检测和可视化DNA损伤诱导的蛋白质复合物悬浮细胞培养使用邻近连接测定
Summary
在这里，证明了原位邻近连接测定（PLA）如何可以用于检测和可视化暴露于基因毒性应激的悬浮细胞培养物中ATM和p53之间的直接蛋白质 – 蛋白质相互作用。
Abstract
DNA损伤反应协调自发发生的DNA损伤的修复，由遗传毒性应激引起，或出现在淋巴细胞中程序性DNA断裂的上下文中。共济失调 – Telangiectasia突变激酶（ATM），ATM-和Rad3相关激酶（ATR）和DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PKcs）的催化亚基是首先在DNA损伤诱导时被激活，并且是控制DNA修复，凋亡和细胞存活的网络的中央调节剂。作为肿瘤抑制途径的一部分，ATM和ATR通过磷酸化激活p53，从而调节p53的转录活性。 DNA损伤也导致所谓的电离辐射诱导灶（IRIF）的形成，其代表DNA损伤传感器和在DNA损伤部位积聚的修复蛋白质的复合物，其通过荧光显微镜显现。然而，蛋白质在IRIF中的共定位并不一定意味着d直接的蛋白质 – 蛋白质相互作用，因为荧光显微镜的分辨率是有限的。
原位接近连接测定（PLA）是一种新颖的技术，可以以前所未有的特异性和灵敏度直接显示细胞和组织中的蛋白质 – 蛋白质相互作用。该技术基于与感兴趣的蛋白质结合的特异性抗体的空间接近。当询问的蛋白质在〜40nm内时，扩增反应由与抗体缀合的寡核苷酸引发，扩增产物通过荧光标记显现，产生对应于相互作用蛋白质的亚细胞位置的信号。使用ATM和p53之间建立的功能相互作用作为示例，在此证明PLA如何可用于悬浮细胞培养物中以研究作为DNA损伤反应的组成部分的蛋白质之间的直接相互作用。
Introduction
DNA损伤触发高度受限制的一系列事件，涉及蛋白质 – 蛋白质相互作用和翻译后修饰，可确保DNA的有效快速修复，从而保护基因组完整性1 。通常，通过（共聚焦）荧光显微镜监测所谓的电离辐射诱导病灶（IRIF）的形成，研究暴露于电离辐射的细胞中的DNA修复。许多DNA修复和DNA损伤感应蛋白形成IRIF，其代表在染色质位点成核的蛋白质复合物，其维持DNA损伤2,3 。随着时间的推移，IRIF的位置和分辨率为DNA修复的时空组织提供了重要的见解，并且可能表明不同DNA修复途径的参与。损伤的DNA损伤和细胞周期阶段的性质决定了哪个DNA修复途径被激活。佛 r实例，在积极参与DNA复制（S期）的细胞中，同源重组（HR）是显性DNA修复途径，而在细胞周期的G1-或G2 / M期细胞中，同源末端连接（NHEJ）修复途径占优势。 DNA损伤后的最早事件之一是激活DNA损伤感应激酶共济失调血管扩张 – 突变蛋白（ATM），其主要在细胞周期的G1-和G2 / M期活跃并调节NHEJ，和共济失调血管扩张症和Rad3相关蛋白（ATR），其通过激活HR作用于S期。 ATM和ATR都是非常多效的激酶，磷酸化参与DNA修复，细胞死亡和存活的许多蛋白质4 。已经显示两种激酶在暴露于基因毒性应激后磷酸化并激活肿瘤抑制蛋白p53，表明这些激酶是关键肿瘤抑制信号轴的上游介质“xref”> 5，6 。
IRIF的形成和组成通常通过使用双色免疫荧光染色和显微镜测定不同蛋白质的共定位来评估，然而，并非所有作为修复蛋白复合物的蛋白质形成IRIF，这限制了该方法的适用性。此外，（共焦）免疫荧光显微镜受光衍射性质的限制，导致约200-300nm的相当差的空间分辨率，超过大多数亚细胞结构的大小，其基本上禁止蛋白质 – 蛋白质相互作用的直接询问分子水平。因此，通过（共焦）荧光显微镜检测的免疫荧光染色模式的共定位不一定表示直接的蛋白质 – 蛋白质相互作用。最近，已经开发了新的超分辨率技术，如三维结构照相显微镜（3D-SIM） 7 ，成功应用于纳米尺度细胞研究53BP1和BRCA1 IRIF形成，揭示了共聚焦激光扫描显微镜无法检测到的这些蛋白质的空间分布特征。
可以使用其他几种方法来检测体内的蛋白质 – 蛋白质相互作用，例如共免疫沉淀，下拉法和酵母双杂交筛选方法。然而，这些技术相当繁琐，需要大量的细胞或蛋白质或涉及蛋白质的过表达，其引入实验工件。最近，已经开发了一种新技术，其允许原位 （ 即在细胞和组织中）的蛋白质 – 蛋白质相互作用的可视化和定量，称为邻近连接测定（PLA） 9,10 。镨通过与寡核苷酸（所谓的PLA探针）缀合的二级抗体检测识别感兴趣的两种蛋白质的重要抗体。如果两种不同的二级抗体由于被第一抗体识别的蛋白质之间的相互作用而足够接近，则缀合的寡核苷酸杂交并连接形成封闭的环状DNA底物。随后通过滚环扩增扩增此圆形底物，并用荧光染料缀合的互补寡核苷酸显色。使用PLA，蛋白质 – 蛋白质相互作用的亚细胞定位被保留，因为荧光标记的滚环扩增产物保持附着于PLA探针。基于抗体直径约为7-10nm 11的发现，该测定法的分辨率<50nm。只有两对抗体（primary + secon）才能进行滚环扩增dary）在由其大小（10 + 10 + 10 + 10 = 40nm）定义的周界内物理相互作用。信号放大步骤增加了PLA测定的灵敏度，并且能够检测到几乎不表达的蛋白质的相互作用。 PLA产生可以在每个细胞基础上量化的点状，类似焦点的信号模式，由此可以评估蛋白质 – 蛋白质相互作用中的细胞内和细胞间变化。
DNA修复复合物和IRIFs的形成和组成主要在贴壁细胞系如人骨肉瘤上皮细胞系U2OS，人胚胎肾细胞系HEK293和视网膜色素上皮细胞系RPE-1中进行研究，生长和易转染。使用诸如淋巴样和骨髓细胞系的悬浮细胞培养物不太频繁，因为它们不易于转染，并且通常不粘附到盖玻片上，因此需要额外的/替代的eps成像。然而，DNA损伤的解决方案在淋巴样和骨髓恶性肿瘤的情况下非常相关，因为DNA损伤反应经常受到这些肿瘤中的基因组（驱动）畸变的影响，在正常淋巴和骨髓的恶性转化中起关键作用（祖细胞） 12,13,14 。
该协议描述了如何在悬浮细胞培养物中诱导DNA损伤后，如何使用PLA来评估和定量蛋白质 – 蛋白质相互作用。在这里，执行PLA以确定和可视化在诱导经历G1期细胞周期停滞的人B细胞白血病细胞中的DNA损伤时ATM和p53之间的相互作用。值得注意的是，本文提出的方案并不限于研究在G1停滞的白血病细胞中的ATM和p53相互作用，而且还可以用于其他蛋白质 – 蛋白质相互作用在各种细胞类型和悬浮细胞培养物中。
Protocol
Representative Results
Discussion
在本报告中，证明PLA可用于确定和可视化悬浮细胞培养物中蛋白质之间的特异性相互作用。值得注意的是，这里描述的方案不限于DNA修复复合物的研究，而且还适用于可视化和定量悬浮细胞培养物中的其他蛋白质 – 蛋白质相互作用。显示当暴露于DNA损伤诱导剂时，ATM激酶与G1-阻滞的BCR-ABL + B-ALL细胞中的磷酸化p53相互作用。以前，我们使用PLA技术来表明ATM和FOXO1转录因子在BCR-ABL + B-ALL细胞中相互作?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Guikema实验室的研究由荷兰科学研究组织（VIDI授权016126355）和“Stichting Kinderen Kankervrij”KiKA（项目252）的创新研究奖励计划资助。
Materials
| BV173 cell line | DSMZ | AC-20 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| SUP-B15 cell line | DSMZ | ACC-389 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco (Life Technologies) | 21980-032 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich | F7524 | lot #: 064M3396 |
| L-glutamine | Gibco (Life Technologies) | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 15140-122 | |
| imatinib methanesulfonate | LC Laboratories | I-5508 | Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution |
| neocarzinostatin | Sigma Aldrich | N9162 | Mutagenic/teratogenic, handle with care |
| KU55933 | Selleckchem | S1092 | Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution |
| Starfrost Microscopy Slides | Waldemar Knittel | VA11200 003FKB | |
| PAP pen liquid blocker | Sigma Aldrich | Z377821-1EA | |
| Cytospin funnel | Q Path Labonord SAS | 003411324 | |
| Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit | Sigma Aldrich | DUO92105 | Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green |
| goat-anti-ATM | Bethyl Laboratories | A300-136A | PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies |
| rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 | Cell Signaling Technology | 9284 | We succesfully used lot #9284-4 in our studies |
| Vectashield antifading mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Vectashield antifading mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Also available from various other vendors |
References
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