Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

Summary

Aqui, é demonstrado como o Ensaio de Ligação à Proximidade in situ (PLA) pode ser usado para detectar e visualizar as interações proteínas-proteínas diretas entre ATM e p53 em culturas de células suspensas expostas ao estresse genotóxico.

Abstract

A resposta ao dano do DNA orquestrou o reparo de lesões de DNA que ocorrem espontaneamente, são causadas por estresse genotóxico ou aparecem no contexto de quebras de DNA programadas em linfócitos. A Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM e Rad3-kinase (ATR) e a subunidade catalítica de DNA-dependente Protein Kinase (DNA-PKcs) estão entre os primeiros que são ativados após a indução do dano do DNA, e são Reguladores centrais de uma rede que controla o reparo do DNA, a apoptose e a sobrevivência celular. Como parte de uma via supressora de tumor, ATM e ATR ativam p53 através da fosforilação, regulando assim a atividade transcricional de p53. O dano do DNA também resulta na formação dos chamados focos induzidos por radiação ionizante (IRIF) que representam complexos de sensor de dano de DNA e proteínas de reparo que se acumulam nos locais de dano do DNA, que são visualizados por microscopia de fluorescência. A co-localização de proteínas em IRIFs, no entanto, não implica necessariamente dInterações proteína-proteína diretas, uma vez que a resolução da microscopia de fluorescência é limitada.

In-situ Proximity Ligation Assay (PLA) é uma técnica inovadora que permite a visualização direta de interações proteína-proteína em células e tecidos com especificidade e sensibilidade sem precedentes. Esta técnica é baseada na proximidade espacial de anticorpos específicos que se ligam às proteínas de interesse. Quando as proteínas interrogadas estão dentro de ~ 40 nm, uma reacção de amplificação é desencadeada por oligonucleótidos que são conjugados com os anticorpos e o produto de amplificação é visualizado por marcação fluorescente, produzindo um sinal que corresponde à localização subcelular das proteínas que interagem. Usando a interação funcional estabelecida entre ATM e p53 como exemplo, é demonstrado aqui como o PLA pode ser usado em culturas de células suspensas para estudar as interações diretas entre proteínas que são partes integrantes da resposta de danos ao DNA.

Introduction

O dano do DNA desencadeia uma série altamente regulada de eventos envolvendo interações proteína-proteína e modificações pós-tradução que garantem o reparo eficiente e rápido do DNA, salvaguardando assim a integridade genômica ¹ . Tipicamente, o reparo do DNA é estudado em células expostas à radiação ionizante, monitorando a formação dos chamados focos induzidos por radiação ionizante (IRIF) por microscopia de fluorescência (confocal). Muitas proteínas de detecção e detecção de dano do DNA formam IRIFs, que representam complexos de proteínas que nucleam em locais de cromatina sustentando dano de DNA ^{2 , 3} . A localização e a resolução dos IRIF ao longo do tempo fornecem uma visão importante da organização espaciotemporal do reparo do DNA e podem indicar o envolvimento de diferentes caminhos de reparo do DNA. A natureza do dano do DNA eo estágio do ciclo celular em que o dano é atingido determinam qual caminho de reparo do DNA é ativado. Fo Por exemplo, em células ativamente envolvidas na replicação de DNA (fase S), a recombinação homóloga (HR) é a via de reparo do DNA dominante, enquanto que nas células na fase G1 ou G2 / M do ciclo celular, a célula não- É predominante a via de reparo homóloga de junção final (NHEJ). Um dos primeiros eventos após o dano do DNA é a ativação das cinases sensíveis ao dano do DNA Ataxia Telangiectasia-proteína mutada (ATM), que é principalmente ativa nas fases G1 e G2 / M do ciclo celular e regula o NHEJ, E Ataxia Telangiectasia e Proteína Relacionada a Rad3 (ATR), que atua em fase S ativando a FC. Ambos ATM e ATR são quinases muito pleiotrópicas que fosforilam muitas proteínas envolvidas no reparo do DNA, morte celular e sobrevida ⁴ . Ambas as quinases demonstraram fosforilar e ativar a proteína supressora de tumores p53 após a exposição ao estresse genotóxico, indicando que essas cinases são mediadores a montante de um eixo de sinalização de supressão de tumor fundamental"Xref"> 5 ^{, 6} .

A formação e a composição dos IRIFs são tipicamente avaliadas pela determinação da co-localização de diferentes proteínas usando coloração e microscopia de imunofluorescência de duas cores, no entanto, nem todas as proteínas que fazem parte dos complexos de proteínas de reparo formam IRIFs, o que limita a aplicabilidade desta abordagem. Além disso, a microscopia de imunofluorescência (confocal) é limitada pelas propriedades de difracção da luz, resultando em uma resolução espacial bastante fraca de cerca de 200-300 nm, excedendo o tamanho da maioria das estruturas subcelulares, o que essencialmente proíbe a interrogação direta das interações proteína-proteína ao O nível molecular. Como tal, a co-localização de padrões de coloração de imunofluorescência como detectada por microscopia de fluorescência (confocal) não é necessariamente indicativa de interações diretas proteína-proteína. Recentemente, novas tecnologias de super-resolução foram desenvolvidas, como a estrutura tridimensionalMicroscopia de iluminação tingida (3D-SIM) ⁷ , que foi utilizada com sucesso para estudar a formação de IRF de 53BP1 e BRCA1 em detalhes de nano-escala, revelando as características de distribuição espacial dessas proteínas que não foram detectadas por microscopia confocal de varredura a laser ⁸ .

Vários outros métodos podem ser usados ​​para detectar interações proteína-proteína in vivo , tais como métodos de co-imunoprecipitação, pull-down e abordagens de rastreio de dois híbridos de fermento. No entanto, essas técnicas são bastante pesadas, exigem grandes quantidades de células ou proteínas ou envolvem a superexpressão de proteínas, que introduzem artefatos experimentais. Mais recentemente, desenvolveu-se uma nova técnica que permite a visualização e quantificação de interações proteína-proteína in situ ( isto é, nas células e nos tecidos), denominada Ensaio de Ligação Proxima (PLA) ^{9 , 10} . PrOs anticorpos imateriais que reconhecem duas proteínas de interesse são detectados por anticorpos secundários que são conjugados com oligonucleótidos (as chamadas sondas PLA). Se os dois anticorpos secundários diferentes forem suficientemente próximos devido às interacções entre as proteínas reconhecidas pelos anticorpos primários, os oligonucleótidos conjugados hibridam e podem ser ligados para formar um substrato de ADN circular fechado. Este substrato circular é subsequentemente amplificado por amplificação do círculo circulante e visualizado com oligonucleótidos complementares conjugados com fluorochrome. Usando PLA, a localização subcelular da interação proteína-proteína é preservada à medida que o produto de amplificação do círculo de rolamento com marcação fluorescente permanece ligado às sondas PLA. A resolução deste ensaio é <50 nm, com base no achado de que o diâmetro de um anticorpo é de aproximadamente 7-10 nm ¹¹ . A amplificação do círculo circulante só pode ocorrer no caso de dois pares de anticorpos (primário + segundo planoDary) interagem fisicamente dentro do perímetro que é definido pelo seu tamanho (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). O passo de amplificação do sinal aumenta a sensibilidade do ensaio de PLA e permite a detecção de interações de proteínas raramente expressas. O PLA gera padrões de sinais pontuais e focos que podem ser quantificados por célula, pelo qual a variação intra e intercelular nas interações proteína-proteína pode ser avaliada.

A formação e composição de complexos de reparo de DNA e IRIFs são principalmente estudadas em linhas celulares aderentes, como a linha celular epitelial de osteossarcoma de osso humano U2OS, a linha de células de rim embrionárias humanas HEK293 e a linha de células epiteliais de pigmento retiniano RPE-1, Crescente e fácil de transfectar. As culturas de células de suspensão, tais como linhagens linfóides e mieloides, são usadas com menos frequência, uma vez que estas são menos favoráveis ​​à transfecção e, em geral, não aderem aos lamínulas, exigindo, assim, uma alternativa adicionalEps para imagens. A resolução do dano do DNA é, no entanto, muito relevante no contexto de malignidades linfóides e mielóides, uma vez que a resposta ao dano do DNA é freqüentemente afetada por aberrações genômicas (excitadores) nesses tumores, desempenhando um papel fundamental na transformação maligna de linfóides e mieloides normais ( Células progenitoras ^{12 , 13 , 14} .

Este protocolo descreve como o PLA pode ser usado para avaliar e quantificar as interações proteína-proteína após a indução do dano do DNA em culturas de células em suspensão. Aqui, o PLA é realizado para determinar e visualizar as interações entre ATM e p53 após o dano do DNA em células de leucemia de células B humanas que são induzidas a sofrer uma parada do ciclo celular em fase G1. De notar que o protocolo aqui apresentado não se restringe ao estudo de interações ATM e p53 em células de leucemia detidas por G1, mas também pode ser usado para visualizar outras proteínas-proteína interativaEm vários tipos de células e culturas de células suspensas.

Protocol

1. Tratamento de indução de células e dano de DNA Cultive as linhas celulares linfoblásticas agudas BCR-ABL + B celulares BV173 ou SUP-B15 em IMDM suplementado com FCS a 20%, β-mercaptoetanol 50 μM, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U / mL e estreptomicina 100 μg / mL em 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 . Conte células e placa a 2 x 10 6 células / mL em placas de 6 poços, a 5 mL / poço. NOTA: Opcionalmente, as linhas celulares de suspensão de várias origens podem s…

Representative Results

A fosforilação de p53 no resíduo Ser15 mostrou-se dependente da actividade de quinase ATM 16 . Para demonstrar e confirmar a especificidade da técnica de PLA em preparações de citospina de culturas de células em suspensão, mostra-se que a indução de dano do DNA por 2 h de tratamento NCS de células BCR-ABL + B-ALL presas na fase G1 do ciclo celular Resultou na interação específica entre ATM e phospho-Ser15-p53, como esperado. Os sinais PLA punctivos f…

Discussion

Neste relatório, é demonstrado que PLA pode ser usado para determinar e visualizar a interação específica entre proteínas em culturas de células em suspensão. De notar que o protocolo aqui descrito não se restringe ao estudo de complexos de reparo de DNA, mas também se aplica para visualizar e quantificar outras interações proteína-proteína em culturas de células em suspensão. Mostra-se que a quinasa ATM interage com p53 fosforilada em células BCR-ABL + B-ALL presas em G1 quando expostas a um agente ind…

Materials

BV173 cell line	DSMZ	AC-20	BCR-ABL+ B-ALL cell line
SUP-B15 cell line	DSMZ	ACC-389	BCR-ABL+ B-ALL cell line
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco (Life Technologies)	21980-032
Fetal Calf Serum	Sigma Aldrich	F7524	lot #: 064M3396
L-glutamine	Gibco (Life Technologies)	25030-024
penicillin/streptomycin	Gibco (Life Technologies)	15140-122
imatinib methanesulfonate	LC Laboratories	I-5508	Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution
neocarzinostatin	Sigma Aldrich	N9162	Mutagenic/teratogenic, handle with care
KU55933	Selleckchem	S1092	Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution
Starfrost Microscopy Slides	Waldemar Knittel	VA11200 003FKB
PAP pen liquid blocker	Sigma Aldrich	Z377821-1EA
Cytospin funnel	Q Path Labonord SAS	003411324
Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit	Sigma Aldrich	DUO92105	Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green
goat-anti-ATM	Bethyl Laboratories	A300-136A	PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies
rabbit-anti-phospho-Ser15-p53	Cell Signaling Technology	9284	We succesfully used lot #9284-4 in our studies
Vectashield antifading mounting medium with DAPI	Vector Labs	H-1200
Vectashield antifading mounting medium	Vector Labs	H-1000
4% paraformaldehyde in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	Also available from various other vendors