Обнаружение и визуализация ДНК-индуцированных белковых комплексов в суспензионных клеточных культурах с использованием анализа лигирования близости
Summary
Здесь показано, как анализ in situ Proximity Ligation Assay (PLA) может использоваться для обнаружения и визуализации прямых белково-белковых взаимодействий между АТМ и р53 в культурах суспензионных клеток, подверженных генотоксическому стрессу.
Abstract
Ответ на повреждение ДНК организует восстановление повреждений ДНК, которые происходят спонтанно, вызваны генотоксическим стрессом или появляются в контексте запрограммированных разрывов ДНК в лимфоцитах. К числу первых, которые активируются при индукции повреждения ДНК, относятся мутантная киназа Ataxia-Telangiectasia (ATM), ATM- и Rad3-родственная киназа (ATR) и каталитическая субъединица ДНК-зависимой белковой киназы (DNA-PKcs). Центральные регуляторы сети, которые контролируют восстановление ДНК, апоптоз и выживаемость клеток. В рамках подавляющего опухоль пути АТМ и АТР активируют р53 через фосфорилирование, тем самым регулируя транскрипционную активность р53. Повреждение ДНК также приводит к образованию так называемых очагов, индуцированных ионизирующим излучением (IRIF), которые представляют собой комплексы датчика повреждения ДНК и восстанавливающие белки, которые накапливаются в местах повреждения ДНК, которые визуализируются с помощью флуоресцентной микроскопии. Однако совместная локализация белков в IRIF не обязательно подразумевает dПрямое белково-белковое взаимодействие, поскольку разрешение флуоресцентной микроскопии ограничено.
In situ Proxyimity Ligation Assay (PLA) – это новый метод, который позволяет осуществлять непосредственную визуализацию белково-белковых взаимодействий в клетках и тканях с беспрецедентной специфичностью и чувствительностью. Этот метод основан на пространственной близости специфических антител, связывающихся с представляющими интерес белками. Когда опрошенные белки находятся в пределах ~ 40 нм, реакция амплификации инициируется олигонуклеотидами, которые конъюгированы с антителами, и продукт амплификации визуализируется флуоресцентной мечением, что дает сигнал, который соответствует субклеточному расположению взаимодействующих белков. Используя установленное функциональное взаимодействие между АТМ и р53 в качестве примера, здесь показано, как PLA можно использовать в культурах суспензионных клеток для изучения прямых взаимодействий между белками, которые являются неотъемлемыми частями ответа на повреждение ДНК.
Introduction
Ущерб ДНК вызывает высокорегулярную последовательность событий, включающих белково-белковые взаимодействия и посттрансляционные модификации, которые обеспечивают эффективный и быстрый ремонт ДНК, тем самым защищая геномную целостность 1 . Как правило, репарация ДНК изучается в клетках, подвергнутых воздействию ионизирующего излучения, путем мониторинга образования так называемых ионизирующих излучений фокусов (IRIF) с помощью (конфокальной) флуоресцентной микроскопии. Многие репарации ДНК и ДНК, чувствительные к повреждениям ДНК, образуют IRIF, которые представляют собой белковые комплексы, которые зарождаются на участках хроматина, поддерживающих повреждение ДНК 2 , 3 . Расположение и разрешение IRIF со временем дают важное представление о пространственно-временной организации репарации ДНК и могут указывать на участие различных путей восстановления ДНК. Характер повреждения ДНК и стадии клеточного цикла, в которой достигается повреждение, определяет, какой путь восстановления ДНК активирован. Fo Например, в клетках, активно участвующих в репликации ДНК (S-фаза), гомологичная рекомбинация (HR) является доминирующим способом восстановления ДНК, тогда как в клетках в G1- или G2 / M-фазе клеточного цикла, Преобладает путь восстановления гомологичного концевого соединения (NHEJ). Одним из ранних событий после повреждения ДНК является активация ДНК-чувствительных киназ Ataxia Telangiectasia-Mutated protein (ATM), которая в основном активна в G1- и G2 / M-фазах клеточного цикла и регулирует NHEJ, И Ataxia Telangiectasia и Rad3-родственный белок (ATR), который действует в S-фазе путем активации HR. Оба АТМ и АТР представляют собой плейотропные киназы, которые фосфорилируют многие белки, которые участвуют в репарации ДНК, гибели клеток и выживании 4 . Было показано, что обе киназы фосфорилируют и активируют белок-супрессор опухоли р53 после воздействия генотоксического стресса, указывая, что эти киназы являются предшественниками медиаторов основной оси подавления опухолей"Xref"> 5 , 6 .
Образование и состав IRIF обычно оценивают путем определения совместной локализации различных белков с использованием двухцветного иммунофлуоресцентного окрашивания и микроскопии, однако не все белки, которые являются частью ремонтных белковых комплексов, образуют IRIF, что ограничивает применимость этого подхода. Кроме того, (конфокальная) иммунофлуоресцентная микроскопия ограничивается дифракционными свойствами света, что приводит к довольно плохим пространственным разрешением около 200-300 нм, превышающим размер большинства субклеточных структур, что существенно запрещает прямой опрос белково-белковых взаимодействий при Молекулярный уровень. Таким образом, совместная локализация образцов окраски иммунофлюоресценции, обнаруженная (конфокальной) флуоресцентной микроскопией, необязательно является показательной для прямых белково-белковых взаимодействий. Недавно были разработаны новые технологии с высоким разрешением, такие как трехмерные структуры(3D-SIM) 7 , который был успешно использован для изучения формирования IRIF 53BP1 и BRCA1 на наномасштабных деталях, выявляя характеристики пространственного распределения этих белков, которые не были обнаружены с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии 8 .
Для обнаружения белково-белковых взаимодействий in vivo можно использовать несколько других методов, таких как совместное иммунопреципитация, методы вытягивания и двухгибридные скрининг-дрожжи. Однако эти методы довольно громоздки, требуют больших количеств клеток или белков или включают избыточную экспрессию белков, которая вводит экспериментальные артефакты. Совсем недавно был разработан новый метод, который позволяет визуализировать и количественно определять белково-белковые взаимодействия in situ ( т.е. в клетках и в тканях), который называется анализом лигирования близости (PLA) 9 , 10 . PrИмариновые антитела, которые распознают два представляющих интерес белка, обнаруживаются вторичными антителами, которые конъюгированы с олигонуклеотидами (так называемые PLA-зонды). Если два разных вторичных антитела достаточно близки из-за взаимодействий между белками, распознаваемыми первичными антителами, конъюгированные олигонуклеотиды гибридизуются и могут быть лигированы с образованием замкнутого кольцевого ДНК-субстрата. Этот круглый субстрат затем амплифицируют путем амплификации окружности качения и визуализируют с комплементарными флуорохромовыми комплементарными олигонуклеотидами. Используя PLA, субклеточная локализация белково-белкового взаимодействия сохраняется, так как флуоресцентно меченый продукт амплификации скользящего круга остается прикрепленным к PLA-зондам. Разрешение этого анализа составляет <50 нм, на основании нахождения, что диаметр антитела составляет приблизительно 7-10 нм 11 . Усиление прокатного круга может иметь место только в случае, если две пары антител (первичный + секонDary) физически взаимодействуют по периметру, который определяется их размером (10 + 10 + 10 + 10 = 40 нм). Шаг усиления сигнала увеличивает чувствительность анализа PLA и позволяет обнаруживать взаимодействия едва выраженных белков. PLA генерирует точечные фокусные сигналы, которые могут быть определены количественно на основе клеток, с помощью которых можно оценивать внутри- и межклеточные изменения в белково-белковых взаимодействиях.
Образование и состав восстановительных комплексов ДНК и IRIFs в основном изучают в клеточных линиях клещей, таких как линия U2OS эпителиальных клеток костной остеосаркомы человека, линия клеток эмбриональной почки человека HEK293 и линия эпителиальных клеток ретинального эпителия RPE-1, Растут и легко трансфицируются. Культуры клеток суспензии, такие как лимфоидные и миелоидные клеточные линии, используются реже, поскольку они менее подвержены трансфекции и обычно не прилипают к покровным, что требует дополнительной / альтернативной ст.Eps для визуализации. Однако разрешение повреждения ДНК очень важно в контексте лимфоидных и миелоидных злокачественных новообразований, так как ответ на повреждение ДНК часто зависит от геномных (драйверов) аберраций в этих опухолях, играя ключевую роль в злокачественной трансформации нормальных лимфоидных и миелоидных ( Предшественник) 12 , 13 , 14 .
Этот протокол описывает, как PLA может использоваться для оценки и количественного определения белково-белковых взаимодействий после индукции повреждения ДНК в культурах суспензионных клеток. Здесь выполняется PLA для определения и визуализации взаимодействий между ATM и p53 при повреждении ДНК в клетках лейкемии человека B-клеток, которые индуцируются для того, чтобы подвергнуться остановке клеточного цикла G1-фазы. Следует отметить, что представленный здесь протокол не ограничивается изучением взаимодействий ATM и p53 в клетках лейкемии, арестованных G1, но также может быть использован для визуализации другого белково-белкового взаимодействияВ различных типах клеток и в культурах суспензионных клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом отчете показано, что PLA может использоваться для определения и визуализации специфического взаимодействия между белками в культурах суспензионных клеток. Следует отметить, что описанный здесь протокол не ограничивается изучением комплексов восстановления ДНК, но также примен…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования в лаборатории Guikema финансируются за счет схемы инновационных исследовательских стимулов из Нидерландской организации по научным исследованиям (грант VIDI 016126355) и KiKA Stichting Kinderen Kankervrij '(проект 252).
Materials
| BV173 cell line | DSMZ | AC-20 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| SUP-B15 cell line | DSMZ | ACC-389 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco (Life Technologies) | 21980-032 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich | F7524 | lot #: 064M3396 |
| L-glutamine | Gibco (Life Technologies) | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 15140-122 | |
| imatinib methanesulfonate | LC Laboratories | I-5508 | Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution |
| neocarzinostatin | Sigma Aldrich | N9162 | Mutagenic/teratogenic, handle with care |
| KU55933 | Selleckchem | S1092 | Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution |
| Starfrost Microscopy Slides | Waldemar Knittel | VA11200 003FKB | |
| PAP pen liquid blocker | Sigma Aldrich | Z377821-1EA | |
| Cytospin funnel | Q Path Labonord SAS | 003411324 | |
| Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit | Sigma Aldrich | DUO92105 | Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green |
| goat-anti-ATM | Bethyl Laboratories | A300-136A | PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies |
| rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 | Cell Signaling Technology | 9284 | We succesfully used lot #9284-4 in our studies |
| Vectashield antifading mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Vectashield antifading mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Also available from various other vendors |
References
- Maréchal, A., Zou, L. DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716 (2013).
- Huen, M. S. Y., Chen, J. Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites. Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2010).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA Repair. 9 (12), 1219-1228 (2010).
- Matsuoka, S., et al. ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage. Science. 316 (5828), 1160-1166 (2007).
- Barlow, C., Brown, K. D., Deng, C. X., Tagle, D. A., Wynshaw-Boris, A. Atm selectively regulates distinct p53-dependent cell-cycle checkpoint and apoptotic pathways. Nature Genet. 17 (4), 453-456 (1997).
- Tibbetts, R. S., et al. A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53. Genes Dev. 13 (2), 152-157 (1999).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction Multicolor Imaging of the Nuclear Periphery with 3D Structured Illumination Microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. J Cell Sci. 125 (Pt 15), 3529-3534 (2012).
- Gullberg, M., et al. A sense of closeness: protein detection by proximity ligation. Curr Opin Biotechnol. 14 (1), 82-86 (2003).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Dong, Y., Shannon, C. Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection. Anal Chem. 72 (11), 2371-2376 (2000).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies. Leuk Lymphoma. 52 (4), 567-582 (2011).
- Rendleman, J., et al. Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin’s lymphoma. PloS One. 9 (7), e101685 (2014).
- Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling. J Immunol. , (2016).
- Banin, S., et al. Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science. 281 (5383), 1674-1677 (1998).
