de la xénogreffe-souris porteuses.
7. Au point de temps d'imagerie désiré (par exemple, 2, 6, 12, ou 24 heures après l'injection), Anesthésier la souris avec un isoflurane 2%: mélange de gaz d'oxygène.
8. Placer la souris sur le lit de la petite scanner TEP animale. Maintenir l'anesthésie pendant l'analyse en utilisant un 1% d'isoflurane: mélange de gaz d'oxygène. Avant de placer l'animal sur la vitre du scanner, vérifiez l'anesthésie selon la méthode toe-pincement et appliquer une pommade vétérinaire aux yeux de la souris pour éviter le dessèchement pendant l'anesthésie.
9. Acquérir les données PET pour la souris via un statiquebalayer avec un minimum de 20 millions d'événements coïncidents à l'aide d'une fenêtre d'énergie de 350-700 keV et une fenêtre de cadencement de coïncidence de 6 nanosecondes. Après avoir complété l'acquisition de l'image, ne laissez pas la souris sans surveillance et ne pas le placer dans une cage avec les autres souris jusqu'à ce qu'il a repris conscience.

Representative Results

Les trois premières étapes de l'expérience - la synthèse de Tz-Bn-NOTA, la conjugaison du TCO huA33 et le radiomarquage de la Tz-Bn-NOTA construire (figures 3 et 4) - sont très fiables. Dans le cas de la procédure ci-dessus, le produit d'assemblage Tz-Bn-NOTA a été synthétisé avec un rendement élevé et de pureté. L'anticorps huA33 a été modifié avec 4,2 ± 0,6 TCO / mAb et Tz-Bn-NOTA était marqué à ⁶⁴ Cu pour donner le radioligand purifié dans> 99% de pureté radiochimique,> 85% de rendement de décroissance corrigée, et une activité spécifique de ~ 6,7 MBq / nmol (figure 5). La réactivité du conjugué huA33-TCO et le radioligand de tétrazine peuvent être testées en utilisant la chromatographie instantanée radioactifs en couche mince (CICM). Ceci est réalisé en mélangeant le tétrazine radiomarqué (100 uCi; 0,55 nmol, en supposant une activité spécifique de 6,7 MBq / nmol) avec un léger excès de huA33-TCO (50 pg; 0,66 nmol) de phosphate une solution saline tamponnée (pH 7,4) à température ambiante pendant 5 min. Ensuite, environ 1 pCi de la solution est repéré sur une plaque de CCM C ₁₈ en phase inverse et on laisse sécher. La CCM est exécuté en 9: 1 MeCN: H ₂ O, et la plaque analysée en utilisant un lecteur de plaque de CCM radioactives. Si la réaction de clic fonctionne comme prévu, le ⁶⁴ ligaturé Cu-NOTA-A33 devrait rester à la base; si, d'autre part, la réaction tombe en panne, une connexion ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA apparaîtra à ou près du front de solvant.

Passant aux expériences in vivo d'imagerie, dans le protocole décrit ci-dessus, des souris nude athymiques portant A33, SW1222 xénogreffes de cancer colorectal exprimant l'antigène ont été employées. Les deux biodistribution aiguë (n = 5 par point de temps) et l'imagerie TEP (n = 12) expériences révèlent que la stratégie préciblage est capable de délimiter la croissance de la tumeur colorectale avec un excellent contraste d'image et des ratios élevés tumeur à-fond activité (Figure 6). L'absorption de la ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA dans la tumeur est apparente à des moments précoces: 3,5% ± 0,6% ID / g et 4,1% ± 0,6% ID / g à 1 h et 4 injection h de poste, respectivement. Cependant, à ces premiers points, il est facilement masquée par la quantité de radioactivité compensation dans le tractus intestinal de souris (11,9% ± 4,4% ID / g et 8,8% ± 3,4% ID / g dans les fèces à 1 heure et 4 h pi, respectivement). Au cours de plusieurs heures, l'excès radioligand efface par les fèces (1,4% ± 0,5% ID / g à 24 h pi), et la tumeur devient la caractéristique la plus importante dans l'image (4,0% ± 0,9% ID / g à 24 h pi). À ces points de temps plus tard, la tumeur est bien délimitée dans l'image, et les rapports d'activité tumeur-à-fond sont assez élevés; par exemple, la stratégie donne la tumeur: ratios de 26,6 ± 6,6 musculaires à 12 h pi et 27,0 ± 7,4 à 24 h pi ne est pas surprenant, les expériences de contrôle en utilisant seulement ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA anticorps, non spécifiques, or huA33 TCO sans fragments conjugués toutes abouti à l'absorption minimale dans la tumeur.

Comme on le verra plus loin, cette stratégie préciblage - comme toutes les stratégies préciblage - a un certain nombre de variables qui nécessitent une optimisation lorsqu'elle est appliquée à de nouveaux systèmes anticorps / antigène. Deux des plus importantes sont la masse de mAb-TCO construction injectée et la longueur de l'intervalle entre l'injection du produit de construction mAb-TCO et l'injection du radioligand. Si la quantité de mAb-TCO conjugué est trop élevée ou l'intervalle de temps entre les injections est trop court, le montant de la libre mAb-TCO dans le sang augmente et la probabilité de clic réactions se produisant dans le sang plutôt qu'à la tumeur augmente. Par exemple, ⁶⁴ dans le système Cu / huA33 discuté ici, à la fois l'administration de 300 pg de huA33 (au lieu de 100 pg) ou l'utilisation d'un intervalle de temps de 12 h (au lieu de 24 heures) a donné lieu à une augmentation notable des til quantité de radioactivité visible dans le coeur de la souris (Figure 7A et 7B Figure, respectivement). Dans ces deux cas, la réaction de clic est encore clairement produit à la tumeur, comme illustré par la quantité d'absorption tumorale à des moments précoces; Toutefois, la formation d'anticorps radiomarqué dans le sang est également apparente. Bien que ce est tentant de rejeter parce l'anticorps radiomarqué formé dans le sang sera encore trouver éventuellement son chemin vers la tumeur, ce défaites peu le but d'utiliser une méthodologie préciblage, que l'anticorps radiomarqué fera circuler lentement avant qu'il ne atteigne la tumeur et ainsi augmenter débits de dose aux organes non ciblés. Inversement, si trop peu d'anticorps est utilisé, la quantité d'absorption dans la tumeur sera naturellement souffrir. Trop longs temps d'intervalle peuvent également réduire les niveaux d'absorption de la tumeur en raison de la lenteur internalisation d'anticorps, transcyclooctene isomérisation, ou anticorps / antigène excrétion. Le diagnostic de l'eproblèmes ESE est plus difficile et ne peuvent pas être accomplies simplement par l'examen des données de PET. De toute évidence, un équilibre délicat doit être maintenu. Par conséquent, il est recommandé que les enquêteurs tentent d'appliquer cette stratégie à une nouvelle / système d'anticorps-antigène utilisent de grandes quantités de mAb-TCO construction (≥ 200 mg) et les temps d'intervalles courts (≤ 24 h) comme points de départ et d'optimiser à partir de là.

Figure 1. L'inverse électrons demande de Diels-Alder [4 + 2] cycloaddition clic ligature entre tétrazine et transcyclooctene.

Figure 2. Une illustration des quatre étapes de la méthodologie préciblage. Ce chiffre est basé sur la recherche publiée initialement dans JNM. Zeglis, BM et al. Un animal préalablement visées Les bas de stratégie d'imagerieed sur bioorthgonal Diels-Alder chimie clic. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). © 2013 par la Société de médecine nucléaire et l'imagerie moléculaire, Inc. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Un schéma pour la modification de huA33 avec TCO-NHS.

Figure 4. Un schéma de synthèse et ⁶⁴ Cu radiomarquage de Tz-Bn-NOTA. Ce chiffre est basé sur la recherche publiée initialement dans JNM. Zeglis, BM et al. Une stratégie d'imagerie PET préalablement visées sur la base bioorthgonal Diels-Alder cliquez chimie. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). &# 169; 2013 par la Société de médecine nucléaire et l'imagerie moléculaire, Inc. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. Une trace la radio-HPLC de ⁶⁴ purifiée Cu-Tz-Bn-NOTA.

Figure 6. images PET de ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA / A33-TCO préciblage stratégie. Les souris porteuses de xénogreffes sous-cutanées de SW1222 (100-150 mm ³⁾ ont été administrés huA33-TCO (100 ug) par injection veine de la queue. Après 24 heures, les mêmes souris ont reçu ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA (10,2 à 12,0 MBq [275-325] uCi) par injection dans la veine caudale et ensuite imagés 2, 6, 12 et 18 h après l'administration du radiopharmaceutique. Transverse (en haut) et coronales (en bas) images planaires croisent le centre des tumeurs. Des niveaux élevés de l'absorption dans l'intestin aux points de temps précoces (ce est à dire, 2 et 6 h) largement claires de 12 h, laissant la tumeur (flèche blanche) clairement délimitée de tous les tissus non ciblée par la post-injection 12 et 18 h. Ce chiffre est basé sur la recherche publiée initialement dans JNM. Zeglis, BM et al. Une stratégie d'imagerie PET préalablement visées sur la base bioorthgonal Diels-Alder cliquez chimie. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). © 2013 par la Société de médecine nucléaire et l'imagerie moléculaire, Inc. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7. images PET d'expériences de préciblage sous-optimaux. (A) Souris beaanneau xénogreffes sous-cutanées de SW1222 (100-150 mm, ³ flèches) ont été administrés huA33-TCO (100 ug) par injection veine de la queue. Après 12 h, les mêmes souris ont reçu ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA (de 10,2 à 12,0 MBq [275-325 uCi]) de injection dans la veine de la queue. (B) Les souris porteuses de xénogreffes sous-cutanées de SW1222 (100-150 mm, ³ flèches) ont été administrés A33-TCO (300 ug) par injection veine de la queue. Après 24 heures, les mêmes souris ont reçu ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA (de 10,2 à 12,0 MBq [275-325 uCi]) de injection dans la veine de la queue. Dans les deux cas, les souris ont été imagées 12 h après l'injection de ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA. Dans les deux panneaux, transversale (en haut) et coronale (en bas) images planaires croisent le centre des tumeurs. Bien que la stratégie préciblage délimite clairement la tumeur dans les deux cas, les résultats de ces deux images sont sous-type par rapport à ceux indiqués à la figure 6. Dans les deux figures 7A et 7B, il estquantité importante de l'activité de fond absorption dans le cœur. Dans les conditions de la figure 7A, ce est probablement le résultat de la huA33-TCO assez de temps de construire ne pas avoir eu à se localiser dans la tumeur. Dans les conditions de la figure 7B, ce est probablement une conséquence de l'injection trop huA33-TCO et ayant un excès immunoconjugué toujours en circulation dans le sang, même 24 heures après l'injection. Ce chiffre est basé sur la recherche publiée initialement dans JNM. Zeglis, BM et al. Une stratégie d'imagerie PET préalablement visées sur la base bioorthgonal Diels-Alder cliquez chimie. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). 2013 par la Société de médecine nucléaire et l'imagerie moléculaire, Inc. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Le principal avantage de cette stratégie d'imagerie par PET préalablement visées, ce est qu'il est capable de délimiter les tumeurs avec la cible et le contraste de l'image en arrière-plan seulement une fraction de la dose de rayonnement d'arrière-plan produit par les anticorps directement marqués. Par exemple, dans le système d'imagerie du cancer colorectal décrit ici, les données provenant des expériences de biodistribution aiguë ont été utilisées pour effectuer des calculs de dosimétrie de la stratégie de préciblage à base de Cu ⁶⁴ ainsi que directement marqué ⁶⁴ Cu-NOTA-huA33 et ⁸⁹ Zr-DFO-huA33. Ces calculs montrent clairement les avantages dosimétriques du système préciblage, en particulier par rapport à l'anticorps plus cliniquement pertinente ^Zr-89 marqué. La dose efficace de la stratégie préciblage est 0,0124 mSv / MBq, tandis que celle de ⁸⁹ Zr-DFO-huA33 est plus de 30 fois plus élevé: 0,4162 mSv / MBq. L'avantage dosimétrique de préciblage est moins prononcée lorsque l'on compare aux ⁶⁴ Cu-étiqueténtibody (0,0359 mSv / MBq), bien que l'effet avantageux existe toujours.

L'une des forces les plus importantes de cette IEDDA préciblage méthodologie est sa modularité: l'-cyclooctene trans peut être ajouté à ne importe quel anticorps qui ne est pas l'intériorisation, et une grande variété de cargaisons peut être attaché à l'tétrazine. En effet, notre principale motivation pour la rédaction de ce protocole est de permettre à d'autres groupes de recherche à employer cette méthode avec différents systèmes anticorps / antigène / radio-isotopes. Le long de ces lignes, nous croyons qu'il est essentiel d'aborder un certain nombre de questions que les chercheurs devraient tenir compte lors de l'adaptation de cette méthode pour d'autres systèmes.

Tout d'abord, la sélection de l'anticorps est extrêmement important. Autrement dit, l'anticorps doit être non-internalisation ou intériorisé à un rythme très lent. Bien que les paramètres cinétiques idéales ont pas encore été déterminées, l'anticorps et la -cyclooctene trans réactive il porte doit rester surl'extérieur de la cellule, pour l'internalisation et la séquestration de l'anticorps avant l'injection du radioligand serait réduire considérablement le nombre de cliquer réactions in vivo. Dans le système décrit ici, les cibles d'anticorps huA33 et se lie à l'antigène A33, une glycoprotéine transmembranaire exprimée dans> 95% des cancers colorectaux. Surtout, il a été montré que, même après la liaison de sa cible, le huA33 complexe anticorps / antigène reste sur la surface de la cellule pendant plusieurs jours. ^31-33 Bien que la nécessité d'un anticorps non-internalisation est certes une limitation de la stratégie, un grande variété d'anticorps non-internalisation sont connus, peut-être plus particulièrement le CC49 anticorps TAG72-ciblage qui Rossin, et al. ont exploré dans leur excellent travail préciblage. ^30,34,35

Deuxièmement, cette stratégie préciblage - comme tout autre - nécessite une optimisation significative. En plus de l'identité de l'unntibody et le radioligand de tétrazine, deux variables critiques doivent être considérés: la quantité d'anticorps injecté et l'intervalle de temps entre les injections de l'anticorps et le radioligand. Nous avons abordé ces deux variables dans la section des résultats représentatifs ci-dessus, mais je le répète brièvement, si soit trop anticorps ou trop court d'un intervalle de temps est utilisé, d'importantes quantités de mAb-TCO conjugué restera dans le sang au moment de l'injection du radioligand. Ceci, à son tour, entraînera la ligature in vivo clic survenant dans le sang plutôt que sur la tumeur, formant circulation, anticorps radiomarqué qui se accumuleront que lentement dans la tumeur au fil du temps. Inversement, si trop peu d'anticorps ou une trop longue intervalle de temps est utilisé, le montant final de la radioactivité dans la tumeur sera sous-optimale. À notre avis, l'exécution rigoureuse imagerie, ou, de préférence, des expériences de biodistribution aigus avec le Itse d'anticorps directement marquéLF avant toute expériences préciblage est le moyen le plus fiable pour en apprendre davantage sur la quantité d'anticorps nécessaire et l'intervalle de temps idéal après l'injection initiale d'anticorps construction. Pour différentes masses injectées de mAb marqué radioactivement, ces expériences vont fournir des données à la fois sur le béton de la clairance du sang radioimmunoconjugué et son accumulation dans la tumeur, ce qui permet la sélection des conditions les plus prometteurs pour les expériences préciblage.

Enfin, la pharmacocinétique du radioligand base tétrazine-doivent être pris en compte lors du choix d'un radio-isotope approprié. Dans le système décrit ici, le fragment radiomarqué Tz-Bn-NOTA est excrété par le corps via l'intestin avec une demi-vie biologique d'environ 3-4 heures, ce qui rend le ⁶⁴ Cu radio-isotope émetteur de positons avec le demi physique le plus complémentaire vie. Malheureusement, la demi-vie biologique de la fraction de tétrazine est trop longue pour être compatible avec les ee décomposition plus rapidement radiométal ⁶⁸ Ga (t _1/2 = 68 min). Dans ce cas, toute la radioactivité dans la tumeur se dégrader à travers plusieurs demi-vie avant l'excès de radioligand a terminé la compensation de l'organisme. En conséquence, les images devraient être acquis à des moments précoces, lorsque le taux d'activité tumeur-à-fond restent faibles ³⁶ Idéalement, les générations futures de radioligands de tétrazine pourrait être conçu. - Peut-être par PEGylation, la glycation, ou tout autre moyen - d'excréter du corps plus rapidement. Cela permettrait de radiomarquage avec des radioisotopes en décomposition plus rapide comme ⁶⁸ Ga et ¹⁸ F, qui à son tour améliorer encore les avantages dosimétriques de la stratégie d'imagerie préalablement visées. En fin de compte, en tant que chercheurs adapter cette technologie pour une utilisation avec d'autres radio-isotopes pour l'imagerie (par exemple, ¹²⁴ I, ¹¹¹ In, ¹⁸ F, ⁸⁹ Zr, ⁶⁸ Ga, etc.) ou la thérapie (par exemple, 177, 225 Ac, ¹²⁵ I, etc.), de nouveaux ligands base-tétrazine devra être développé pour intégrer différents chélateurs ou radiomarquage groupements prosthétiques. L'enquête approfondie de la pharmacocinétique de ces nouvelles constructions sera essentielle pour assurer matchs avantageuses entre les propriétés de dégagement des ligands et la demi-vie physique des radionucléides.

En fin de compte, nous espérons vivement que d'autres chercheurs voient la promesse de cette technologie préciblage et emploient de nouveaux systèmes anticorps / antigène. Alors que les paragraphes précédents montrent que ce processus d'adaptation ne est pas toujours simple, ce est notre conviction que cette méthodologie pourrait avoir un impact significatif sur l'imagerie nucléaire, en thérapie ciblée par radionucléides, et au-delà.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tetrazine NHS Ester	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA	Macrocyclics	B-601	Store at -80 °C