Rilevamento e visualizzazione di complessi proteici indotti da danni a DNA nelle cellule di cellule di sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità

Summary

Qui viene dimostrato come può essere utilizzato il test di Ligation Proximity (PLA) in situ per rilevare e visualizzare le interazioni proteiche-proteiche dirette tra ATM e p53 nelle colture di cellule di sospensione esposte a stress genotossico.

Abstract

La risposta al danno del DNA orchestra la riparazione delle lesioni del DNA che si verificano spontaneamente, sono causate da stress genotossico o appaiono nel contesto di interruzioni del DNA programmate nei linfociti. Tra le prime che sono attivate dopo l'induzione del danno del DNA, sono state individuate le chinasi mutanti (ATM) di Ataxia-Telangiectasia mutata (ATM), kinasi ATM- e Rad3-correlata (ATR) e la subunità catalitica della proteina-chinasi dipendente dal DNA (DNA-PKcs) Regolatori centrali di una rete che controlla la riparazione del DNA, l'apoptosi e la sopravvivenza cellulare. Come parte di un percorso che sopprime il tumore, ATM e ATR attivano la p53 attraverso la fosforilazione, regolando così l'attività trascrizionale della p53. Il danno del DNA provoca anche la formazione di cosiddetti foci indotti da radiazioni ionizzanti (IRIF) che rappresentano complessi di sensori di danni del DNA e proteine ​​di riparazione che si accumulano nei siti di danni del DNA, visualizzati mediante microscopia a fluorescenza. La co-localizzazione delle proteine ​​in IRIF, tuttavia, non implica necessariamente dLe interazioni proteiche proteiche, in quanto la risoluzione della microscopia a fluorescenza è limitata.

In locazione Proximity Ligation Assay (PLA) è una tecnica innovativa che consente la visualizzazione diretta delle interazioni proteico-proteiche in cellule e tessuti con specificità e sensibilità senza precedenti. Questa tecnica si basa sulla prossimità spaziale di anticorpi specifici legati alle proteine ​​di interesse. Quando le proteine ​​interrogate sono all'interno di ~ 40 nm una reazione di amplificazione viene innescato da oligonucleotidi che sono coniugati agli anticorpi e il prodotto di amplificazione è visualizzato mediante etichettatura fluorescente, dando un segnale che corrisponde alla localizzazione subcellulare delle proteine ​​interagenti. Utilizzando l'interazione funzionale stabilita tra ATM e p53, è qui dimostrato come il PLA possa essere utilizzato nelle colture di cellule di sospensione per studiare le interazioni dirette tra le proteine ​​che costituiscono parte integrante della risposta del danno del DNA.

Introduction

Il danno del DNA innesca una serie altamente regolamentata di eventi che coinvolgono le interazioni proteico-proteiche e le modificazioni post-traslazionali che garantiscono una riparazione efficiente e rapida del DNA, salvaguardando così l'integrità genomica ¹ . In genere, la riparazione del DNA viene studiata in cellule esposte a radiazioni ionizzanti monitorando la formazione di cosiddetti foci indotti da radiazioni ionizzanti (IRIF) mediante microscopia a fluorescenza (confocale). Molte protezioni del DNA e proteine ​​che danno i danni del DNA formano IRIFs, che rappresentano complessi proteici che nucleate nei siti di cromatin che sostengono il danno del DNA ^{2 , 3} . L'ubicazione e la risoluzione degli IRIF nel corso del tempo danno un'importante conoscenza dell'organizzazione spaziale della riparazione del DNA e possono indicare il coinvolgimento di diversi percorsi di riparazione del DNA. La natura del danno del DNA e la fase del ciclo cellulare in cui il danno è raggiunto determina quale percorso di riparazione del DNA è attivato. fo R, in cellule attivamente impegnate nella replicazione del DNA (fase S), la ricombinazione omologa (HR) è il percorso di riparazione dominante del DNA, mentre nelle cellule nella fase G1 o G2 / M del ciclo cellulare, Predominano il percorso di riparazione homologous end-joining (NHEJ). Uno degli eventi più iniziali che segue il danno del DNA è l'attivazione delle proteine ​​della telangiectasia-mutato (ATM) di Ataxia Telangiectasia-Mutated (ATM), che è prevalentemente attiva nelle fasi G1 e G2 / M del ciclo cellulare e regola NHEJ, E Ataxia Telangiectasia e Rad3-related protein (ATR), che agisce in fase S attivando HR. Entrambi ATM e ATR sono cinasi molto pleiotropici che fossicole molte proteine ​​che sono coinvolte nella riparazione del DNA, nella morte cellulare e nella sopravvivenza ⁴ . Entrambe le chinasi sono state dimostrate di fosforilazione e attivazione della proteina tumor-suppressor p53 a seguito dell'esposizione a stress genotossico, indicando che queste chinasi sono mediatori a monte di un asse di segnalazione suppressivo del tumore pivotal"Xref"> 5 ^{, 6} .

La formazione e la composizione degli IRIF è tipicamente valutata determinando la co-localizzazione di diverse proteine ​​usando la colorazione immunofluorescenza a due colori e la microscopia, tuttavia non tutte le proteine ​​che fanno parte dei complessi proteici di riparazione formano IRIF che limita l'applicabilità di questo approccio. Inoltre, la microscopia di immunofluorescenza (confocale) è limitata dalle proprietà di diffrazione della luce, con una risoluzione spaziale piuttosto scarsa di circa 200-300 nm, superando le dimensioni delle strutture subcellulari più basse, il che proibisce essenzialmente l'interrogazione diretta delle interazioni protein-proteine ​​a Il livello molecolare. Come tale, la co-localizzazione dei modelli di colorazione delle immunofluorescenza rilevata dalla microscopia a fluorescenza (confocale) non è necessariamente indicativa per le interazioni proteiche-proteiche dirette. Recentemente, sono state sviluppate nuove tecnologie super-risoluzione, come ad esempio strutture struzionali tridimensionali(3D-SIM) ⁷ , che è stato utilizzato con successo per studiare la formazione di IRBF 53BP1 e BRCA1 a dettagli di nano scala, rivelando le caratteristiche di distribuzione spaziale di queste proteine ​​che non sono state rilevate dalla microscopia a scansione laser a confocale ⁸ .

Molti altri metodi possono essere utilizzati per rilevare interazioni protein-proteine in vivo , quali co-immunoprecipitazione, metodi di abbattimento e approcci di screening a due hibridi di lievito. Tuttavia, queste tecniche sono piuttosto ingombranti, richiedono grandi quantità di cellule o proteine ​​o coinvolgono un'eccessiva espressione delle proteine, che introduce artefatti sperimentali. Più di recente è stata sviluppata una nuova tecnica che consente la visualizzazione e la quantificazione delle interazioni proteiche-proteiche in situ ( cioè nelle cellule e nei tessuti), chiamata Proximity Ligation Assay (PLA) ^{9 , 10} . PrGli anticorpi secondari che riconoscono due proteine ​​di interesse sono rilevati da anticorpi secondari che sono coniugati a oligonucleotidi (cosiddette sonde PLA). Se i due diversi anticorpi secondari sono sufficientemente stretti a causa delle interazioni tra le proteine ​​riconosciute dagli anticorpi primari, gli ioligonucleotidi coniugati si ibridano e possono essere legati per formare un substrato DNA circolare chiuso. Questo substrato circolare viene successivamente amplificato mediante amplificazione a circuito circolare e visualizzata con oligonucleotidi complementari con fluorochrome. Utilizzando PLA, la localizzazione subcellulare dell'interazione proteico-proteica viene mantenuta quando il prodotto di amplificazione del cerchio di laminazione a fluorescenza è rimasto collegato alle sonde PLA. La risoluzione di questo saggio è <50 nm, basata sulla constatazione che il diametro di un anticorpo è di circa 7-10 nm ¹¹ . L'amplificazione del cerchio rotante può avvenire solo nel caso in cui due paia di anticorpi (primario + seconDary) interagiscono fisicamente all'interno del perimetro definito dalla loro dimensione (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). La fase di amplificazione del segnale aumenta la sensibilità del test PLA e consente la rilevazione delle interazioni di proteine ​​appena espresse. PLA genera segnali di punta, simili a foci simili, che possono essere quantificati su base cellulare per cui è possibile valutare la variazione intra-cellulare e inter-cellulare nelle interazioni proteico-proteine.

La formazione e la composizione dei complessi di riparazione e IRIF sono principalmente studiati in linee cellulari aderenti come la linea cellulare U2OS osteosarcoma ossea umana, la linea cellulare HEK293 embrionale umana e la linea cellulare epiteliale RPE-pigment retinica, Crescente e facile da trasfettare. Le colture di cellule di sospensione, come quelle lineari di linfoidi e mieloidi, vengono utilizzate meno frequentemente, poiché queste sono meno suscettibili alla trasfezione e generalmente non si adattano a coverlips, richiedendo quindi ulteriori / alternative stEps per l'imaging. La risoluzione dei danni del DNA è però molto rilevante nel contesto delle malignità linfoidi e mieloide, in quanto la risposta dei danni al DNA è spesso influenzata dalle aberrazioni genomiche (driver) in questi tumori, svolgendo un ruolo fondamentale nella trasformazione maligna di linfoidi e mieloidi normali ( Progenitori) le cellule ^{12 , 13 , 14} .

Questo protocollo descrive come il PLA possa essere utilizzato per valutare e quantificare le interazioni proteico-proteiche dopo l'induzione del danno del DNA nelle colture di cellule di sospensione. Qui, PLA viene eseguita per determinare e visualizzare le interazioni tra ATM e p53 sul danno del DNA nelle cellule di leucemia delle cellule umane B che sono indotte a subire un arresto del ciclo cellulare in fase G1. Da notare, il protocollo qui presentato non è limitato allo studio di interazioni ATM e p53 nelle cellule di leucemia arrestate da G1, ma può anche essere utilizzato per visualizzare altri interazioni proteico-proteicoIn vari tipi di cellule e colture di cellule di sospensione.

Protocol

1. Trattamento delle cellule e dell'induzione del danno del DNA Coltivare la linfoblastica acuta linfoblastica BV173 o SUP-B15 umana in IMDM integrata con 20% FCS, 50 μM β-mercaptoetanolo, 2 mM L-glutamina, 100 U / mL penicillina e 100 μg / mL streptomicina a 37 ° C in atmosfera di 5% CO 2 . Contare le cellule e la piastra a 2 x 10 6 cellule / mL in piatti a 6 pozzetti, a 5 mL / pozzetto. NOTA: Opzionalmente, le linee cellulari di sospensione di diversa origine possono ess…

Representative Results

La fosforilazione del p53 al residuo Ser15 è risultata dipendente dall'attività di ATM kinasi 16 . Per dimostrare e confermare la specificità della tecnica PLA sulle preparazioni citospiniche di colture di cellule di sospensione, si è dimostrato che l'induzione del danno del DNA mediante trattamento a 2 ore di NCS di cellule BCR-ABL + B-ALL arrestate nella fase G1 del ciclo cellulare Ha determinato l'interazione specifica tra ATM e fosfo-Ser15-p53,…

Discussion

In questa relazione, è dimostrato che PLA può essere utilizzato per determinare e visualizzare l'interazione specifica tra le proteine ​​nelle colture di cellule di sospensione. Da notare, il protocollo descritto qui non è limitato allo studio dei complessi di riparazione del DNA ma si applica anche per visualizzare e quantificare altre interazioni proteine-proteine ​​nelle colture cellulari di sospensione. Si è dimostrato che l'ATM kinasi interagisce con p53 fosforilato nelle cellule BCR-ABL + B-ALL…

Materials

BV173 cell line	DSMZ	AC-20	BCR-ABL+ B-ALL cell line
SUP-B15 cell line	DSMZ	ACC-389	BCR-ABL+ B-ALL cell line
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco (Life Technologies)	21980-032
Fetal Calf Serum	Sigma Aldrich	F7524	lot #: 064M3396
L-glutamine	Gibco (Life Technologies)	25030-024
penicillin/streptomycin	Gibco (Life Technologies)	15140-122
imatinib methanesulfonate	LC Laboratories	I-5508	Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution
neocarzinostatin	Sigma Aldrich	N9162	Mutagenic/teratogenic, handle with care
KU55933	Selleckchem	S1092	Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution
Starfrost Microscopy Slides	Waldemar Knittel	VA11200 003FKB
PAP pen liquid blocker	Sigma Aldrich	Z377821-1EA
Cytospin funnel	Q Path Labonord SAS	003411324
Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit	Sigma Aldrich	DUO92105	Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green
goat-anti-ATM	Bethyl Laboratories	A300-136A	PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies
rabbit-anti-phospho-Ser15-p53	Cell Signaling Technology	9284	We succesfully used lot #9284-4 in our studies
Vectashield antifading mounting medium with DAPI	Vector Labs	H-1200
Vectashield antifading mounting medium	Vector Labs	H-1000
4% paraformaldehyde in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	Also available from various other vendors