Détection et visualisation des complexes protéiques induits par endommagement de l'ADN dans des cultures cellulaires en suspension utilisant l'essai de ligature de proximité

Summary

Ici, il est démontré comment le dosage in situ de ligature de proximité (PLA) peut être utilisé pour détecter et visualiser les interactions directes protéines-protéines entre ATM et p53 dans des cultures de cellules en suspension exposées au stress génotoxique.

Abstract

La réponse aux dommages à l'ADN orchestrale la réparation des lésions de l'ADN qui se produisent spontanément, sont causées par un stress génotoxique ou apparaissent dans le contexte des ruptures d'ADN programmées dans les lymphocytes. L'Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM et Rad3-kinase (ATR) et la sous-unité catalytique de la protéine Kinase dépendante de l'ADN (DNA-PKcs) sont parmi les premiers qui sont activés lors de l'induction de dommages à l'ADN et sont Régulateurs centraux d'un réseau qui contrôle la réparation de l'ADN, l'apoptose et la survie cellulaire. Dans le cadre d'une voie suppresseur de tumeur, ATM et ATR activent p53 par phosphorylation, régulant ainsi l'activité transcriptionnelle de p53. Les dommages causés par l'ADN entraînent également la formation de soi-disant foyers induits par rayonnement ionisant (IRIF) qui représentent des complexes de capteurs de dégâts d'ADN et des protéines de réparation qui s'accumulent sur les sites d'endommagement de l'ADN, qui sont visualisés par microscopie à fluorescence. La co-localisation des protéines dans les IRIF, cependant, n'implique pas nécessairement dInteractions directes protéines-protéines, car la résolution de la microscopie à fluorescence est limitée.

L' essai de ligament de proximité in situ (PLA) est une technique novatrice qui permet la visualisation directe des interactions protéine-protéine dans les cellules et les tissus avec une spécificité et une sensibilité sans précédent. Cette technique est basée sur la proximité spatiale des anticorps spécifiques liés aux protéines d'intérêt. Lorsque les protéines interrogées se situent à environ 40 nm, une réaction d'amplification est déclenchée par des oligonucléotides qui sont conjugués aux anticorps et le produit d'amplification est visualisé par un marquage fluorescent, ce qui donne un signal qui correspond à l'emplacement subcellulaire des protéines interagissant. En utilisant l'interaction fonctionnelle établie entre ATM et p53 comme exemple, il est démontré ici comment PLA peut être utilisé dans des cultures cellulaires en suspension pour étudier les interactions directes entre les protéines qui font partie intégrante de la réponse aux dommages à l'ADN.

Introduction

Le dégât de l'ADN déclenche une série d'événements hautement réglementés impliquant des interactions protéine-protéine et des modifications post-traductionnelles qui garantissent une réparation efficace et rapide de l'ADN, protégeant ainsi l'intégrité génomique ¹ . Typiquement, la réparation de l'ADN est étudiée dans des cellules exposées aux rayonnements ionisants en surveillant la formation de soi-disant foyers induits par rayonnement ionisant (IRIF) par microscopie de fluorescence (confocale). De nombreuses protéines de détection de l'ADN et de détection des dommages à l'ADN forment des IRIF, qui représentent des complexes de protéines qui se nucléent sur des sites de chromatine endommagés par l'ADN ^{2 , 3} . L'emplacement et la résolution des IRIF au fil du temps donnent un aperçu important de l'organisation spatio-temporelle de la réparation de l'ADN et peuvent indiquer l'implication de différentes voies de réparation de l'ADN. La nature de l'endommagement de l'ADN et l'étape du cycle cellulaire dans laquelle le dommage est atteint déterminent la voie de réparation de l'ADN activée. Fo Par exemple, dans les cellules activement engagées dans la replication de l'ADN (phase S), la recombinaison homologue (HR) est la voie de réparation de l'ADN dominante, alors que dans les cellules de la phase G1 ou G2 / M du cycle cellulaire, La voie de réparation homologue de jointure finale (NHEJ) prédomine. L'activation des kinases sensibles aux dommages à l'ADN Ataxia Telangiectasia-Mutated protein (ATM), qui est principalement active dans les phases G1 et G2 / M du cycle cellulaire et régule le NHEJ, Et Ataxia Telangiectasia et protéines liées à Rad3 (ATR), qui agit en phase S en activant des ressources humaines. L'ATM et l'ATR sont des kinases très pleiotropes qui phosphorylent de nombreuses protéines impliquées dans la réparation de l'ADN, la mort cellulaire et la survie ⁴ . Les deux kinases se sont révélées phosphoryler et activer la protéine suppresseur de tumeur p53 après l'exposition au stress génotoxique, ce qui indique que ces kinases sont des médiateurs en amont d'un axe de signalisation suppresseur de tumeur pivot"Xref"> 5 ^{, 6} .

La formation et la composition des IRIF sont généralement évaluées en déterminant la co-localisation de différentes protéines en utilisant une coloration et une microscopie à double couleur d'immunofluorescence, mais toutes les protéines qui font partie des complexes de protéines de réparation forment IRIF, ce qui limite l'applicabilité de cette approche. Par ailleurs, la microscopie d'immunofluorescence (confocal) est limitée par les propriétés de diffraction de la lumière, ce qui entraîne une résolution spatiale assez faible d'environ 200 à 300 nm, dépassant la taille de la plupart des structures subcellulaires, ce qui interdit essentiellement l'interrogation directe des interactions protéine-protéine au Le niveau moléculaire. En tant que tel, la co-localisation des motifs de coloration par immunofluorescence détectés par microscopie de fluorescence (confocale) n'est pas nécessairement indicative d'interactions directes protéines-protéines. Récemment, de nouvelles technologies de super résolution ont été développées, telles que la structure tridimensionnelle(3D-SIM) ⁷ , qui a été utilisé avec succès pour étudier la formation d'IRIF 53BP1 et BRCA1 à des détails à l'échelle nanométrique, révélant les caractéristiques de distribution spatiale de ces protéines qui n'ont pas été détectées par microscopie confocale à balayage laser ⁸ .

Plusieurs autres méthodes peuvent être utilisées pour détecter les interactions protéine-protéine in vivo , telles que la co-immunoprécipitation, les méthodes d'extraction et les approches de dépistage à deux hybrides de levure. Cependant, ces techniques sont plutôt encombrantes, nécessitent de grandes quantités de cellules ou de protéines ou impliquent une surexpression de protéines, qui introduit des artefacts expérimentaux. Plus récemment, une nouvelle technique a été développée qui permet la visualisation et la quantification des interactions protéine-protéine in situ ( c.- à -d. Dans les cellules et dans les tissus), appelée Ensemble de ligature de proximité (PLA) ^{9 , 10} . PrLes anticorps généraux qui reconnaissent deux protéines d'intérêt sont détectés par des anticorps secondaires conjugués aux oligonucléotides (appelés sondes PLA). Si les deux anticorps secondaires différents sont suffisamment proches en raison des interactions entre les protéines reconnues par les anticorps primaires, les oligonucléotides conjugués s'hybrident et peuvent être ligaturés pour former un substrat d'ADN circulaire fermé. Ce substrat circulaire est ensuite amplifié par amplification du cercle roulant et visualisé avec des oligonucleotides complémentaires conjugués au fluorochrome. En utilisant PLA, la localisation subcellulaire de l'interaction protéine-protéine est préservée lorsque le produit d'amplification du cercle roulant marqué par fluorescence reste attaché aux sondes PLA. La résolution de ce dosage est <50 nm, en fonction de la constatation que le diamètre d'un anticorps est d'environ 7 à 10 nm ¹¹ . L'amplification du cercle circulant ne peut avoir lieu que dans le cas où deux paires d'anticorps (primaire + seconDary) interagissent physiquement dans le périmètre qui est défini par leur taille (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). L'étape d'amplification du signal augmente la sensibilité du test PLA et permet de détecter les interactions de protéines à peine exprimées. La PLA génère des signes de signaux ponctuels et axiaux qui peuvent être quantifiés par cellule, par lesquels la variation intra-et inter-cellulaire des interactions protéine-protéine peut être évaluée.

La formation et la composition des complexes de réparation de l'ADN et des IRIF sont principalement étudiées dans des lignées cellulaires adhérentes telles que la lignée cellulaire épithéliale osseosarcome du os humain U2OS, la lignée cellulaire rénale embryonnaire humaine HEK293 et ​​la lignée cellulaire épithéliale du pigment rétinien RPE-1, Croissant et facile à transfecter. Des cultures de cellules de suspension telles que des lignées lymphoïdes et des liaisons myéloïdes sont utilisées moins fréquemment, étant donné qu'elles sont moins susceptibles d'être transfectées et, en général, elles ne respectent pas les lamelles, nécessitant ainsi une alternative supplémentaireEps pour l'imagerie. La résolution des dommages à l'ADN est cependant très pertinente dans le contexte des tumeurs malignes lymphoïdes et myéloïdes, car la réponse aux dommages à l'ADN est fréquemment affectée par des aberrations génomiques (conducteurs) dans ces tumeurs, jouant un rôle central dans la transformation maligne du lymphoïde et de la myéloïde normaux ( Cellules progénitrices ^{12 , 13 , 14} .

Ce protocole décrit comment l'APL peut être utilisé pour évaluer et quantifier les interactions protéine-protéine suite à l'induction d'un endommagement de l'ADN dans des cultures cellulaires en suspension. Ici, le PLA est réalisé pour déterminer et visualiser les interactions entre ATM et p53 lors d'un endommagement de l'ADN dans des cellules de leucémie à cellules B humaines qui sont induites à subir une arrêt du cycle cellulaire en phase G1. Il est à noter que le protocole présenté ici ne se limite pas à l'étude des interactions ATM et p53 dans les cellules de leucémie arrêtées par G1, mais peut également être utilisé pour visualiser d'autres interactions protéines-protéinesDans divers types de cellules et cultures cellulaires en suspension.

Protocol

1. Traitement des cellules et induction des dommages à l'ADN Culturez les lignées cellulaires lymphoblastiques aiguës BCR-ABL + B de cellules B humaines BV173 ou SUP-B15 dans IMDM complétées par 20% de FCS, 50-bit de mercaptoéthanol, 2 mM de L-glutamine, 100 U / mL de pénicilline et 100 μg / mL de streptomycine au 37 ° C dans une atmosphère de 5% de CO 2 . Comptez les cellules et la plaque à 2 x 10 6 cellules / mL dans des plaques à 6 puits, à 5 ml / puits. REMARQ…

Representative Results

On a montré que la phosphorylation de p53 au résidu Ser15 dépendait de l'activité kinase ATM 16 . Pour démontrer et confirmer la spécificité de la technique PLA sur les préparations cytospin de cultures cellulaires en suspension, il est démontré que l'induction d'un endommagement de l'ADN par 2 h de traitement NCS des cellules BCR-ABL + B-ALL arrêtées dans la phase G1 du cycle cellulaire A entraîné l'interaction spécifique entre …

Discussion

Dans ce rapport, il est démontré que le PLA peut être utilisé pour déterminer et visualiser l'interaction spécifique entre les protéines dans les cultures de cellules en suspension. Il est à noter que le protocole décrit ici n'est pas limité à l'étude des complexes de réparation d'ADN, mais s'applique également à visualiser et quantifier d'autres interactions protéines-protéines dans des cultures de cellules en suspension. Il est démontré que la kinase ATM interagit avec le p53…

Materials

BV173 cell line	DSMZ	AC-20	BCR-ABL+ B-ALL cell line
SUP-B15 cell line	DSMZ	ACC-389	BCR-ABL+ B-ALL cell line
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco (Life Technologies)	21980-032
Fetal Calf Serum	Sigma Aldrich	F7524	lot #: 064M3396
L-glutamine	Gibco (Life Technologies)	25030-024
penicillin/streptomycin	Gibco (Life Technologies)	15140-122
imatinib methanesulfonate	LC Laboratories	I-5508	Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution
neocarzinostatin	Sigma Aldrich	N9162	Mutagenic/teratogenic, handle with care
KU55933	Selleckchem	S1092	Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution
Starfrost Microscopy Slides	Waldemar Knittel	VA11200 003FKB
PAP pen liquid blocker	Sigma Aldrich	Z377821-1EA
Cytospin funnel	Q Path Labonord SAS	003411324
Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit	Sigma Aldrich	DUO92105	Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green
goat-anti-ATM	Bethyl Laboratories	A300-136A	PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies
rabbit-anti-phospho-Ser15-p53	Cell Signaling Technology	9284	We succesfully used lot #9284-4 in our studies
Vectashield antifading mounting medium with DAPI	Vector Labs	H-1200
Vectashield antifading mounting medium	Vector Labs	H-1000
4% paraformaldehyde in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	Also available from various other vendors