Summary
מאמר זה מדגים כיצד תרבות תודרנית לבנה השתילים בשטח פלטפורמה דו שכבתי microfluidic מגבילה את הבסיס העיקרי ואת שערות השורש למישור אופטי יחיד. פלטפורמה זו יכולה לשמש עבור הדמיה אופטית בזמן אמת מורפולוגיה שורש בסדר גם באשר דימות ברזולוציה של באמצעים אחרים.
Abstract
שערות השורש להגדיל שטח הבסיס ספיגת מים טובה יותר, מזין הקליטה על ידי הצמח. כי הם קטנים בגודלם, לעיתים קרובות מטושטשים על ידי הסביבה הטבעית שלהם, מורפולוגיה שורש השיער ותפקוד הם קשה ללמוד לעיתים קרובות נשלל מן הצמח המחקר. בשנים האחרונות, פלטפורמות microfluidic הציעו דרך להמחיש מערכות שורשים ברזולוציה גבוהה מבלי להפריע את השורשים במהלך העברה אל מערכת הדמיה. פלטפורמת microfluidic הציג כאן בונה על מחקרים קודמים של הצמח על-גבי שבב על-ידי שילוב מכשיר דו שכבתי להגבלת השורש העיקרי תודרנית לבנה על אותו מישור אופטי כמו שערות השורש. עיצוב זה מאפשר כימות של שערות השורש על סלולרית ומונעת אברון רמה וגם ציר z נסחף בעת הוספת טיפולים ניסיוניים. אנו מתארים כיצד לאחסן את ההתקנים בסביבה כלולות, רטוב, ללא צורך משאבות fluidic, תוך שמירה על סביבה gnotobiotic שתיל. לאחר הניסוי דימות אופטי, ההתקן עשוי להיות רמקול ניתן לפירוק, משמש מצע כוח אטומי או סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים תוך שמירה על שורש בסדר מבנים שלמים.
Introduction
שורש בסדר תכונות להגדיל מים ורכישה התזונתי של הצמח, לחקור מקומות אדמה חדשה ואת הגדלת שטח הפנים הכולל שורש. המחזור של תכונות אלה שורש בסדר ממלאת תפקיד מרכזי ממריצה את שרשרת המזון הרכבת התחתית1 , המספר של שורשים בסדר מיני צמחים מסוימים הוא צפוי להכפיל תחת דו תחמוצת הפחמן באטמוספירה מוגברות2. שורשים בסדר בדרך כלל מוגדרים אלה קטן מ- 2 מ מ קוטר, אף על פי הגדרות חדשות דוגל אפיון שורשים בסדר על-ידי הפונקציה שלהם3. כמו שורשים משובחים רבים, שערות השורש לספק את הפונקציה של ספיגת וספיגה אך תופסים מקום קטן עם קטרים הסדר מיקרון. בשל גודלם הקטן, שערות השורש קשה התמונה ב באתרו , הם לעתים קרובות התעלמו כחלק של הארכיטקטורה הכוללת שורש ב שדה ניסויים בקנה מידה ומודלים.
אקס טרה שורש השיער לחקר, כגון החל בשתילים שגדלו על פלטות אגר, סיפקו את הקהילה המדעית עם מידע חשוב על צמיחה סלולרי, תחבורה4,5. בעוד פלטות אגר מאפשרים מערכות שורשים לדימות גמישה, בזמן אמת, הם לא מציעים בקרה סביבתית גבוהה עבור התוספת של ניסיוני טיפולים כגון חומרים מזינים, הורמונים צמחיים או חיידקים. פתרון המתעוררים הקלת הדמיה ברזולוציה גבוהה תוך כדי גם מנקר דינמי הסביבתי היה הופעתו של פלטפורמות microfluidic ללימודי צמח. פלטפורמות אלה אפשרו את הצמיחה הרסניות והדמיה של מספר מיני צמחים עבור תפוקה גבוהה phenotyping6,7,8,9, טיפולים כימיים מבודד 10כוח מדידות11,12, התוספת של מיקרואורגניזמים13. Microfluidic פלטפורמה עיצובים התמקדו השימוש של שכבות fluidic יחיד שטח פתוח שבו השורשים עלול להפיץ, המתיר את שערות השורש להיסחף פנימה והחוצה במיקוד אופטי במהלך צמיחה או טיפול.
כאן אנו מציגים הליך לפיתוח פלטפורמה דו שכבתי microfluidic באמצעות צילום ושיטות רך-ליתוגרפיה בונה על תכנונים קודמים של הצמח על-גבי שבב על ידי כך שמניחים את השערות שורש שתיל למטוס הדמיה אותו כבסיס העיקרי. זה מאפשר לנו לעקוב אחר התפתחות שורש השיער בזמן אמת, ברזולוציה גבוהה, לאורך כל תהליך טיפול ניסיוני. השיטות culturing שלנו מאפשרים תודרנית לבנה השתילים להיות מונבטים מזרע בתוך הפלטפורמה, בתרבית במשך שבוע בסביבה רטוב וסטרילי שלא דורש שימוש ציוד משאבת מזרק. ברגע דימות הניסוי זמן לשגות הגיע למסקנה, ניתן לפתוח את הפלטפורמה המובאת כאן מבלי להפריע את המיקום של התכונות שורש עדינה יותר. פעולה זו מאפשרת את השימוש בשיטות הדמיה אחרות ברזולוציה גבוהה. כאן אנו מספקים תוצאות נציג כימות והדמיה של שורש השיער מורפולוגיה פלטפורמה זו על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים, סריקה אופטית (SEM), כוח אטומי טכניקות במיקרוסקופ (AFM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. דו שכבתי פלטפורמה פבריקציה נוספת
- ייצור של מאסטרים מרובת שכבות
- ספין מעיל על בסיס אפוקסי photoresist שליליות (~63.45% מוצקים, 1,250 cSt) על פי מפרט היצרן (2,000 סל ד עבור 45 s) על גבי סיליקון בקוטר 4 אינץ רקיק כדי להשיג את הגובה הרצוי של 20 מיקרומטר על השכבה הראשונה של עיצוב.
- רך-אופים מוצרי קונדיטוריה להתנגד מצופה במשך 4 דקות ב- 95 מעלות צלזיוס. לאפשר וופל לקרר במשך 5 דק לחשוף כשהפחד לאור אולטרא סגול 15 s (~ 150 mJ/cm2 -365 ננומטר) דרך photomask ב- UV פנה aligner להגדרת הגיאומטריה של השכבה התחתונה.
- לאחר חשיפה לאפות כשהפחד למשך 5 דקות ב 95 ° C. ללא פיתוח, תשואה כשהפחד coater ספין, ספין על שכבה נוספת של photoresist שלילי על בסיס אפוקסי (~76.75% מוצקים, 80,000 cSt) ב-3000 סל ד כדי להשיג גובה השכבה השנייה של 150-200 מיקרומטר.
- לאפשר כשהפחד לנוח במשך 5 דקות לפני העברת פלטה 95 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. לאחר האפייה על פלטת הבישול, להסיר כשהפחד ולאפשר את להתנגד מגניב, להקשיח בטמפרטורת החדר למשך עוד 5 דקות על משטח שטוח ברמה. ליישר ולחשוף את לחם הקודש photomask השכבה השנייה ב-30 s ב- aligner קשר UV (מנה של-300 mJ/cm2).
- לבצע את העוגות לאחר חשיפה על ידי הצבת את לחם הקודש על גזייה למשך 15 דקות ב 95 ° C ולאחר מכן אפשר כשהפחד להתקרר על משטח שטוח רמה במשך 5 דקות לפני פיתוח.
- לפתח שתי שכבות להתנגד בו זמנית על-ידי הצבת כשהפחד לתוך צלחת פלסטיק, השוקע כשהפחד במפתח המתאים (ראה טבלת חומרים). בעדינות רוק המנה מדי פעם כדי לשטוף את מפתח טריים מעל פרוסת סיליקון.
- אחרי 17 דקות, לשטוף את וופל עם אלכוהול איזופרופיל (IPA). אם סרט לבן מופיע, להמשיך לחזר בין שטיפה כשהפחד עם מפתח, IPA עד הסרט נעלם. יבש את פרוסות סיליקון בדוגמת עם חנקן.
- Polydimethylsiloxane רך-ליתוגרפיה
- לחשוף את וופל סיליקון פלזמה אוויר ב-30 s בפלזמה מנקה להגדיר גבוה (ראה טבלת חומרים) כדי לנקות. Silanize כשהפחד עם טריכלורו (1H 1H, 2H, 2H-perfluoro-n-אוקטיל) silane בשכונה כימי על גזייה מתחת רחוק ממוקד של silane (85 ° C) במשך שעתיים.
- יוצקים 10:1 יחס של polydimethylsiloxane (PDMS) לסוכן ריפוי אל כשהפחד בסיס סיליקון. דגה את PDMS מעורב בתוך תא ואקום ולרפא ואז הפולימר בתנור 70 ° C 1 h או עד PDMS נרפאה לחלוטין.
- באמצעות אזמל, לחתוך את המכשירים PDMS ו לקלף אותן מן כשהפחד בסיס סיליקון. להשתמש אגרוף ביופסיה 1.5 מ מ כדי ליצור אינלטס זרע וטיפול, להכות את כניסת הזרע בזווית של 45° כדי לעודד צמיחה השורש לתוך התעלה הראשית.
- השתמש ברור דבק כדי הסרת לכלוך מהמכשיר PDMS ומניחים בצד עיצוב המכשיר למטה על coverslip זכוכית. אוטוקלב המכשירים מורכבים.
2. נטיעת התקנים
- הכנת זרע תודרנית לבנה
- משטח לחטא לבנה א זרעים צינור microfuge עם פתרון של 30% זמינים מסחרית אקונומיקה בדילול ותחטא מיוננים מים ו- 0.1% X טריטון מינימלית 7 הזרעים שטיפת 4 פעמים עם מים סטריליים.
- Stratify זרעים על ידי קירור microfuge צינור למשך הלילה או עד שבוע ב 4 º C.
- הכנת התקן
- למקם את התקנים סטיריליים ואקום degassing כדי להוציא אוויר מן הגז PDMS חדיר וערוצי fluidic כדי לשפר את הקלות של מילוי.
- להסיר את ההתקנים מן החדר ואקום ויציפו מיד את ההתקנים צלחת פטרי מלא עם נוזל מדיית צמחית ¼ כוח ב- pH 5.7.
- באמצעות פיפטה של, משוך נוזלי דרך פתחי הכניסה כדי למלא את המכשיר. ודא כי אין בועות אוויר יישאר בתוך ערוצי על ידי בדיקה חזותית.
- העברה התקנים אינדיווידואליים פטרי יבשה חדשה. יוצקים או פיפטה אגר חמה מסביב למכשיר עד רמת אגר כמעט מיושר עם החלק העליון של המכשיר PDMS. לאפשר אגר לגבש.
הערה: התקנים עכשיו מוכנים לזריעה זרעים או שניתן לאחסן ב 4 ° C עד שהוא נדרש.
- שתילת זרעים בתוך מכשירים
- בסביבה סטרילית, העברת זרע סטיריליים אחד לים של כל התקן באמצעות פיפטה קטן.
- כסו צלחת פטרי עם שעווה סרט (ראה טבלת חומרים) ומניחים תא לגידול אופניים/כהה או אדן החלון בטמפרטורת החדר. אוריינט הפטרי כך ההתקנים הם אנכי ותעודד הכבידה שורשים כדי לגדול דרך הערוץ.
3. טיפול
- ניסיוני טיפולים
- בזמן הרצוי בפיתוח של שתיל, להוסיף את טיפול ניסיוני שתיל על-ידי הוספת כמות לפי מרשם של הטיפול לכל אחד הצד 8 יציאות באמצעות פיפטה.
- Reseal הפטרי ולחזור תא לגידול או על אדן החלון.
- להמשיך עם הדמיה דגימות בזמן הרצוי כדי ללכוד את נקודות זמן הפרט או להתחיל זמן לשגות הדמיה.
4. הדמיה אופטית
- להוריד הדמיה ברזולוציה (4-20 X)
- מניחים את כל צלחת פטרי המכילות את המכשיר ואת שתיל תחת מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך עבור שדה מוארים רזולוציה (4-20 X) נמוך או התערבות דיפרנציאלית ניגודיות (DIC) הדמיה. למטב את תנאי תאורה התירי תכוניות מורפולוגיות של עניין על-ידי התאמת פעמים חשיפה, המנורה בהירות, צמצם, את הקיטוב של אור. נסיעה על הבמה באזור הרצוי השורש ואת המיקוד על שורש או root hair(s) של עניין.
- רוכשים לנקודת זמן אחת או סדרה זמן של תמונות. כדי להמחיש את הצמיחה של שערות השורש, תמונה שערות השורש גדל פעם אחת בכל מין. כדי להמחיש את הצמיחה של השורש העיקרי, לרכוש תמונה אחת כל 30 דקות חזרה הפטרי את השתילים תא לגידול או על אדן החלון בצורה מאונכת השלמת ההדמיה.
- הדמיה ברזולוציה (20-63 X) גבוה יותר
- לאחר שתיל גדל לזמן הרצוי, להשתמש מלקחיים כדי להסיר coverslip והתקן אגר. נקה מתחתית coverslip באמצעות רקמות מעבדה של אתנול שנרטבו.
- התקשורת טבילה המומלצת חלות על המטרה כפי שהוצע על ידי יצרן עדשות למיקרוסקופ. מניחים את coverslip למטה על הבמה מיקרוסקופ ולגדל לשלב ליצור קשר עם התקשורת טבילה על המטרה. מיטוב לתנאי התאורה על ידי התאמת פעמים חשיפה, המנורה בהירות, צמצם, את הקיטוב של אור. נסיעה על הבמה האזור הרצוי מבטיחות על root hair(s) של עניין.
הערה: DIC יש צורך לדמיין cytoplasmic streaming, סמני פלורסצנטיות נדרשים כדי להמחיש אברון תנועה. - כדי לכמת את צמיחת שורש השיער לאורך זמן, רוכשים תמונה אחת לכל מין. כדי להמחיש אברון תנועה, למזער את הזמן חשיפה פלורסצנטיות תוך שמירה על אות זיהוי קרינה פלואורסצנטית מ organelles. לרכוש תמונות של organelles הכי מהר זמן החשיפה מאפשרת. עוד זמן לשגות הדמיה, לשימוש במדגרה הבמה הדמיה של תאים חיים כדי לשמור על טמפרטורת הסביבה ולחות.
הערה: מטרה שמן X 63 מומלצת הדמיה organelles שורש השיער.
5. הלא-הדמיה אופטית
- הכנת התקן
- ברגע שתיל גדלה במשך הזמן הרצויים.
- הפקדה של דק (~ 20 ננומטר) שכבה של כרום על גבי הבסיס, סביב PDMS באמצעות קרן אלקטרונים האקדח כפול אידוי התא.
- העבר את השורש ואת המכשיר PDMS תא לסרוק בעזרת מיקרוסקופ אלקטרון.
הערה: הדמיה תנאים, דהיינו מתח, המרחק הנוכחי ועובד יהיה צורך ניתן למטב כדי להשיג את הרזולוציה הרצויה עבור יישום מסוים.
- הר PDMS התקן root בצד למעלה בקופסת הדגימה AFM. כדי להגדיל את החדות במצלמה ביתר קלות בין השורש PDMS, מקם את המכשיר PDMS על מצע רעיוני במול (כגון נציץ מצופה בזהב) לפני טעינת המכשיר את המחזיק הדגימה AFM.
- לאבטח קובץ מצורף גם נוזלי על גבי המכשיר PDMS ולמלא את זה עם מים כדי לשמור את השורשים להתייבש במהלך דימות.
- לטעון המחזיק הדגימה לתוך AFM. להתאים את z-הפקד על העובי של המכשיר PDMS ולנסוע הזיז לאזור של ריבית הבסיס בעזרת מצלמה להדרכה.
- יישר את הלייזר עם קצה שלוחה. לקבלת התוצאות הטובות ביותר עם קשר במצב הדמיה, להשתמש cantilevers עם האביב קבועים של N/m 0.01 או 0.03 נקודות היכולת להפעיל כוח מינימלי על השורש במהלך סריקה.
- הורידו לאט את מנגנון סריקה עד הזיז רק יוצר קשר עם הדוגמה. להתאים את גודל סריקה עבור האזור הרצוי ובחר מהירות סריקה של קו 1/s עם 256 נקודות מתח בכל שורה. רוכשים את הסריקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דו שכבתי PDMS microfluidic להתקנים המתוארים כאן יש 200 מיקרומטר גבוהה ערוץ בסיס תודרנית הראשי, תא גבוה 20 מיקרומטר להגבלת שערות השורש גדל רוחבית (איור 1 א'). עיצוב זה יכול לשמש עבור מיני צמחים עם קטרים שורש דומה כמו תודרנית לבנה , ניתן לשנות בקלות כדי להתאים מינים בגדלים שונים. העיצוב משלב מעין שקע בחופו של הצמח, כמו גם 8 אינלטס צד לכל טיפול כימי או ביולוגי הרצוי. Prefilling ההתקנים עם מדיה ולמזוג אגר מסביב למכשיר שומר על הסביבה שורש להתייבש משך זמן הניסוי ללא צורך ציוד fluidic חיצוני. (איור 1B) אגר מייצב גם את המכשיר בתוך הפטרי, המאפשר את השתילים גדל באופן אנכי כדי לעודד צמיחה השורש במורד הערוץ המרכזי. הפטרי שומר את השתילים הכלול סביבה gnotobiotic ומאפשר מערכת השורשים לדימות דרך הפטרי כדי הגדלה עד 20x. אפשרות נוספת יהיה לאטום ישירות להתקן PDMS זכוכית-תחתון פטרי עבור הגדלה אופטית גבוהה יותר.
תודרנית לבנה זרעים אפשר לשתול ישירות לתוך הים התקן זה הוא אגרוף בזווית של 45 מעלות כדי להקל על צמיחה השורש לתוך התעלה הראשית. (איור 1C) הגובה של המכשיר PDMS לא יעלה בעוד כמה מילימטרים, כמו העלים צריכים להיות מסוגלים לצמוח מתוך החלק העליון של הפלטפורמה. בשל גודלם הקטן, Arabidopis זרעים קשים מאוד להציב כך הקיצוני שורש המתעוררים פונה הערוץ על נביטה. לכן, כמחצית הזרעים שתל נובטים שבעליהם בערוצים, אינה יכולה לשמש לניסויים ויזואליזציה שורש. התקנים מ שתילים אלה ייתכן re בלוקי ומשמש שוב החל שלב 2.2. כדי לעודד את צמיחת תודרנית לבנה יורה phototrophic, לחדר הצפייה של המכשיר עשוי להיות מכוסה רדיד אלומיניום כדי לחסום את האור ולשפר את אחוזי הצלחה. תודרנית לבנה השורשים גדלו בהתמדה במשך שבוע, באיזה שלב הצמיחה הופך להיות מופנה כלפי לרוחב שורש היווצרות פלטפורמה זו. (איור 1D) קצב גדילת השורשים פלטפורמה זו הם המקבילה שיעורי צמיחה של שורשים תודרנית לבנה פלטפורמות אחרות microfluidic. 13 העיצוב דו שכבתי בהצלחה מגבילה את השערות שורש באותו המטוס הדמיה כבסיס העיקרי. (איור 1E) עם זאת, כמה שערות השורש יכול להמשיך לגדול בתעלה המרכזית בפוקוס אופטי, עיצובים עתידיים צריכים לשאוף יותר בהדרגה מדריך שערות השורש לתוך תא שורש השיער.
איור 1: צמיחה של תודרנית לבנה דו שכבתי Microfluidic פלטפורמה. (א) התקן מורכב שתי שכבות להגבלת שערות השורש למטוס הדמיה אותו כבסיס העיקרי (גודל 1 מ מ). שתילי לבנה א ייתכן (B) הכלולים בסביבה gnotobiotic, (ג) מונבטים מזרע בתוך המכשיר, קנה המידה של בר = 400 מיקרומטר, (D) ולעקוב אחר התפתחות לצמיחה במשך שבוע (קווי שגיאה הן סטיית תקן, SD) . שורש נציג (E) A הוא עם תמונה ברציף, סולם בר = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
בתוך הפלטפורמה microfluidic, שערות השורש ניתן לכמת ברמה התאית מבחינת אורכם, צפיפות, את angularity של הצמיחה שלהם מן השורש. (איור 2 א) אורך שיער שורש וצפיפות של לבנה א פראי סוג בשתילים שגדלו בפלטפורמה שלנו נמצאים בטווח בשתילים שגדלו אנכית על פלטות אגר. 14 הזווית של צמיחת שורש השיער היא בדרך כלל בניצב למשטח של השורש. הפלטפורמה שלנו, angularity של צמיחת שורש השיער לכיוון הקצה עשוי להיות פועל יוצא של ריתוק של שערות השורש מטוס 2-ממדי. גירוי מכני, במקרה זה על ידי הקירות של המכשיר microfluidic, הוכח לגרום לשינויים צמיחה השורש ואת כיוון שיכול להסביר את הפער בין פלטפורמה מוגבלת microfluidic צלחת אגר פתוח. 15 . זה לא סביר כי פנוטיפ זה הוא התוצאה של הלחץ מזין בפלטפורמה שלנו כפי לבנה א שתילים לנצל את מאגרי המזון המאוחסן מן הזרע בימים הראשונים של צמיחה למרות היפוקסיה עשוי להיות דאגה במערכות שורש רוויות באופן מלא, החדירות חמצן של PDMS בעבר הוכיחה את התאימות של הפולימר עם חמצן לרקמות התלויים. 16 , 17
אחד היתרונות החזקים ביותר של פלטפורמות microfluidic על פני שיטות צלחת אגר הוא היכולת בצורה אחידה להוסיף ריכוז מדויק של טיפולים כימיים האורגניזמים. ב ערוץ אחד microfluidic פלטפורמות, התוספת של טיפולים יכול באופן פוטנציאלי תחסיר בסדר שערות השורש מ במיקוד אופטי. כאן נדגים קיום במיקוד אופטי שורש השיער שלנו פלטפורמה דו שכבתי microfluidic בעת הוספת חרוזים פלורסנט. באיור 2B שתיל זה עם תמונה (i) לפני ואחרי (ii) התוספת של חרוזי פוליסטירן carboxylated פלורסנט (כחול ואדום). התוספת של טיפול והאביוטיים זה לא הביאה את הכיוון או במיקוד אופטי של שערות השורש של שתיל.
סמני הדמיה, פלורסנט הגדלה גבוהה יותר עשוי לשמש כדי התמונה ולכמת שינויים ברמת אברון בפיתוח שורש השיער (איור 2C). Cytoplasmic streaming ניתן לראות שיער השורש מ (i) התערבות דיפרנציאלית חדות התמונה, אחר שורש השיער שתיל המכילה סמן של אברון טריפל18, מסלול התפוצה המרחבית של שלוש organelles ii) גולג'י (mCherry), peroxisomes (iii) (CFP), המיטוכונדריה (iv) (YFP) ניתן לראות את הטלה בעוצמה מרבית בחלונית בהתאמה לכל. התנועה של organelles שלושה אלה נלכדים בחלקה ההתפלגות המצטברת ב- 2C איור.
איור 2: אפיון שורש השיער. שערות השורש היו לכמת על י הסלולראיבל אורך (A), צפיפות ו angularity עבור n = 4 שתילים פראי סוג (WT) (קווי שגיאה הם SD). Angularity נקבע כמו הזווית בין קצה השורש הראשי ואת קצהו שורש השיער עם קצה השורש העיקרי הגדיר את סימן 0°. (B) המוקד אופטי של שערות השורש נותרת ללא שינוי (i) לפני ואחרי (ii) להתייחס אליהם עם חרוזים פלורסנט פוליסטירן (סולם בר = 100 מיקרומטר). (ג) אברון כימות רמת מומחש הדמיה של הזרמת (i) cytoplasmic מתמונת ניגודיות התערבות דיפרנציאלית, שיער שורש נפרד, ידי קרינה פלואורסצנטית של organelles שלושה: גולג'י (ii) (iii) peroxisomes, (iv) המיטוכונדריה (סולם בר = 10 מיקרומטר). אברון מסלולים היו דמיינו ידי מיזוג פלורסנט מתמונות שצולמו כל s 23-32 20 s. תנועות organelles שלושה שהיו תחת מעקב באופן אוטומטי, הפצות מהירות המצטבר המותווית על הזכות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
המכשיר PDMS שהוצגו כאן לא היה כימית התאחד כדי coverslip זכוכית, אבל מעדיף יוצרת קשר פיזי חלש נוסדה במהלך השלב autoclaving. פעולה זו מאפשרת להתקן לפרק בתום הניסוי דימות אופטי. המכשיר PDMS עשוי להיות מקולף מהזכוכית, הפוכה, משמש מצע הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר לא אופטי של המורפולוגיה שורש (איור 3 א). פלטפורמת בנוחות מחזיקה את השורש במקום במהלך מגע עם זיז במהלך מיקרוסקופ כוח אטומי (איור 3B). עוד, אם טיפול נלקח במהלך תהליך פירוק, שערות השורש יישארו במיקום על המצע PDMS. הוכח מתוך התמונה האופטי של השורש לפני את פירוק (איור 3C) ואחרי פירוק של פלטפורמת וציפוי שתיל בשכבת מוליך כרום nm 20 עבור הדמיה עם מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (דמות תלת-ממד ). לשמירה נוספת של שתיל לפני לפרק את הפלטפורמה, מקבע מבוסס-אלדהיד עשוי להיות מוזרק לתוך פלטפורמת כדי crosslink את החלבונים רקמות הצמח במקום.
איור 3: התקן דקונסטרוקציה והדמיה לא אופטי. (A) פלטפורמת microfluidic יכול להיות לפרק ו משמש מצע בשיטות הדמיה לא אופטי ברזולוציה גבוהה. (B) הטופוגרפיה משטח (תמונת דיפרקציה) של קצה השורש תודרנית לבנה היא תמונה באמצעות קשר במצב מיקרוסקופ כוח אטומי, סולם בר = 2 מיקרומטר. המיקום של הזיז הבסיס מסומן על ידי חץ שחור ב- שיבוץ, סולם בר = את 100 תמונה אופטי מיקרומטר. (ג) ו- (D) אלקטרון המתאימים micrograph סריקה של שתיל אותו לפני ואחרי התקן רמקול ניתן לפירוק. חצים להדגיש בסיס השערות שנותרו ללא הפרעה, סולם בר = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת במאמר זה ליצירת פלטפורמה צמח-על-שבב הוא ייחודי בכך דו שכבתי עיצוב וביתנו השערות שורש הדמיה מטוס בודד, פלטפורמת ייתכן מלונות־המלח ויש משמש מצע הדמיה לא אופטי ברזולוציה גבוהה . באמצעות הדמיה לא אופטי ברזולוציה גבוהה יכול לספק מידע רב ערך על רקמת הצמח כי לא היתה אפשרות לקבל מן הדמיה אופטיים לבד. לדוגמה, הדמיה AFM יכול לספק כוח מדידות כדי לחשב את האלסטיות של רקמות שורש במהלך הפיתוח, או לאחר טיפול כימי או ביולוגי. באופן דומה, הדמיה SEM שיכול לספק פרטים ברזולוציה גבוהה של פני השטח הטופוגרפי של רקמת השורש, כאשר מצמידים דימות כימי, יכול לספק מידע על הרכב היסודות של הרקמות. 19 דורות העתיד של הפלטפורמה microfluidic יכלול אופטימיזציה עבור תאימות עם מערכות הדמיה כימיים אחרים כגון לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון-המוני ספקטרוסקופיה (MALDI-MS) ו ראמאן נגד סטוקס קוהרנטי ספקטרוסקופיה (מכוניות).
שלבים קריטיים בשיטה זו כרוכות בשימוש אגר תאבטח את המכשיר ולספק לחות למפעל ללא צורך נהלים מסובכים זרימת נוזלים. יש לקחת טיפול גם כאשר לפרק את המכשיר PDMS מן המצע זכוכית על מנת לשמור על המורפולוגיה שורש שלם. אם המטרה ניסיוני מיועד אך ורק נמוך עד רזולוציה בינונית הדמיה אופטית ללא הצורך בהתקן דקונסטרוקציה, ההליך ניתן לשנות מבחינה כימית בונד להתקן המצע זכוכית המשמש כבסיס באמצעות חמצן פלזמה. רזולוציה גבוהה יותר ניתן לקבל תמונות ללא הסרת ההתקן מן הסביבה gnotobiotic על ידי כימית מליטה את PDMS ישירות אל כוס עם תחתית צלחת פטרי ותיאר ואז אגר שפיכת סביב PDMS כאמור.
העיצוב של 8 ערוצים לצד הטיפול היה ניסיון להגבלת טיפולים באזורים מסוימים של השורש. עם זאת, עיצוב זה הצליחה מונע פעפוע של הטיפול לאזורים אחרים של השורש בשל מוליכות של אזור פתוח בערוץ הבסיס העיקרי. באופן מקומי לטיפול השורש, הארכיטקטורה המכשיר יהיה צריך להיות מחדש כדי לתחום טיפולי או הטיפול צריך להיות מוצג באמצעות באמצעי התקשורת צמיגה להאט באופן זמני דיפוזיה ברחבי המכשיר.
אם זה רצוי עבור טיפולים ניסיוניים שיתווספו באמצעות זרימת, שינויים גם יידרש בפלטפורמה זו. כעת התוספת של זרימה לכל אחת אינלטס פלטפורמה תוצאות הגירוש של הזרע שלו כניסת והקושי לשלוט המיקום של טיפולים fluidic. שיטה זו פועלת היטב עבור השתילים כשבוע של גיל. זה מוגבל בתוך כמה זמן שתילים עלולה להמשיך לגדול ברציף, בגלל האורך של הערוץ המרכזי. שינויים בעתיד יכלול מתארך את הערוץ הראשי, שילוב יותר 200 מיקרומטר גבוהה ערוצי השורשים הצדדיים תוך שמירה על החדר גבוה 20 מיקרומטר עבור שורש השיער כליאה. שינוי זה ידרוש ידע על המיקום הצפויה של השורש לרוחב הופעתה על מנת לעצב מכשיר המתאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
כתב יד זה שערך על ידי UT-Battelle, LLC תחת חוזה מס דה-AC05-00OR22725 עם מחלקת האנרגיה של ארצות הברית. ממשלת ארצות הברית שומרת ובהיותו המו ל, על-ידי קבלת המאמר לפרסום, כי ממשלת ארצות הברית שומרת על רישיון לא בלעדי, הספקות, לעצמם, ברחבי העולם כדי לפרסם או לשחזר את הטופס שפורסם של כתב יד זה, או לאפשר לאחרים לעשות כך, למטרות ממשלת ארצות הברית. מחלקת האנרגיה של תספק גישה ציבורית אלה תוצאות של מחקר ממומן פדרלי לפי גישה ציבורית של חלון זה DOE התוכנית (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
עבודה זו נתמך בחלקה על ידי תוכנית המדע גנומית, משרד האנרגיה האמריקני, משרד המדע, ביולוגית המחקר הסביבתי, כחלק צמח חיידק ממשקים מדעי אזור המיקוד (http://pmi.ornl.gov). הזיוף של הפלטפורמות microfluidic בוצע במעבדה לחקר Nanofabrication במרכז עבור Nanophase חומרים מדעי, אשר DOE Office של המשתמש מתקן מדעי. JAA נתמך על-ידי מלגת מחקר לתואר שני אכ מ DGE-1452154
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100> | |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U | |
| laboratory tissue | Kimberly Clark | Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 | |
| Negative Photoresist Epoxy | Microchem | SU-8 2000s series | |
| Photoresist developer | Microchem | Su-8 developer | |
| trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane | Sigma Aldrich | use in chemical hood | |
| Air Plasma Cleaner | Harrick Plasma | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer base | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent | |
| Dessicator | Bel-Art | F42010-000 | |
| Scalpel | X-acto knife | ||
| Biopsy Punch | Ted Pella | 15110-15 | |
| Adhesive tape | Staples | Invisible Tape | |
| Microfuge tube | Eppendorf | ||
| Triton X | J.T.Baker XI98-07 | ||
| Bleach | Chlorox | concentrated | |
| Plant-Based Media | Phyto Technology Laboratories | M524 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Wax film | Parafilm | ||
| microscope | Olympus | IX51 | |
| Atomic Force Microscope | Keysight Technologies | 5500 PicoPlus AFM | |
| Petri dish | VWR | ||
| Scanning Electron Microscope | JEOL | 7400 | |
| Dual Gun Electron Beam Evaporator | Thermionics | Custom Dual Electron Gun Evaporation System |
References
- Pritchard, S. G. Soil organisms and global climate change. Plant Pathol. 60 (1), 82-99 (2011).
- Norby, R. J., Ledford, J., Reilly, C. D., Miller, N. E., O'Neill, E. G. Fine-root production dominates response of a deciduous forest to atmospheric CO2 enrichment. Proc. Natll. Acad. Sci. USA. 101 (26), 9689-9693 (2004).
- McCormack, M. L., et al. Redefining fine roots improves understanding of below-ground contributions to terrestrial biosphere processes. New Phytol. 207 (3), 505-518 (2015).
- Mangano, S., Juarez, S. P. D., Estevez, J. M. ROS regulation of polar-growth in plant cells. Plant Physiol. 171 (3), 1593-1605 (2016).
- Ketelaar, T., Emons, A. M. The Actin Cytoskeleton in Root Hairs: A Cell Elongation Device. Root Hairs. , 211-232 (2009).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse fluorescence imaging of Arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the RootChip. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281 (2014).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat. Methods. 9 (11), (2012).
- Meier, M., Lucchettta, E., Ismagilov, R. Chemical Stimulation of the Arabidopsis thaliana Root using Multi-Laminar Flow on a Microfluidic Chip. Lab Chip. 10 (16), 2147-2153 (2010).
- Ozoe, K., Hida, H., Kanno, I., Higashiyama, T., Notaguchi, M. Early characterization method of plant root adaptability to soil environments. Proc. of 28th IEEE Interntl. Conf. Micro. Electro Mech. Syst. , (2015).
- Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab on a chip. , 3262-3274 (2014).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. App. Phys. Lett. 98 (26), 2009-2012 (2011).
- Rigas, S., et al. Root gravitropism and root hair development constitute coupled developmental responses regulated by auxin homeostasis in the Arabidopsis root apex. New Phytolol. 197 (4), 1130-1141 (2013).
- Bengough, A. G., McKenzie, B. M., Hallett, P. D., Valentine, T. A. Root elongation, water stress, and mechanical impedance: A review of limiting stresses and beneficial root tip traits. J. Exp. Bot. 62 (1), 59-68 (2011).
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophor. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Nelson, B. K., Cai, X., Nebenführ, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51 (6), 1126-1136 (2007).
- Talbot, M. J., White, R. G. Cell surface and cell outline imaging in plant tissues using the backscattered electron detector in a variable pressure scanning electron microscope. Plant Methods. 9 (1), 40 (2013).
