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Bioengineering

Pretargeted PET 영상에 대한 Bioorthogonal 역 전자 수요 딜스 - 알더 고리 모으고

Published: February 3, 2015 doi: 10.3791/52335
Automatic Translation
*1, 1, *1
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center
* These authors contributed equally

Introduction

지난 30 년 동안, 양전자 방출 단층 촬영 (PET)는 암의 진단 및 관리에 필수적인 임상 도구가되었다. 항체는 긴 암 바이오 마커에 ​​대한 그들의 절묘한 친화력과 특이성으로 인해 종양 양전자 방출 방사성 동위 원소의 전달을위한 유망한 벡터를 고려하고있다. 항체의 1, 2 단, 상대적으로 느린 생체 내 약물 동태는 여러 날에 방사성 동위 원소의 사용을 의무화 물리적 반감기. 부분 바디 CT 스캔 달리 - - 조합은 환자의 비 - 표적 기관, radioimmunoconjugates 정맥 따라서 주입되기 때문에 특히 임상 적 의의이다 중요한 합병증 높은 방사선 량을 수득 할 결과를 흡입 투여로 신체의 모든 부분에서, 심문 조직에 관계없이.

이 문제를 우회하기 위해 상당한 노력을 develo의 전념하고있다동시에 내재 약동학 적 한계를 둘러싸하면서함으로써 항체의 유리한 특성을 활용, 방사성 동위 원소 및 표적 부분을 분리 PET 영상 전략의 pment. 이러한 전략은 - 가장 자주 pretargeting 또는 다단계 타겟팅라고 - 전형적으로 네 단계를 채택한다 : (1) 항원 및 방사성 리간드를 모두 결합 할 수있는 항체의 투여; (2) 표적 조직 및 혈액에서 그 간극에서 항체의 축적; (3) 작은 분자 방사성 리간드의 투여; 및 (4)를 초과하는 방사성 리간드의 급속한 냄. 일부 경우에 3-8 이어 항체에 방사성 리간드의 생체 결찰은 추가적인 소거 에이전트는 항체의 배설을 촉진시키기 위해 단계 (2)와 (3) 사이에 주입된다 그 종양을 결합 아직 혈액에 남아 있습니다. (5)

대체로, TW를 말하기pretargeting 전략의 O 유형은 문학에서 가장 널리 있습니다. 모두 전임상 모델에서 성공적으로 검증되었지만, 그들은 또한 임상 적용을 방해 한 키 제한을 갖는다. 첫 번째 전략은 스트렙 타비 딘 - 복합 항체와 비오틴 - 수정 방사능 표지 사이의 높은 친화력에 의존; 그러나, 스트렙 타비 딘 - 수정 항체의 면역 원성은 번역과 관련하여 우려되는 문제로 입증되었습니다. 5,6,9,10 두 번째 전략은, 대조적으로, 암을 모두 결합하는 유전자 조작 된 특이 적 항체를 사용 후자의 경로가 확실히 창조적 인 반면 바이오 마커 항원과 작은 분자 방사성 동위 원소 표지 합텐. 3,11-14은 광범위한 적용은 시스템의 모듈 방식의 복잡성, 비용 및 부족에 의해 제한됩니다.

최근에는 개발 (역 전자 수요 딜스 - 알더 I에 기초를 pretargeted PET 이미징 방법을 게시EDDA) 트랜스 -cyclooctene (TCO) 및 테트라 (Tz 일 사이의 고리 화 반응;.에 의해 예시 그림 1) (11) 반응 자체가 수십 년 동안 알려져있다 동안은 IEDDA 화학은 클릭 화학 바이오 콘쥬 게이션 기술로 최근 몇 년 동안 르네상스를 경험하고있다 랄프 Weissleder, 조셉 폭스, 펩티드, 항체 및 나노 입자의 형광 이미지 등을 포함한 12-15 IEDDA의 고리가 설정의 넓은 범위에서 적용되었다. 다른 중에서 피터 콘티의 기의 매혹적인 작품뿐만 아니라 핵 이미징 .. 27 bioorthogonal 클릭 화학의 종류의 숫자 동안 - 비판적 - radiohalogens 및 radiometals 모두 16-26 결찰은 항복 높은 깨끗하고 빠른 (K 1> 30,000 M -1 초 -1), 선택하고, - 구리 촉매 아 지드 - 알킨 cycloadditions, 변형 승진 아 지드 - 알킨 cycloadditions, 그리고 슈타 우 딩거 LIG 손해 포함관리 포인트 -. 그것은 전체 유기체에서 응용 프로그램을 pretargeting에 매우 적합 IEDDA 화학을하게 빠른 반응 속도와 bioorthogonality의 고유 한 조합뿐만 아니라 bioorthogonal있는이 라인을 따라 28, 29, 그것의 최근 보고서 것이 중요합니다 우리의 실험실 pretargeting에 IEDDA 화학을 첫 적용되지 않았습니다. IEDDA와 pretargeted 영상의 첫 번째 보고서는 Rossin의 작업, 등에서 일어나 (111)에 표지 테트라를 사용하는 SPECT 방법론을 기능을 갖춘 30.

우리는 상술 한 바와 같이, pretargeting 방법은 네 가지 매우 간단한 단계 (그림 2). 손 프로토콜, 64 CU-NOTA 표지 된 방사성 리간드 및 테트라 huA33 항체의 TCO 변성 공액을 채용 대장 암 PET 이미징 pretargeted 전략을 설명한다. 그러나,이 방법의 궁극적 모듈화는 GR 중 하나입니다트랜스 -cyclooctene 잔기로서 eatest 자산은 비 내재화 항체에 추가 될 수 있고, 테트라 방사성 기자의 다양한 부착 될 수있다.

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Protocol

윤리 선언문 : 설명 생체 내 동물 실험의 모든 승인 된 프로토콜과 기념 슬로안 케터링 암 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 윤리적 지침에 따라 따라 수행 하였다.

의 Tz-BN-NOTA 1. 합성

  1. 작은 반응 용기에 600 μL의 NaHCO3 완충액 (0.1 M, pH를 8.1) 7 MG-NH 2 -Bn NOTA (1.25 X 10-2 밀리몰)을 용해. 용액의 pH를 확인합니다. 필요한 경우, CO 3 0.1 M 나트륨이 적은 분취 량을 사용하여 8.1로 용액의 pH를 조정한다.
  2. 1.7 ml의 microcentrifuge 관에 0.5 MG의 Tz-NHS (1.25 × 10 -3 밀리몰)에 NH 2 -Bn-NOTA 솔루션을 추가합니다.
    참고 : (Tz)를-NHS는 건식 칭량 또는 건조 DMF 또는 DMSO (<50 μL)의 원액에서 추가 할 수 있습니다.
  3. 생성 된 반응 용액을 RT에서 30 분 동안 반응하도록 허용가벼운 교반.
  4. 30 분 후, 반응이 -Bn NH-NOTA을 제거하는 역상 C 18 HPLC 크로마토 그래피를 사용하여 생성물을 정제. 의 Tz-NHS-BN과의 Tz-NOTA 가장 525 nm의 파장에서 모니터하면서 2 -Bn NH-NOTA는 254 nm의 파장에서 모니터 할 수있다.
    참고 : 체류 시간은 분명히 각 실험실 (펌프, 열, 튜브 등)의 HPLC 장비 설치에 크게 의존한다. 그러나, 예를 제시하는 경우 0의 기울기 : (100)를 MeCN이 / H 2 O는 100 (모두 0.1 % TFA와 함께) : 0의 MeCN / H 2 O를 통해 25 분 및 분석 4.6 × 250mm의 C (18) 열 사용 ,의 Tz-BN-NOTA, Tz 일-NHS 및 NH (2)의 체류 시간은 -Bn-NOTA 각각 약 15 분, 16.5 분, 10 분, 것이다. 생성물 일층 또는 반 제조용 또는 C 18 분 취용 HPLC 컬럼을 사용하여 여러 개의 실행 중의 다른 성분의 반응으로부터 정제 할 수있다. 1 H-NMR, 항문ytical HPLC 및 ESI-MS는 완료의 Tz-BN-NOTA 전구체의 순도를 확인하는 데 사용할 수있는 모든 방법이있다. (11)
  5. 액체 질소를 이용하여 수집 용 HPLC 용출액을 동결.
  6. 불투명 한 알루미늄 호일에 얼어 붙은 수집 튜브를 감싸.
  7. 동결 건조 선박 O에 얼어 붙은 포집 관을 배치 / N은 ​​HPLC 이동상을 제거합니다.
  8. -80 ° C에서 어둠 속에서 정제 된 제품 (고체 밝은 분홍색)을 저장합니다.
    참고 :이 절차의 허용 정지 점이다. 완료의 Tz-BN-NOTA 전구체는 이러한 조건 하에서 1 년 이상 안정하다.

huA33-TCO 면역 접합체 2. 준비

  1. 1.7 ml의 microcentrifuge 관에서, 1 ㎎ / ㎖ 건조 DMF에 TCO-NHS의 (2.7 mM)을 용액을 제조.
  2. 1.7 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에서, 2 ㎎ / ㎖의 인산 완충 생리 식염수를 1ml의 huA33 (13.3 μM) 용액의 pH 7.4 (0.01 M PO 4 3- 준비
  3. 작은 분취 량 0.1 M 나 2 CO 3 (<5 μL)을 사용하여, 8.8-9.0로 항체 용액의 pH를 조정한다. pH를 모니터링하는 미세 전극으로 pH 종이 또는 pH 측정기를 사용하고, pH가 9.0 이상 오르지 않도록주의하십시오.
  4. 항체 용액은 정확한 pH에서되면, 활성화 된 에스터 8 몰 당량에 대응하는 TCO-NHS 용액의 볼륨. 예를 들어, 2 ㎎ / ㎖ huA33 항체 용액 (1.33 × 10 -8 몰 huA33)의 1 ml의 1 ㎎ / ㎖ TCO-NHS 용액 (1.07 × 10 -7 몰 TCO-NHS)의 7.9 μl를 추가합니다. 용액의 부피 5 % DMF를 초과하지 마십시오.
  5. 부드럽게 microcentrifuge 관을 여러 번 반전하여 솔루션을 섞는다.
  6. 불투명 한 알루미늄 호일의 microcentrifuge 관을 감싸.
  7. 이 솔루션은 온화한 교반과 함께 실온에서 1 시간 동안 배양 할 수 있습니다.
  8. RT에서 1 시간 후, 사전 포장 된 일회용 SIZ를 사용하여 생성 된 면역 접합체를 정제전자 제외 탈염 열입니다. 보관시 컬럼에 존재하는 방부제를 제거하기 위해 공급자에 의해 설명 된 바와 같이 첫째, 크기 배제 열을 씻어. 그 후, 크기 배제 컬럼에 반응 혼합물을 추가 1.5 ㎖의 0.9 % 멸균 식염수와 열 린스,이어서 용 리제로서 0.9 % 멸균 식염수 2 ㎖를 사용하여 제품을 수집한다.
    참고 :이 단계는 2 ml의 솔루션으로 완성 된 huA33-TCO를 얻을 것입니다.
  9. 분광 광도계 UV-비스에서 얻어진 huA33-TCO의 농도를 측정한다.
  10. 높은 농도가 요구되는 경우, 50,000 분자량 컷 - 오프로 원심 필터 유닛을 이용 huA33-TCO 용액을 농축시킨다.
    주 : huA33 및 기타 잘 알려진 항체 (예를 들어, 베바 시주 맙, 트라 스투 주맙, 세툭시 맙 및 J591)의 다양한 집중되는 매우 관대 한 반면, 집계 및 침전이 다른 경우 농도에 따라 발생할 수 있음을 유의해야합니다. 연구진은이 proced 시도새로운 항체 올바는 문학 또는 항체를 집중할지 여부와 관련하여 문제가되는 항체의 자신의 지식을 신뢰해야합니다.
  11. 어둠 속에서 4 ° C에서 완성 된 huA33-TCO의 면역을 저장합니다.
    참고 :이 절차의 허용 정지 점이다. 완성 된 단클론 항체 접합체-TCO이 보관 조건에서 3 개월 이상 안정해야한다.

의 Tz-BN-NOTA 3. 64 구리의 방사선

참고 : 프로토콜의이 단계는 취급 및 방사능의 조작을 포함한다. 방사능과 다른 작업을 수행 - - 다음 단계를 수행하기 전에 연구자들은 자신의 집 기관의 방사선 안전 부서와상의해야합니다. 이온화 방사선에 대한 노출을 최소화하기 위해 가능한 모든 조치를 취합니다.

  1. 1.7 ml의 microcentrifuge 관에서 0.5 ㎎ / ㎖ (723 μM)의 Tz-BN-NOTA의 솔루션을 준비합니다.
  2. 1.7 ML의는 MicroC에서entrifuge 튜브, 0.2 M NH 4 OAC의 pH 5.5 완충액 400 μL에의 Tz-BN-NOTA 용액 (5 μg의) 10 μl를 추가합니다.
  3. 적절한 방사 화학 노트 유지의 관심에서 측정하기 전에 아래의 프로토콜 (3.4-3.8)에서 다음의 단계 후 투여 교정기를 사용하여 샘​​플에서 방사능의 양을 기록한다. 이 방사 화학적 수율의 정확한 결정에 도움이 될 것입니다.
  4. 의 Tz-BN-NOTA 솔루션 (64) 구리의 2,000 μCi를 (74 MBq의)를 추가합니다.
    주 : 일반적으로, [64의 Cu]의 CuCl 2는 0.1 N HCl을 소량 (<30 μL)에 공급되고, 따라서 단지 소량은 (<10 μL)이 스톡 용액은 방사성 표지 반응에 필요하다. [64의 Cu]의 CuCl 2 콘텐츠의 많은 양이 필요할 경우, 방사성 표지 반응은 전체 반응 부피를 증가 관대하다. 그러나, 방사성 표지 반응 용액의 pH를 보장하기 위해주의 깊게 모니터링되어야이는 pH가 4.0 이하로 떨어지지 않습니다.
  5. 이 솔루션은 온화한 교반과 함께 실온에서 10 분 동안 품어하도록 허용합니다.
  6. 인큐베이션 10 분 후, 역상 C 18 HPLC 크로마토 그래피를 사용하여 생성물을 정제. 체류 시간은 분명히 각 실험실 (펌프, 열, 튜브 등)의 HPLC 장비 설치에 크게 의존한다. 그러나, 예를 제공하는 경우의 구배 5:95의 MeCN / H 2 O 95 (모두 0.1 % TFA 사용) : 5의 MeCN / H 2 O 15 분 동안 사용하는, 64 CU-Tz-의 체류 시간 무료, 복합체를 형성하지 못한 64 Cu를 약 2-4 분에서 용매 전면으로 용출 반면 BN-NOTA은 약 9.8 분이어야합니다.
  7. 회전 증발기를 사용하여, HPLC 용 출제를 제거.
  8. 0.9 % 멸균 식염수에 64 CU-의 Tz-BN-NOTA 생성물을 재용.
    주 : (64) 구리의 12.7 시간의 물리적 반감기를 고려할 때,이 절차의 허용 정지 점 없습니다. 64의 합성 CU-의 Tz-BN을-NOT 수행방사성 리간드의 주입 직전에, 스텝 4.5 즉시 3.7 단계에 따르십시오.

생체 Pretargeted PET 영상 4.

참고 : 프로토콜 제 3 절에서와 같이, 프로토콜의이 단계는 취급 및 방사능의 조작을 포함한다. 다음 단계를 수행하기 전에 연구자들은 자신의 집 기관의 방사선 안전 부서와상의해야합니다. 이온화 방사선에 대한 노출을 최소화하기 위해 가능한 모든 조치를 취합니다.

  1. 그리고 여자를 누드 마우스 피하 이식 1 × 6 SW1222 대장 암 세포에서하는 것은 이러한 (9~12일 접종 후) 100-150mm 3 이종 이식으로 성장 할 수 있습니다. (11)
  2. 0.9 % 멸균 식염수에 0.5 ㎎ / ㎖의 농도로 제 2 프로토콜로부터 huA33-TCO 용액의 분취 액을 희석한다.
  3. 이종 - 함유 마우스의 꼬리 정맥 내로 huA33-TCO 용액 200 μL (100 μg의)을 주입.
  4. 마우스의 종양에서 huA33-TCO의 축적을위한 24 시간을 허용합니다.
  5. 0.9 % 멸균 식염수에서 1.5 mCi의 / ml의 농도로 64 CU-의 Tz-BN-NOTA 방사성 리간드를 희석.
  6. 의 꼬리 정맥 내로 (6.7 MBq의 / nmol의 특정 활성을 가정하면, 64 CU-의 Tz-BN-NOTA 1.6 nmol의; 11.1 MBq 내지 300 μCi를) 64 CU-의 Tz-BN-NOTA 방사성 리간드 용액 200 μl를 주입 이종 이식 베어링 쥐.
  7. 촬상 원하는 시점에서 (예를 들어, 2, 6, 12, 또는 24 시간 후 분사), 2 % 이소 플루 란 마취 마우스 : 산소 가스 혼합물.
  8. 작은 동물 PET 스캐너의 침대에 마우스를 놓습니다. 산소 가스 혼합물 : 1 % 이소 플루 란을 이용하여 스캔하는 동안 마취를 유지한다. 스캐너 침대에 동물을 배치하기 전에, 토​​우 - 핀치 방법을 사용하여 마취를 확인하고 마취 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈 연고 수의학 적용.
  9. 정적 통해 마우스 PET 데이터를 획득350-700 keV의 에너지의 창 6 나노초의 일치 타이밍 윈도우를 사용하여 2000 만 일치 이벤트 최소 스캔. 이미지의 인수를 완료 한 후, 무인 마우스를 벗어나지 않아이 의식을 회복 할 때까지 다른 마우스와 케이지로 변경하지 마십시오.

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Representative Results

실험의 처음 세 단계 -의 Tz-BN-NOTA, huA33에 TCO의 접합의 합성과의 Tz-BN-NOTA의 방사성 표지는 (도 3 및도 4) 구성 - 매우 안정적. 상기 절차의 경우의 Tz-BN-NOTA 구조체는 고 수율 및 고순도로 합성 하였다. ~ huA33 항체는 4.2 ± 0.6 TCO / 단클론 항체로 수정하고, Tz 일-BN-NOTA은> 85 % 붕괴 보정 수율, 그리고 특정 활동> 99 % 방사 화학적 순도 정제 된 방사성 리간드를 얻을 수 (64) 구리와 방사성 동위 원소 표지이었다 6.7 MBq의 / nmol의 (그림 5). huA33-TCO 접합체의 반응성 및 테트라 방사선 리간드 방사성 순간 박막 크로마토 그래피 (ITLC)를 사용하여 시험 할 수있다. huA33 - TCO의 약간의 과잉 (6.7 MBq의 / nmol의 특정 활동을 가정, 0.55 nmol의 100 μCi를)이 방사성 동위 원소 표지 된 테트라을 혼합하여 수행됩니다 (50 μg의 0.66 nmol의)의 pHosphate 완충 식염수, 5 분 동안 실온에서 (pH 7.4)로 이루어졌다. 이어서, 용액은 약 1 μCi를 역상 C 18 TLC 플레이트 상에 발견하고 건조시킨다. H 2 O, 및 플레이트 방사성 TLC 플레이트 판독기를 사용하여 분석 : 1의 MeCN : TLC (9)에서 실행된다. 클릭 반응이 계획대로 작동하면, 결찰 (64) CU-NOTA-A33는베이스 라인에 남아 있어야한다; 만약, 다른 한편으로는, 반응이 실패, 프리 CU-64의 Tz-BN-NOTA은 용매 또는 전면 근처에 나타날 것이다.

위에서 설명한 프로토콜, 생체 내 이미징 실험에 이동, A33 항원 발현, SW1222 대장 암 이종 이식 베어링를 누드 마우스를 사용 하였다. 급성 생체 내 분포 (N = 5 시점마다) 및 PET 이미징 모두 (N = 12) 실험 pretargeting 전략이 우수한 이미지 콘트라스트와 높은 종양 대 배경 활성 비 (도 6과 대장 암 종양의 성장을 서술 할 수 있다고 밝혀). 종양의 64 CU-의 Tz-BN-NOTA의 흡수는 초기 시점에서 알 수있다 : 3.5 % ± 0.6 %의 ID / g 각각 1 시간과 4 시간의 포스트 분사, 0.6 %의 ID / g ± 4.1 %. 그러나, 이러한 초기 점에서, 그것은 쉽게 마우스 (의 장관을 통해 방사능 비운의 양에 의해 가려 11.9 % 4.4 % ID / g 및 대변에 3.4 %의 ID / g ± 8.8 % 1 시간과 4에서 ± 시간 파이, 각각). 몇 시간의 과정 동안, 초과 방사성 리간드 (1.4 % ± 0.5 % ID / g 24 시간 파이에서) 배설물을 통해 지우고 종양는 이미지 (4.0 % ± 0.9 %의 ID / g에서 가장 눈에 띄는 기능에서됩니다 24 시간 PI). 이러한 나중 시점에서, 종양은 잘 묘사 된 이미지에서, 그리고 종양 대 비 배경 활성은 매우 높다되고; 12 시간 PI 및 27.0 ± 7.4에서 24 시간 PI 당연히 64 CU-의 Tz-BN-NOTA, 비 - 특이 항체를 사용하여 대조 실험, O에서 26.6 ± 6.6 근육 비율 : 예를 들어, 전략은 종양을 수득R huA33 결합 TCO 부분없이 모든 종양에 최소한의 흡수의 결과.

다음에서 부연되는 바와 같이,이 전략 pretargeting - 모든 pretargeting 전략 등 - 새로운 항체 / 항원 시스템에 적용될 때 최적화를 필요 변수를 가지고있다. 가장 중요한 두 주입 단클론-TCO 구조물의 질량 및 단클론-TCO 제물의 주입 및 방사성 리간드의 분사 사이의 간격의 길이이다. 단클론 항체 - TCO 복합체의 양이 너무 높거나 주사 간격 시간이 너무 짧은 경우, 혈액 내 자유 단클론-TCO의 양은 올라간다 클릭 반응의 가능성은 혈액보다는 종양 증가에서 발생. 예를 들어 64 구리 / huA33 시스템 huA33 (100 μg의보다는) 또는 12 시간 간격 시간 (24 시간이 아닌)의 사용은 t μg의 두드러진 증가의 결과 (300)의 두 투여, 여기서 논의마우스의 심장 (각각 그림 7a 및도 7b)에서 볼 방사능 그는 양. 이른 시점에서 즉 종양 흡수의 양에 의해 도시 된 바와 같이 두 경우 모두에서, 클릭 반응은 아직 명확하게 종양에서 발생되고; 그러나, 혈중 방사성 표지 항체의 형성은 또한 자명하다. 이 혈액에 형성된 방사성 표지 항체가 여전히 결국 종양 길을 찾는 것이기 때문에 기각 유혹하지만, 이것은 어느 정도는 종양에 도달시켜 인상하기 전에 방사성 표지 된 항체를 천천히 순환 같이, pretargeting 방법론을 사용하는 목적은 패배 비 표적 장기 선량률. 너무 적 항체가 사용되는 경우, 반대로, 종양 흡수의 양이 자연스럽게 겪을 것이다. 지나치게 오랜 시간 간격은 또한 느린 항체 내재화, transcyclooctene 이성질체, 또는 항체 / 항원 발​​산의 결과로서 종양 흡수 수준을 감소시킬 수있다. 일의 진단ESE 문제는 더 도전이며 PET 데이터의 검사를 통해 간단하게 달성 될 수 없다. 분명히, 섬세한 균형이 유지되어야한다. 따라서, 새로운 항체 / 항원 시스템에이 전략을 적용하려고 시도하는 모든 연구자는 시작 지점으로 단클론 항체 - TCO 구조 (≥ 200 μg의) 짧은 간격 시간 (≤ 24 시간) 많은 양을 사용하고 거기에서 최적화하는 것이 좋습니다.

그림 1
그림 1. 역 전자 수요 딜스 - 알더 테트라과 transcyclooctene 사이 [4 + 2] 고리 클릭 결찰.

그림 2
그림 2. pretargeting 방법론의 네 단계의 그림은.이 그림은 원래 JNM에 발표 된 연구에 기초한다. Zeglis, BM 등. pretargeted PET 영상 전략 BAS핵 의학의 에드 bioorthgonal 딜스 - 알더 클릭 화학에. 저널. 54, 1389년부터 1396년까지 (2013). © 2013 핵 의학 및 분자 영상의 선급, Inc.는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. TCO-NHS와 huA33의 수정을위한 계획.

그림 4
그림 4. 합성과의 Tz-BN-NOTA의 64 구리의 방사선에 대한 계획은.이 그림은 원래 JNM에 발표 된 연구에 기초한다. Zeglis, BM 등. bioorthgonal 딜스 - 알더에 따라 pretargeted PET 영상 전략은 화학을 클릭합니다. 저널 핵 의학. (54) 1389-1396의 (2013). &# 169; 2013 핵 의학 및 분자 영상의 선급, Inc.는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5. 정제 (64) CU-의 Tz-BN-NOTA의 라디오-HPLC 추적.

그림 6
64 CU-의 Tz-BN-NOTA 그림 6. PET 이미지 / A33-TCO는 전략을 pretargeting. 마우스 피하 SW1222 이종 이식에 꼬리 정맥 주입을 통해 huA33-TCO (100 μg의)을 투여 하였다 (1백-1백50밀리미터 3) 베어링. 24 시간 후, 동일한 마우스는 64 CU-의 Tz-BN-NOTA 꼬리 정맥 주사를 통하여 (10.2-12.0 MBq의 [275-325 μCi를를]) 투여하고,이어서 투여 후 2, 6, 12, 18 시간을 묘화 방사성 의약품. TRansverse (위)과 관상 (아래) 평면 이미지는 종양의 중앙을 교차. 분명 12 및 18 시간 주입 후 모든 비 표적 조직에서 묘사 종양 (흰색 화살표)를 떠나 12 시간으로 크게 명확한 초기 시점 (즉, 2, 6 시간)의 장내 흡수의 높은 수준. 이 그림은 원래 JNM에 발표 된 연구에 기초한다. Zeglis, BM 등. bioorthgonal 딜스 - 알더에 따라 pretargeted PET 영상 전략은 화학을 클릭합니다. 저널 핵 의학. (54) 1389-1396의 (2013). © 2013 핵 의학 및 분자 영상의 선급, Inc.는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
그림 차선 pretargeting 실험 7. PET 영상. (A) 마우스의 BEA링 피하 SW1222 이종 이식 (100-150mm 3, 화살표)를 꼬리 정맥 주입을 통해 huA33-TCO (100 μg의)을 투여 하였다. 12 시간 후, 동일한 마우스는 64 CU-의 Tz-BN-NOTA (10.2-12.0 MBq의 [μCi를 275-325]) 꼬리 정맥 주사를 투여 하였다. (B) 피하 SW1222 이종 이식 (100~150mm 3, 화살표)가있는 마우스는 꼬리 정맥 주입을 통해 A33-TCO (300 μg의)을 투여 하였다. 24 시간 후, 동일한 마우스는 64 CU-의 Tz-BN-NOTA (10.2-12.0 MBq의 [μCi를 275-325]) 꼬리 정맥 주사를 투여 하였다. 두 경우, 마우스는 64 CU-의 Tz-BN-NOTA의 주사 후 12 시간을 이미지화 하였다. 양쪽 패널, 횡 방향 (위쪽)와 관상 (하단)에는 평면 화상이 종양의 중심을 교차한다. pretargeting 전략 명확 두 경우 종양을 묘사하지만, 이러한 이미지의 양쪽의 결과는도 6에 표시되는 것과 비교하여 표준 이하이다. 두 7a 및 7b에, 거기심장의 배경 활동 흡수 상당한 양. 도 7a의 조건 하에서, 이는 대부분의 종양에 국산화 huA33-TCO 구성되는 소정의 시간이 충분하지 않은 결과이다. 도 7b의 조건에서,이 가능성이 너무 많은 huA33-TCO를 주입 주사 후 혈액에서도 24 시간 순환 여전히 과잉 면역을 갖는 결과이다. 이 그림은 원래 JNM에 발표 된 연구에 기초한다. Zeglis, BM 등. bioorthgonal 딜스 - 알더에 따라 pretargeted PET 영상 전략은 화학을 클릭합니다. 저널 핵 의학. (54) 1389-1396의 (2013). 2013 핵 의학 및 분자 영상의 선급, Inc.는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 PET pretargeted 촬상 전략의 주요 장점은 직접 표지 된 항체에 의해 생성 된 배경 방사선 량의 단지 일부만 타겟 간 배경 화상의 콘트라스트를 종양의 윤곽을 할 수 있다는 것이다. 예를 들어, 여기에 설명 된 대장 암 이미징 시스템에서, 급성 생체 분포 실험의 데이터는 표지 된 64 CU-NOTA-huA33 89 ZR-DFO-huA33 함께 64 Cu- 기 pretargeting 전략 선량 계산을 수행하는 데 사용 하였다. 임상 적으로 더 관련 ZR (89) 표지 된 항체와 비교할 때 이러한 계산 명확 특히 pretargeting 시스템의 선량 이점을 예시한다. 0.4162 mSv를 / MBq의 : 89 ZR-DFO-huA33의 30 배 이상 높은 반면 pretargeting 전략의 유효 선량은 0.0124 mSv를 / MBq의입니다. (64)에 비교할 때 pretargeting의 선량 이익을 덜 두드러진다 구리 표지ntibody (0.0359 mSv를 / MBq의),하지만 유리한 효과는 여전히 존재합니다.

이 방법론 pretargeting IEDDA의 가장 중요한 장점 중 하나는 모듈성이다 : 트랜스 -cyclooctene가 내재화되지 않은 항체에 추가 될 수 있으며,화물의 매우 다양한 테트라에 부착 될 수있다. 사실,이 프로토콜을 작성하기위한 우리의 주요 동기는 다른 항체 / 항원 / 방사성 동위 원소 시스템과이 방법을 사용하는 것이 다른 연구 그룹을 활성화하는 것입니다. 그 라인을 따라, 우리는 다른 시스템에 대해이 방법을 채택 할 때 연구자 고려해야 할 문제들을 해결하는 것이 중요합니다 생각합니다.

먼저, 항체의 선택은 대단히 중요하다. 간단히 말해, 항체는 비 내면화 또는 매우 느린 속도로 내면화해야합니다. 이상적인 운동 매개 변수가 아직 결정되지 있지만, 항체와 반응 트랜스 -cyclooctene 그것은에 남아 있어야 수행종래의 방사성 리간드 주입 항체의 내재화 및 격리 용 셀의 외측이 극적 생체 클릭 반응의 개수를 감소시킬 것이다. 여기에 설명 된 시스템에서, 항체 huA33 대상 및 A33 항원은 모든 대장 암의> 95 %에서 발현 경막 당 단백질에 결합한다. 중요한 것은, 심지어 목표에 결합 후, huA33 항체 / 항원 복합체 일 동안 세포 표면에 남아있는 것으로 나타났다. 31-33 비 내재화 항체의 필요성 전략 한정시피이지만, 비 내면화 항체의 다양한, Rossin가, 등. 우수한 pretargeting 일을 살펴 보았다 아마도 특히 TAG72 타겟팅 CC49 항체 알려져있다. 30,34,35

둘째,이 pretargeting 전략은 - 다른처럼 - 중요한 최적화가 필요합니다. 의 신원에 추가ntibody 및 테트라 방사성 리간드는 두 가지 중요한 변수는 고려되어야한다 : 주입 된 항체의 양과 항체와 방사성 리간드의 주사 사이의 시간 간격. 우리는 상기 대표 결과 섹션 모두 이러한 변수를 언급했지만, 어느 너무 항체 또는 너무 짧은 인터벌 시간은 주입시에 혈액에 남아, 단클론 항체 - TCO 접합체 상당량 사용하는 경우, 간단히 말하지만 방사성 리간드의. 이는 다시, 생체 클릭 결찰 만 시간에 걸쳐 서서히 종양에 축적된다 순환 방사성 표지 항체 형성, 혈액보다는 종양에서 발생 될 것이다. 너무 작은 항체 또는 너무 긴 시간 간격 중 하나가 사용된다 반대로, 종양 방사능의 최종 금액은 차선책이 될 것입니다. 우리의 의견으로는, 직접 표지 된 항체의 itse으로, 바람직하게는 급성 생체 분포 실험을 엄격한 이미징을 수행하거나,만약에 어떤 pretargeting 실험 이전에 필요한 항체의 양과 항체 구조의 초기 주입 후 이상적인 시간 간격에 대해 배울 수있는 가장 신뢰할 수있는 방법입니다. 방사성 표지 된 항체의 다른 분사 질량 들어, 이들 실험은 실험 pretargeting 가장 유망한 조건의 선택을 허용 혈액으로부터 radioimmunoconjugate의 클리어런스 및 종양에서의 축적 된 데이터 양에 콘크리트를 제공 할 것이다.

적합한 방사성 동위 원소를 선택할 때 마지막 테트라 기반 방사성 리간드의 약물 동력학이 고려되어야한다. 여기에 설명 된 시스템에서, 방사성 표지의 Tz-BN-NOTA 잔기는 가장 상보 물리 반 64의 Cu 양전자 방출 동위 원소를 만들고, 약 3-4 시간의 생물학적 반감기 소화관을 통해 신체로부터 배설 생활. 그것이 번째와 호환되도록 불행히도, 테트라 잔기의 생물학적 반감기가 너무 길다전자는 더 빠르게 방사성 (68) 조지아 (t 1/2 = 68 분) 부패. 과량의 방사성 리간드가 본체로부터 제거되기 전에 완료이 경우, 종양 내 방사능은 어떤 여러 반감기 통해 붕괴된다. 결과적으로, 이미지는 종양 대 배경 활성 비가 낮게 유지 이른 시점에서 취득되어야 할 것이다 (36)는 이상적으로는, 테트라에 radioligands 차세대가 설계 될 것이다 -. 아마도 PEG 화, 당화 또는 다른 방법을 통해 - 배설 더 빨리 몸에서. 이는 다시 더 pretargeted 이미징 전략의 선량 혜택을 강화할 등 68 Ga 및 18 F로 더 빠르게 부패 방사성 동위 원소와 방사성 표지를 허용합니다. 궁극적으로, 연구자들은 이미징을위한 다른 방사성 동위 원소를 사용하기 위해이 기술을 적응으로 (예를 들어, 124 I, 111 등 18 F, 89 ZR 68 가인,) 예를 들어, 또는 치료 (, 177 루 225 AC, 125 I 등), 테트라 새로운 계 리간드는 방사성 표지 또는 다른 킬 레이터 보철기를 도입하기 위해 개발 될 필요가있다. 이러한 새로운 구조의 약물 동태의 철저한 조사는 리간드의 통관 특성 및 방사성 핵종의 물리적 반감기 사이의 유리 일치를 보장하는 데 필수적이다.

결국, 우리는 매우 다른 연구자들은이 pretargeting 기술의 약속을 확인하고 새로운 항체 / 항원 시스템을 사용하는 것이 바랍니다. 전항이 적응 과정은 항상 간단하지 않을 수 있다는 설명하지만,이 방법은 넘어 핵 이미징에 상당한 영향, 대상 방사성 핵종 치료 등을 가질 수있는 우리의 믿음입니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetrazine NHS Ester Sigma-Aldrich 764701 Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester Sigma-Aldrich 764523 Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA Macrocyclics B-601 Store at -80 °C

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