Nachweis und Visualisierung von DNA-schadeninduzierten Proteinkomplexen in Suspensionszellkulturen unter Verwendung des Proximity Ligation Assays

Summary

Hier wird gezeigt, wie der in situ Proximity Ligation Assay (PLA) verwendet werden kann, um die direkten Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen ATM und p53 in Suspensionszellkulturen, die genotoxischen Stress ausgesetzt sind, zu detektieren und zu visualisieren.

Abstract

Die DNA-Schadensreaktion orchestriert die Reparatur von DNA-Läsionen, die spontan auftreten, durch genotoxischen Stress verursacht werden oder im Zusammenhang mit programmierten DNA-Pausen in Lymphozyten auftreten. Die Ataxia-Telangiektasia-mutierte Kinase (ATM), ATM- und Rad3-verwandte Kinase (ATR) und die katalytische Untereinheit der DNA-abhängigen Proteinkinase (DNA-PKcs) gehören zu den ersten, die bei der Induktion von DNA-Schäden aktiviert werden und sind Zentrale Regulatoren eines Netzwerks, das DNA-Reparatur, Apoptose und Zellüberleben kontrolliert. Als Teil eines tumorsuppressiven Weges aktivieren ATM und ATR p53 durch Phosphorylierung, wodurch die Transkriptionsaktivität von p53 reguliert wird. DNA-Schädigung führt auch zur Bildung von sogenannten ionisierenden strahlungsinduzierten Herden (IRIF), die Komplexe von DNA-Schädigungssensoren darstellen und Proteine, die sich an den Stellen der DNA-Schädigung ansammeln, die durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden, reparieren. Die Ko-Lokalisierung von Proteinen in IRIFs bedeutet jedoch nicht zwangsläufig dIrekte Protein-Protein-Wechselwirkungen, da die Auflösung der Fluoreszenzmikroskopie begrenzt ist.

In situ Proximity Ligation Assay (PLA) ist eine neuartige Technik, die die direkte Visualisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in Zellen und Geweben mit beispielloser Spezifität und Empfindlichkeit ermöglicht. Diese Technik basiert auf der räumlichen Nähe von spezifischen Antikörpern, die an die interessierenden Proteine ​​binden. Wenn die abgefragten Proteine ​​innerhalb von ~ 40 nm liegen, wird eine Amplifikationsreaktion durch Oligonukleotide ausgelöst, die an die Antikörper konjugiert sind, und das Amplifikationsprodukt wird durch fluoreszierende Markierung sichtbar gemacht, was ein Signal ergibt, das der subzellulären Position der wechselwirkenden Proteine ​​entspricht. Unter Verwendung der etablierten funktionalen Interaktion zwischen ATM und p53 als Beispiel wird hier gezeigt, wie PLA in Suspensionszellkulturen verwendet werden kann, um die direkten Wechselwirkungen zwischen Proteinen, die integrale Bestandteile der DNA-Schadensreaktion sind, zu untersuchen.

Introduction

DNA-Schaden löst eine hochregulierte Reihe von Ereignissen mit Protein-Protein-Wechselwirkungen und posttranslationalen Modifikationen aus, die die effiziente und schnelle Reparatur von DNA sicherstellen und damit die genomische Integrität sichern. Typischerweise wird die DNA-Reparatur in Zellen untersucht, die ionisierender Strahlung ausgesetzt sind, indem sie die Bildung von sogenannten ionisierenden Strahlung induzierten Herden (IRIF) durch (konfokale) Fluoreszenzmikroskopie überwachen. Viele DNA-Reparatur- und DNA-Schmerz-Sensing-Proteine ​​bilden IRIFs, die Proteinkomplexe repräsentieren, die an Chromatinstellen anhalten, die DNA-Schäden ^{2 , 3} aufrechterhalten. Die Lage und Auflösung von IRIFs im Laufe der Zeit gibt einen wichtigen Einblick in die räumlich-zeitliche Organisation der DNA-Reparatur und kann auf die Beteiligung verschiedener DNA-Reparaturwege hindeuten. Die Art der DNA-Schädigung und die Zellzyklusstufe, in der der Schaden erreicht wird, bestimmt, welcher DNA-Reparaturweg aktiviert ist. Fo (OH) ist die dominante DNA-Reparaturbahn, während bei Zellen in der G1- oder G2 / M-Phase des Zellzyklus die nicht- Homologe Endverknüpfung (NHEJ) Reparaturpfad überwiegt. Eines der frühesten Ereignisse nach DNA-Schädigung ist die Aktivierung der DNA-Schmerz-Sensing-Kinasen Ataxia Telangiectasia-Mutiertes Protein (ATM), das meist in den G1- und G2 / M-Phasen des Zellzyklus aktiv ist und NHEJ reguliert, Und Ataxia Telangiectasia und Rad3-verwandtes Protein (ATR), das in der S-Phase durch Aktivierung von HR wirkt. Sowohl ATM als auch ATR sind sehr pleiotrope Kinasen, die viele Proteine ​​phosphorylieren, die an der DNA-Reparatur, dem Zelltod und dem Überleben beteiligt sind ⁴ . Beide Kinasen haben gezeigt, dass sie das Tumorsuppressor-Protein p53 nach der Exposition gegenüber genotoxischem Stress phosphorylieren und aktivieren, was darauf hinweist, dass diese Kinasen stromaufwärts Vermittler einer schwenkbaren Tumorsuppressions-Signalisierungsachse sind"Xref"> 5 ^{, 6}

Die Bildung und Zusammensetzung von IRIFs wird typischerweise durch die Bestimmung der Co-Lokalisierung verschiedener Proteine ​​unter Verwendung von zweifarbiger Immunfluoreszenzfärbung und -mikroskopie bestimmt, wobei jedoch nicht alle Proteine, die Teil von Reparaturproteinkomplexen sind, IRIFs bilden, was die Anwendbarkeit dieses Ansatzes begrenzt. Darüber hinaus ist die (konfokale) Immunfluoreszenzmikroskopie durch die Beugungseigenschaften von Licht begrenzt, was zu einer eher schlechten räumlichen Auflösung von etwa 200-300 nm führt, die die Größe der meisten subzellulären Strukturen übersteigt, was im Wesentlichen die direkte Vernehmung von Protein-Protein-Wechselwirkungen bei Das molekulare Niveau. Als solches ist die Co-Lokalisierung von Immunfluoreszenz-Färbemuster, wie sie durch (konfokale) Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden, nicht notwendigerweise für direkte Protein-Protein-Wechselwirkungen indikativ. In letzter Zeit wurden neue Super-Resolution-Technologien entwickelt, wie zB dreidimensionale Strukturen(3D-SIM) ⁷ , die erfolgreich verwendet wurde, um die Bildung von 53BP1 und BRCA1 IRIF im nanoskaligen Detail zu untersuchen und die räumlichen Verteilungscharakteristiken dieser Proteine ​​aufzudecken, die durch konfokale Laserscanningmikroskopie nicht erkannt werden konnten ⁸ .

Mehrere andere Verfahren können verwendet werden, um Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo zu detektieren, wie Co-Immunpräzipitation, Pull-Down-Verfahren und Hefe-Zwei-Hybrid-Screening-Ansätze. Allerdings sind diese Techniken eher umständlich, erfordern große Mengen an Zellen oder Proteinen oder beinhalten eine Überexpression von Proteinen, die experimentelle Artefakte einführt. In jüngster Zeit wurde eine neuartige Technik entwickelt, die die Visualisierung und Quantifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ ( dh in Zellen und in Geweben) ermöglicht, die als Proximity Ligation Assay (PLA) ^{9 , 10} bezeichnet ^wird . PrImary-Antikörper, die zwei interessierende Proteine ​​erkennen, werden von sekundären Antikörpern erkannt, die an Oligonukleotide (sogenannte PLA-Sonden) konjugiert sind. Wenn die beiden verschiedenen sekundären Antikörper aufgrund von Wechselwirkungen zwischen den von den primären Antikörpern erkannten Proteinen ausreichend eng sind, hybridisieren die konjugierten Oligonukleotide und können ligiert werden, um ein geschlossenes kreisförmiges DNA-Substrat zu bilden. Dieses kreisförmige Substrat wird anschließend durch Walzkreisverstärkung amplifiziert und mit fluorchrom-konjugierten komplementären Oligonukleotiden sichtbar gemacht. Unter Verwendung von PLA wird die subzelluläre Lokalisierung der Protein-Protein-Wechselwirkung bewahrt, da das fluoreszenzmarkierte Rollkreis-Amplifikationsprodukt an den PLA-Sonden gebunden bleibt. Die Auflösung dieses Assays beträgt <50 nm, basierend auf dem Ergebnis, dass der Durchmesser eines Antikörpers etwa 7-10 nm ¹¹ beträgt. Die Walzkreisverstärkung kann nur stattfinden, wenn zwei Paare von Antikörpern (primär + sekDary) physisch interagieren innerhalb des Umfangs, der durch ihre Größe (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm) definiert ist. Der Signalverstärkungsschritt erhöht die Empfindlichkeit des PLA-Assays und ermöglicht die Detektion von Wechselwirkungen von kaum exprimierten Proteinen. PLA erzeugt punktförmige, foci-ähnliche Signalmuster, die auf einer pro-Zell-Basis quantifiziert werden können, wodurch die intra- und interzelluläre Variation der Protein-Protein-Wechselwirkungen beurteilt werden kann.

Die Bildung und Zusammensetzung von DNA-Reparaturkomplexen und IRIFs wird meist in adhärenten Zelllinien wie der humanen Knochenosteosarkom-Epithelzelllinie U2OS, der humanen embryonalen Nierenzelllinie HEK293 und der retinalen Pigmentepithelzelllinie RPE-1 untersucht, Wachsen und leicht zu verwandeln. Suspensionszellkulturen wie lymphoide und myeloide Zelllinien werden seltener eingesetzt, da diese weniger der Transfektion zugänglich sind und sich im Allgemeinen nicht an Deckgläschen haften und somit zusätzliche / alternative StEps für die Bildgebung. Die Auflösung von DNA-Schäden ist jedoch im Zusammenhang mit lymphatischen und myeloischen Malignitäten sehr relevant, da die DNA-Schadensreaktion häufig von genomischen (Treiber-) Aberrationen in diesen Tumoren betroffen ist und eine entscheidende Rolle bei der bösartigen Transformation von normalem lymphatischen und myeloiden ( Vorläufer) Zellen ^{12 , 13 , 14} .

Dieses Protokoll beschreibt, wie PLA verwendet werden kann, um Protein-Protein-Wechselwirkungen nach der Induktion von DNA-Schäden in Suspensionszellkulturen zu bewerten und zu quantifizieren. Hier wird PLA durchgeführt, um die Wechselwirkungen zwischen ATM und p53 auf DNA-Schäden in menschlichen B-Zell-Leukämiezellen zu bestimmen und zu visualisieren, die induziert werden, um einem G1-Phasen-Zellzyklus-Arrest zu unterziehen. Bemerkenswert ist, dass das hier vorgestellte Protokoll nicht auf das Studium von ATM- und p53-Interaktionen in G1-arrogierten Leukämiezellen beschränkt ist, sondern auch zur Visualisierung anderer Protein-Protein-Interac verwendet werden kannIn verschiedenen Zelltypen und Suspensionszellkulturen.

Protocol

1. Behandlung von Zellen und DNA-Schädigung Induktion Kultur die humanen BCR-ABL + B-Zell-akuten lymphoblastischen Zelllinien BV173 oder SUP-B15 im IMDM, ergänzt mit 20% FCS, 50 μM β-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin, 100 U / mL Penicillin und 100 μg / mL Streptomycin bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO 2 . Zähle Zellen und Platte bei 2 x 10 & sup6; Zelle / ml in 6-Wells-Platten bei 5 ml / Vertiefung. HINWEIS: Optional können Suspensionszelllinien verschiedener He…

Representative Results

Die Phosphorylierung von p53 am Rest Ser15 zeigte sich als abhängig von der ATM-Kinaseaktivität 16 . Um die Spezifität der PLA-Technik auf Zytospin-Präparationen von Suspensionszellkulturen zu demonstrieren und zu bestätigen, wird gezeigt, dass die Induktion von DNA-Schäden durch 2-h-NCS-Behandlung von BCR-ABL + B-ALL-Zellen in der G1-Phase des Zellzyklus verhaftet wurde Führte zu einer spezifischen Wechselwirkung zwischen ATM und Phospho-Ser15-p53, wie erw…

Discussion

In diesem Bericht wird gezeigt, dass PLA verwendet werden kann, um die spezifische Wechselwirkung zwischen Proteinen in Suspensionszellkulturen zu bestimmen und zu visualisieren. Bemerkenswert ist, dass das hier beschriebene Protokoll nicht auf die Untersuchung von DNA-Reparaturkomplexen beschränkt ist, sondern auch für die Visualisierung und Quantifizierung anderer Protein-Protein-Wechselwirkungen in Suspensionszellkulturen gilt. Es wird gezeigt, dass die ATM-Kinase mit phosphoryliertem p53 in G1-verhafteten BCR-ABL …

Materials

BV173 cell line	DSMZ	AC-20	BCR-ABL+ B-ALL cell line
SUP-B15 cell line	DSMZ	ACC-389	BCR-ABL+ B-ALL cell line
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco (Life Technologies)	21980-032
Fetal Calf Serum	Sigma Aldrich	F7524	lot #: 064M3396
L-glutamine	Gibco (Life Technologies)	25030-024
penicillin/streptomycin	Gibco (Life Technologies)	15140-122
imatinib methanesulfonate	LC Laboratories	I-5508	Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution
neocarzinostatin	Sigma Aldrich	N9162	Mutagenic/teratogenic, handle with care
KU55933	Selleckchem	S1092	Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution
Starfrost Microscopy Slides	Waldemar Knittel	VA11200 003FKB
PAP pen liquid blocker	Sigma Aldrich	Z377821-1EA
Cytospin funnel	Q Path Labonord SAS	003411324
Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit	Sigma Aldrich	DUO92105	Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green
goat-anti-ATM	Bethyl Laboratories	A300-136A	PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies
rabbit-anti-phospho-Ser15-p53	Cell Signaling Technology	9284	We succesfully used lot #9284-4 in our studies
Vectashield antifading mounting medium with DAPI	Vector Labs	H-1200
Vectashield antifading mounting medium	Vector Labs	H-1000
4% paraformaldehyde in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	Also available from various other vendors