Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화
Summary
여기에서는 유전 독성 스트레스에 노출 된 현탁 세포 배양 물에서 ATM과 p53 사이의 직접적인 단백질 – 단백질 상호 작용을 검출하고 시각화하기 위해 현장에서의 근접 연결 분석 (PLA)이 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다.
Abstract
DNA 손상 반응은 자발적으로 발생하거나, 유전 독성 스트레스에 의해 유발되거나, 또는 림프구에서 프로그램 된 DNA 붕괴의 문맥에서 나타나는 DNA 병변의 수리를 조율합니다. Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM 및 Rad3 관련 키나아제 (ATR) 및 DNA 의존성 단백질 키나제 (DNA-PKcs)의 촉매 서브 유닛은 DNA 손상의 유도시 활성화되는 첫 번째 물질이며, DNA 복구, 세포 사멸 및 세포 생존을 조절하는 네트워크의 중앙 조절 자. 종양 억제 경로의 일환으로 ATM과 ATR은 인산화를 통해 p53을 활성화시킴으로써 p53의 전사 활성을 조절합니다. DNA 손상은 또한 형광 현미경에 의해 시각화 된 DNA 손상 부위에 축적되는 DNA 손상 센서 및 수리 단백질의 복합체를 나타내는 소위 이온화 방사선 유도 초점 (IRIF)의 형성을 초래한다. 그러나 IRIFs에서 단백질의 공동 위치 화는 반드시 d직접적인 단백질 – 단백질 상호 작용은 형광 현미경 검사의 해상도가 제한되어 있기 때문에 가능합니다.
In situ Proximity Ligation Assay (PLA)는 전례가없는 특이성과 민감성으로 세포와 조직에서 단백질 – 단백질 상호 작용을 직접 시각화 할 수있는 새로운 기술입니다. 이 기술은 관심있는 단백질에 결합하는 특정 항체의 공간적 근접성을 기반으로합니다. 질문 단백질이 ~ 40 nm 내에 있으면 증폭 반응은 항체에 접합 된 올리고 뉴클레오타이드에 의해 촉발되고 증폭 생성물은 형광 표지에 의해 시각화되어 상호 작용하는 단백질의 세포 내 위치에 해당하는 신호를 생성합니다. 예를 들어 ATM과 p53 사이에 확립 된 기능적 상호 작용을 사용하여 PLA가 DNA 손상 반응의 핵심 부분 인 단백질 간의 직접적인 상호 작용을 연구하기 위해 서스펜션 세포 배양에서 어떻게 사용될 수 있는지를 보여줍니다.
Introduction
DNA 손상은 단백질 – 단백질 상호 작용 및 DNA의 효율적이고 신속한 수리를 보장하는 번역 후 변형을 포함하는 고도로 규제 된 일련의 사건을 유발하여 게놈 무결성을 보호합니다 1 . 전형적으로, DNA 수리는 (공 초점) 형광 현미경에 의해 소위 이온화 방사선 유발 성 초점 (IRIF)의 형성을 모니터링함으로써 이온화 방사선에 노출 된 세포에서 연구된다. 많은 DNA 복구 및 DNA 손상 감지 단백질이 IRIF를 형성하는데, 이는 DNA 손상을지지하는 염색질 부위에서 핵 생성하는 단백질 복합체를 나타냅니다 2 , 3 . 시간 경과에 따른 IRIF의 위치와 해상도는 DNA 복구의 시공간적 조직에 대한 중요한 통찰력을 제공하며, 다양한 DNA 복구 경로의 참여를 나타낼 수 있습니다. DNA 손상의 특성과 손상이 이루어진 세포주기 단계에 따라 어떤 DNA 복구 경로가 활성화되는지가 결정됩니다. 포 예를 들어, DNA 복제 (S 상)에 적극적으로 관여하는 세포에서 상 동성 재조합 (homologous recombination, HR)이 세포 복제의 G1 또는 G2 / M 상 세포에서 우세한 DNA 복구 경로 인 반면, homologous end-joining (NHEJ) repair pathway가 우세하다. DNA 손상 후 가장 초기의 사건 중 하나는 DNA 손상 감지 키나제 인 Ataxia Telangiectasia-Mutated protein (ATM)의 활성화로 세포주기의 G1- 및 G2 / M- 상에 주로 활성화되고 NHEJ를 조절하며, 및 Ataxia Telangiectasia 및 Rad3 관련 단백질 (ATR) (HR 활성화에 의해 S 상으로 작용 함). ATM과 ATR은 모두 DNA 복구, 세포 사멸 및 생존과 관련된 많은 단백질을 인산화시키는 매우 pleiotropic kinases입니다. 두 키나아제 모두 유전 독성 스트레스에 노출 된 후 종양 억제 단백질 p53을 인산화시키고 활성화시키는 것으로 나타 났는데, 이는 이들 키나아제가 중추적 인 종양 억제 시그널링 축의 상류 중재자임을 나타낸다"xref"> 5 , 6 .
IRIF의 형성과 구성은 전형적으로 이중 색 면역 형광 염색법과 현미경 검사법을 사용하여 여러 단백질의 공존을 결정함으로써 평가되지만 수리 단백질 복합체의 일부인 모든 단백질이 IRIF를 형성하는 것은 아니며이 접근법의 적용 가능성을 제한합니다. 또한, (공 초점) 면역 형광 현미경 검사는 빛의 회절 특성에 의해 제한되어 약 200-300 nm의 공간 분해능을 나타내며, 대부분의 세포 하부 구조의 크기를 초과하며, 단백질 – 단백질 상호 작용의 직접적인 조사를 기본적으로 금지합니다 분자 수준. 이와 같이, (공 초점) 형광 현미경에 의해 검출 된 면역 형광 염색 패턴의 공동 위치 화는 직접적인 단백질 – 단백질 상호 작용을 나타내는 것은 아닙니다. 최근에, 3 차원 구조와 같은 새로운 초 – 해상도 기술이 개발되었다공 초점 레이저 스캐닝 현미경으로 검출 할 수 없었던 이들 단백질의 공간 분포 특성을 밝혀내는, 나노 스케일의 53BP1 및 BRCA1 IRIF 형성을 성공적으로 연구하는데 사용 된 tured illumination microscopy (3D-SIM) 7 .
공동 면역 침전법, 풀다운 방법 및 효모 2 하이브리드 스크리닝 방법과 같은 생체 내에서 단백질 – 단백질 상호 작용을 검출하는 데 몇 가지 다른 방법을 사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 기술은 다소 번거롭고 다량의 세포 또는 단백질을 필요로하거나 단백질의 과발현을 포함하여 실험적 인공물을 유발합니다. 보다 최근에는 Proximity Ligation Assay (PLA) 9 , 10 이라고 불리는 인 – 시튜 ( 즉 , 세포와 조직에서)의 단백질 – 단백질 상호 작용의 시각화 및 정량화를 가능하게하는 새로운 기술이 개발되었습니다. Pr관심있는 두 단백질을인지하는 imary 항체는 올리고 뉴클레오티드 (이른바 PLA 프로브)에 접합 된 2 차 항체에 의해 검출된다. 2 개의 상이한 2 차 항체가 1 차 항체에 의해 인식되는 단백질 사이의 상호 작용으로 인해 충분히 가깝다면, 접합 된 올리고 뉴클레오티드는 하이브리드 화되고 폐쇄 된 원형 DNA 기질을 형성하도록 연결될 수있다. 이 순환 기질은 롤링 서클 증폭에 의해 증폭되고, 형광색 – 결합 된 상보적인 올리고 뉴클레오타이드로 가시화된다. PLA를 사용하면, 단백질 – 단백질 상호 작용의 세포 내 위치는 형광 라벨 된 롤링 서클 증폭 – 제품이 PLA 프로브에 부착 된 상태로 보존된다. 이 분석법의 분해능은 항체의 직경이 약 7-10 nm 인 것으로 밝혀지면 <50 nm입니다. 롤링 서클 증폭은 두 쌍의 항체 (primary + secondary)는 크기 (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm)로 정의 된 경계 내에서 물리적으로 상호 작용합니다. 신호 증폭 단계는 PLA 분석의 감도를 증가시키고 거의 발현되지 않은 단백질의 상호 작용을 검출 할 수있게합니다. PLA는 세포 간 기초 (per cell basis)로 정량화 할 수있는 뾰족한, 초점과 같은 신호 패턴을 생성함으로써 단백질 – 단백질 상호 작용의 세포 내 및 세포 간 변이를 평가할 수있다.
DNA 복구 복합체 및 IRIF의 형성 및 조성은 인간 골육종 육종 상피 세포주 U2OS, 인간 배아 신장 세포주 HEK293 및 망막 색소 상피 세포주 RPE-1과 같은 접착 성 세포주에서 주로 연구된다. 성장하고 transfect하기 쉽습니다. 서스펜션 세포 배양은 림프 성 및 골수성 세포주와 같이 덜 사용되는데, 이들은 트랜스 팩션에 덜 민감하고 일반적으로 커버 슬립을 준수하지 않으므로 추가 / 대체 스트레스가 필요하다.이미징을위한 eps. 그러나 DNA 손상 반응은이 종양의 게놈 (운전자) 수차에 의해 자주 영향을 받기 때문에 림프계 및 골수 악성 종양의 맥락에서 매우 관련이 있으며 정상 림프구 및 골수이의 악성 형질 전환에 중추적 인 역할을한다 ( 전구 세포 (12 , 13 , 14) .
이 프로토콜은 정지 세포 배양에서 DNA 손상 유도 후 단백질 – 단백질 상호 작용을 평가하고 정량화하기 위해 PLA를 사용할 수있는 방법을 설명합니다. 여기에서, PLA는 G1 상 세포주기 정지를 겪도록 유도 된 인간 B 세포 백혈병 세포에서 DNA 손상시 ATM과 p53 간의 상호 작용을 결정하고 시각화하기 위해 수행된다. 참고로 여기에 제시된 프로토콜은 G1 구속 백혈병 세포에서 ATM 및 p53 상호 작용을 연구하는 것에 국한되지 않고 다른 단백질 – 단백질 상호 작용을 시각화하는 데 사용할 수도 있습니다다양한 세포 유형 및 현탁 세포 배양 물에 사용된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 보고서에서 PLA는 현탁 세포 배양에서 단백질 간의 특이 적 상호 작용을 결정하고 시각화하는 데 사용될 수 있음이 입증되었습니다. 참고로 여기에 설명 된 프로토콜은 DNA 복구 복합체의 연구에만 국한되지 않고 정지 세포 배양에서 다른 단백질 – 단백질 상호 작용을 시각화하고 정량화하는 데에도 적용됩니다. ATM 키나아제가 DNA 손상 유도제에 노출되었을 때 G1- 구속 된 BCR-ABL + B-ALL 세포에서 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Guikema 연구소의 연구는 네덜란드 연구기구 (VIDI grant 016126355)와 Stichting Kinderen Kankervrij KiKA (프로젝트 252)의 Innovational Research Incentives Scheme에 의해 지원됩니다.
Materials
| BV173 cell line | DSMZ | AC-20 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| SUP-B15 cell line | DSMZ | ACC-389 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco (Life Technologies) | 21980-032 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich | F7524 | lot #: 064M3396 |
| L-glutamine | Gibco (Life Technologies) | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 15140-122 | |
| imatinib methanesulfonate | LC Laboratories | I-5508 | Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution |
| neocarzinostatin | Sigma Aldrich | N9162 | Mutagenic/teratogenic, handle with care |
| KU55933 | Selleckchem | S1092 | Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution |
| Starfrost Microscopy Slides | Waldemar Knittel | VA11200 003FKB | |
| PAP pen liquid blocker | Sigma Aldrich | Z377821-1EA | |
| Cytospin funnel | Q Path Labonord SAS | 003411324 | |
| Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit | Sigma Aldrich | DUO92105 | Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green |
| goat-anti-ATM | Bethyl Laboratories | A300-136A | PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies |
| rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 | Cell Signaling Technology | 9284 | We succesfully used lot #9284-4 in our studies |
| Vectashield antifading mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Vectashield antifading mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Also available from various other vendors |
References
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