Summary
والهدف من هذا البروتوكول عزل السلف غشائي الخلايا من دم الحبل السري. وتشمل بعض التطبيقات باستخدام هذه الخلايا كالعلامات البيولوجية لتحديد المرضى مع مخاطر القلب والأوعية الدموية، علاج الأمراض الدماغية، وخلق صمام الأوعية الدموية والقلب هندسة الأنسجة بنيات.
Abstract
وذكرت عشارة والزملاء1أولاً وجود خلايا السلف غشائي (ابكس) في الدم المحيطي ومشاركته في فاسكولوجينيسيس. في وقت لاحق، آخرون توثيق وجود أنواع مماثلة من ابكس التي تنشأ من نخاع العظام2،3. في الآونة الأخيرة، كان يودر وانجرام أظهرت أن ابكس المستمدة من دم الحبل السري احتمال التكاثري أعلى مقارنة بتلك المعزولة من الكبار الطرفية الدم4،،من56. وبصرف النظر عن تورطه في فاسكولوجينيسيس بعد الولادة، كما أظهرت ابكس الوعد كمصدر خلية لإنشاء هندسة الأنسجة والأوعية الدموية والقلب صمام بنيات7،8. مختلف عزل البروتوكولات موجودة، التي تنطوي على الفرز خلية من الخلايا وحيدات النوى (الشركات المتعددة الجنسيات) المستمدة من المصادر المذكورة آنفا مع مساعدة علامات بطانية والمكونة للدم، أو استزراع هذه الشركات المتعددة الجنسيات مع نمو غشائي المتخصصة المتوسطة، أو مزيج من هذه الأساليب9. هنا، نقدم بروتوكولا للعزلة وثقافة ابكس استخدام المتخصصة غشائي المتوسطة وتستكمل مع عوامل النمو، دون استخدام إيمونوسورتينج، متبوعاً بتوصيف الخلايا المعزولة باستخدام النشاف الغربية و إيمونوستينينج.
Introduction
لقد درسنا العديد من المحققين بخصائص وإمكانيات بشرية ابكس5،،من1011،،من1213. يمكن وصف ابكس كتعميم الخلايا التي لها القدرة على التمسك بالانسجة غشائي في مواقع من نقص، الاسكيمية، والإصابة، أو تشكيل الورم وتسهم في تشكيل هياكل الأوعية الدموية الجديدة4،14. مشاركتها الملحوظة في نيوفاسكولاريزيشن، في شكل فاسكولوجينيسيس بعد الولادة، وقد أدى إلى فهم الفسيولوجيا المرضية لهذه الخلايا واستخدامها في تطبيقات علاجية4،15، 16. قد تبين عدد ابكس في فرد إلى الارتباط مع أمراض القلب والأوعية الدموية9،،من1516،،من1718،19 ،20. أيضا دراسات أخرى متباينة ابكس في النمط الظاهري تنتجها الخلايا الليفية مثل صمام واقترح أنه يمكن استخدام هذه الخلايا لصمامات القلب هندسة الأنسجة7،21.
لم يتم تحديد خلية معينة الجزيئات السطحية اللازمة لعزل ابكس الواضح بسبب التباين بين التحقيقات4. انضمام الشركات المتعددة الجنسيات إلى مصفوفة معينة، مع التعرض لمجموعة متنوعة من شروط الثقافة، قامت به عدة مجموعات1،17،22،23، مما يوحي بأنه قد ابكس المفترضة عرض خصائص المظهرية مختلفة. هذه الخصائص تشمل الافتقار إلى القدرة فاجوسيتوتيك وتشكيل أنبوب في ماتريجيل، وامتصاص البروتينات الدهنية لوودينسيتي أسيتيلاتيد ديل. كلونوجينيك عالية وإمكانات التكاثري هي اثنين من الخصائص مع ابكس الذي يمكن أن يكون كهنوت5. يمكن أيضا أن تشكل ابكس في المختبر الأنابيب عند كوكولتوريد مع الرئة الجنين البشري الليفية4. تعرف هذه الخلايا للتعبير عن علامات خلية غشائي السطحية وأن أشاطركم بعض علامات المكونة للدم13،،من2425. هي علامات إيجابية أعرب تكون مقبولة على نطاق واسع ابكس فينوتيبينج CD31، CD34، مستقبلات عامل نمو غشائي الأوعية الدموية 2 (VEGFR2)، فون ويليبراند عامل (فوف)، CD133، كادهيرين بطانية ج-كيت، والأوعية الدموية (VE-كادهيرين)4 , 18-الخلايا التي شاركت إكسبريس CD90، CD45، CD14، CD115، أو أكتين العضلات الملساء ألفا (α-SMA) لا تعتبر أن ابكس بسبب قدرتها المحتملة، التكاثري محدودة phagocytose البكتيريا، وعدم القدرة على تشكيل حيثياته البشرية سفن في فيفو4،7. توضح هذه المقالة بروتوكول تعديل لعزل خلايا غشائي السلف من دم الحبل السري البشري دون الحاجة إلى أية خلية الفرز البروتوكولات. لهذه المادة، كنا CD31، CD34، و VEGFR2 كعلامات إيجابية، مع α-SMA كمؤشر سلبي.
في هذا المقال، فإننا نقترح طريقة لعزل واستزراع خلايا غشائي السلف من دم الحبل السري دون الفرز باستخدام الخلية المتخصصة المتوسطة النمو بطانية وتستكمل مع عوامل النمو (اجتماع فريق الخبراء). اجتماع فريق الخبراء هذا يحتوي على عامل نمو الأوعية الدموية غشائي (VEGF) وعامل النمو تنتجها الخلايا الليفية (صندوق الأجيال القادمة)، الذي تعزز البقاء على قيد الحياة وانتشار الهجرة من الخلايا البطانية26. ويشمل أيضا حمض الأسكوربيك، ومسؤول عن الحفاظ على مورفولوجية حصاة كبيرة من الخلايا؛ يشبه الأنسولين عامل النمو-1 (منتدى إدارة الإنترنت-1)، التي تنص على الأوعية والدالة المهاجرة؛ والهيبارين، مما يسبب تحسن الاستقرار الطويل الأمد لعوامل النمو في المتوسط26. عوامل نمو أخرى إضافة إلى متوسط الثقافة غشائي خلية تتضمن مكملات مع عامل نمو البشرة (لو)، مما يساعد في تحفيز تكاثر الخلايا والتمايز الهيدروكورتيزون، الذي محسس الخلايا إلى لو26 . ونحن تبين أن استخدام هذه الوسيلة نمو محددة تعطي أرقام أعلى من ابكس مقارنة بمتوسط القاعدية غشائي (EBM) أو تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
هذا البحث أجرى على موافقة من جامعة "أركنسو مجلس المراجعة المؤسسية" (الموافقة رقم 16-04-722). وجمعت وحدات دم الحبل السري في سترات الفوسفات الدكستروز (وثيقة البرنامج القطري) الحل في "بنك الدم الحبل أركنسو"، والوحدات التي لا تفي بالحاجة إلى تخزين تم التبرع بها للبحث. كانت وحدات دم الحبل السري المهربة إلى المختبر خلال 24 ساعة جمع في درجات الحرارة المحيطة.
1-"عزل خلايا السلف بطانية" من "دم الحبل السري"
- إعداد الكواشف.
- و "إعداد اجتماع فريق الخبراء" عن طريق إضافة متوسطة القاعدية غشائي (EBM) إلى 10% مصل بقرى الجنين (FBS) تستكمل مع 20 نانوغرام/مليلتر من مثل الأنسولين عامل النمو (IGF)، وحمض الأسكوربيك ميكروغرام/ملليلتر 1، 5 نانوغرام/مليلتر الماشوب البشري البشرة عامل النمو (رهيجف)، 22.5 ميكروغرام/مل الهيبارين، و 0.5 نانوغرام/مليلتر الأوعية الدموية غشائي عامل النمو (VEGF)، جنبا إلى جنب مع 10 نانوغرام/مليلتر عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية البشرية المؤتلف ب (رهفجف-B) و 0.2 ميكروغرام/مل الهيدروكورتيزون 2% البنسلين والستربتوميسين-الجلوتامين. تعقيم المتوسطة الثقافة باستخدام مرشح فراغ غشاء بولييثيرسولفوني (PES) 0.2 ميكرون.
- إعداد الفئران الذيل أنا الحل الكولاجين بتركيز 50 ميكروغرام/مل باستخدام حمض الخليك N 0.02. تعقيم هذا الحل باستخدام عامل تصفية حقنه 0.2 ميكرون. لوحات
- معطف قبل 6-جيدا مع 2 مل الفئران استعداد الذيل أنا الكولاجين الحل لكل بئر. مكان لهم في حاضنة الإبقاء على 5% CO 2 و 37 درجة مئوية على الأقل 1 ح قبل البذر.
- تمييع حوالي 25 مل دم الحبل السري مع هانكس متوازن الملح الحل (هبس) بتركيز 1:1.
- تحضير الإذاعة-المناعية هطول الأمطار الاعتداء المخزن المؤقت (RIPA) باستخدام كلوريد الصوديوم 150 مم 1% X-100 تريتون، ديوكسيتشولاتي الصوديوم 0.5%، 1 مم β-جليسيروفوسفاتي، والحزب الديمقراطي الصربي 0.1% و 50 مم تريس (pH 8.0).
- عزل الخلايا السلف غشائي.
- كل الحارة إعداد الكواشف في حمام مائي الإبقاء على 37 درجة مئوية قبل عزلة.
- إضافة 20 مل كاشف كثافة متوسطة الانحدار إلى أنبوب الطرد مركزي 50 مل.
- بعناية الطبقة 20 مل دم الحبل السري المخفف في أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على كثافة متوسطة متدرجة دون كسر هذه الطبقة بهدف الماصة نحو الجدران الجانبية للأنبوب.
- فصل مكونات الدم استناداً إلى هذه الكثافة ( الشكل 1) التي سينتريفوجينج في 800 x ز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع الفرامل للدوار للطرد المركزي قبالة. عدم الإزعاج من طبقات مختلفة-
- إزالة طبقة البلازما بعناية بيبيتينج الخروج من الأنبوب دون الإخلال بخلية أخرى طبقة طبقات حتى طرف الماصة قادرة على الوصول إلى الحركة الوطنية الكوبية (انظر الشكل 1). تجاهل إزالة البلازما.
ملاحظة: أثناء استخدام ماصة نصائح لإزالة البلازما، ترك طبقة صغيرة من البلازما فوق طبقة الشركات متعددة الجنسيات ( الشكل 1) لتقليل الاضطرابات. - معطف بافي يحتوي على الشركات المتعددة الجنسيات باستخدام حقنه مزودة بإبرة عيار 18 جمع وتحويلها إلى أنبوب جديد للطرد مركزي.
- إضافة وحدة تخزين متساوية من EBM إلى جمعها النابذة الشركات المتعددة الجنسيات. هذه الأنابيب في ز 500 x لمدة 10 دقائق في 4 ° جيم تجاهل المادة طافية.
ملاحظة: بيليه الخلية سوف تظهر باللون الأحمر بسبب وجود خلايا الدم الحمراء/الكريات الحمراء.
إضافة - 5 مل من محلول كلوريد الأمونيوم خلايا الدم الحمراء. احتضان هذا الأنبوب على الجليد مدة 5-10 دقيقة، مع الهز عرضية.
ملاحظة: يجب توخي الحذر أثناء القيام بهذه الخطوة لا تتجاوز الفترة الزمنية، كما أنها يمكن أن تكون ضارة للشركات المتعددة الجنسيات- - الطرد المركزي هذه الأنابيب في 500 غرام x لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل المادة طافية. إذا استمرت الكريات الحمراء، كرر الخطوات 1.2.8 و 1.2.9 حتى يتم ملاحظة لا اللون الأحمر في بيليه.
- ريسوسبيند بيليه في EGM المعدة واستخدام هيموسيتوميتير الاعتماد الشركات المتعددة الجنسيات-
- Aspirate الفئران الذيل أنا المغلفة بالكولاجين لوحة 6-جيدا (من الخطوة 1.1.3) وغسل الآبار ثلاث مرات مع 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
- البذور بيليه الشركات متعددة الجنسيات حراكه في اجتماع فريق الخبراء للوحة الكولاجين بتركيز 1 × 10 7 الشركات المتعددة الجنسيات في كل بئر. ضعه في 37 درجة مئوية، 5% CO 2 حاضنة. نضح المتوسطة
- بعد 24 ساعة، وغسل الآبار مرة واحدة مع اجتماع فريق الخبراء. أضف 3 مل من EGM المتوسطة لكل بئر ووضعه مرة أخرى في 37 درجة مئوية، 5% CO 2 حاضنة.
- تجديد اللوحة مع الطازجة EGM المتوسطة كل يوم لمدة 7 أيام. بعد 7 أيام، تغيير المتوسطة EGM يوميا.
- استخدام مجهر الحقل مشرق، التقاط صور للوحة 6-جيدا كل يوم لتتبع تقدم مستعمرات الخلايا البطانية. وضع علامة على اللوحة التي تنشأ فيها المستعمرات لتعقب نموها.
ملاحظة: يستغرق عادة ما بين 5 و 9 أيام للمستعمرات تظهر في الثقافة-
- توسيع نطاق خلايا السلف غشائي.
- معطف قارورة الثقافة T-25 مع الفئران الذيل أنا الكولاجين (50 ميكروغرام/مل) ووضعه في 37 درجة مئوية، 5% CO 2 حاضنة لمالا يقل عن 60 دقيقة أسبيراتي وتغسل قارورة ثقافة الخليوي T-25 ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1 x قبل البذر الخلايا.
- تريبسينيزي مستعمرات الخلايا البطانية عندما تصل إلى حوالي 3 ملم في الحجم باستخدام 150 ميليلتر من حل يدتا التربسين 0.05% في كل بئر. ضع لوحة 6-جيدا مرة أخرى إلى 37 درجة مئوية، 5% CO 2 حاضنة للحد الأدنى 2-3
- اضغط برفق لوحة 6-جيدا لإزاحة الخلايا المرفقة. إضافة 2 مل EGM فورا واستعادة الخلايا في أنبوب الطرد مركزي 15 مل.
- عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير وحساب كثافة البذر الأولية. أنابيب
- تدور النابذة 15 مل في 400 غرام x للحد الأدنى 5 ريسوسبيند بيليه الخلية في اجتماع فريق الخبراء، والبذور قارورة T-25 مع خلايا ~ 500,000. مارك هذا قارورة كمرور 1 ووضع قارورة T-25 مرة أخرى في 37 درجة مئوية، 5% CO 2 حاضنة.
ملاحظة: يمكن مطلي الخلايا في EBM ودميم مقارنة النمو مع EGM. - لمزيد من الممرات، عندما يصل قارورة التقاء 90%، اتبع الخطوات 1.3.1-1.3.5 وريسيد الخلايا في 10 4 خلايا/سم 2 في قوارير الثقافة خلية T-75 أو T-175. انتقل إلى وصف الخلايا المعزولة (الخطوات 2 و 3)-
2. توصيف "عزل الخلايا باستخدام الغربية النشاف"
- إضافة 50-100 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت في كل مرور عند اتباع الخطوات التوسع لتمييز الخلايا المعزولة. تجميع البروتينات من الخلايا تقريبا 500,000 أو أكثر.
- "الماصة؛" صعودا وهبوطاً بنشاط لتمزق الخلايا والإفراج عن البروتينات. جمع ونقل المخزن المؤقت إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي. تدور أنبوب ميكروسينتريفوجي في 500 x ز
- ونقل المادة طافية بعناية إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة. التسمية وتخزين الأنابيب في-80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
- تحديد مقدار البروتينات في كل أنبوبة باستخدام أما برادفورد ' s أو اتفاق التعاون الأساسي الاعتداء 27 ، ، من 28 29-
- القيام بالغربية النشاف باستخدام إجراءات معيارية 27 ، ، من 28 29. تحليل 5 ميكروغرام من البروتين الكلي للتعبير عن CD31، CD34، VEGFR2، و α-SMA. استخدام α-tubulin لتطبيع البيانات.
3. الفلورة غير المباشرة
- Sonicate كوفيرسليبس الزجاج 18 ملم في الإيثانول 50% وتجفيفها. ترك كوفيرسليبس نظيفة في صفيحة 12-جيدا بين عشية وضحاها في هود السلامة الأحيائية مع الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة في تعقيم لهم. معطف
- كوفيرسليبس مع 50 & #181؛ غ/مل من الفئران الذيل أنا الكولاجين ونقل اللوحة إلى 37 درجة مئوية، 5% CO 2 حاضنة لمالا يقل عن 60 دقيقة
- اعقلوها الكولاجين وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني 1 x إلى لوحة 12-جيدا أن يغسل في كوفيرسليبس. نضح PBS 1 x وكرر مرتين.
- 250,000 البذور المستزرعة ابكس في كل بئر ومكان مرة أخرى في 37 درجة مئوية، 5% CO 2 حاضنة لمدة 3 أيام على الأقل قبل تنفيذ إيمونوستينينج- أغسل
- لوحة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1 x. أضف 1 مل ميثانول المثلج لكل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة إصلاح الخلايا.
- الاضطلاع إيمونوستينينج استخدام بروتوكول قياسي 27 ، ، من 28 29. استخدام الأجسام المضادة في تخفيف تلك المناسبة (مثلاً، CD31 (01:20)، CD34 (01:50)، α-SMA (1: 100)، و VEGFR2 (01:50))-
- التقاط صور كوفيرسليبس إيمونوستينيد استخدام مجهر ابيفلوريسسينسي-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
العزلة والتوسع في السلف غشائي الخلايا:
ويرد تخطيطي (الشكل 1) يصور البروتوكول عموما. طبقات مكونات الدم المختلفة لوحظت عقب كثافة الطرد المركزي التدرج من دم الحبل السري البشري مع المتوسطة الكثافة المتدرجة. عند البذر الشركات المتعددة الجنسيات على لوحات المعالجة بالكولاجين، لوحظ ثمرة المستعمرات أولاً بين 5 أيام و 7 (الشكل 2أ). هذه المستعمرات استمرت في النمو، وكان خلية على شكل شوكي مورفولوجيا (الشكل 2أ-2D) في المراحل المبكرة، التي تقدم في وقت لاحق إلى حصاة كبيرة تشبه مورفولوجيا (الشكل 2ه-2F). الشكل 3 A يوضح العدد الإجمالي للخلايا مقابل الوقت في الثقافة، وتمثل كل نقطة بيانات العدد التراكمي للخلايا التي تحصد في كل مرور. الشكل 3 يصور ب متوسط الوقت المستغرق لأول مستعمرة تنشأ في لوحة 6-جيدا التعامل مع الكولاجين بعد البذر الشركات المتعددة الجنسيات.
وصف استخدام النشاف الغربية:
الشكل 4 أ يظهر الممثل نتائج الغربية لطخة الغشاء الذي تم اختباره ضد الأجسام المضادة المختلفة. نتائجنا تشير إلى أن الخلايا كانت إيجابية بالنسبة CD31 و CD34. التعبير عن CD31 (الشكل 4ب) و CD34 (الشكل 4ج) يبدو إنقاص عبر المقاطع اللاحقة، بينما VEGFR2 (الشكل 4د) أعرب عن التساوي في فقرات لاحقة، مع الأول المرور بعد التعبير أعلى. كما لاحظنا أن ابكس لا تعبر عن خلايا mesenchymal ماركر α-SMA (الشكل 4ه). الوريد السري البشرية خلايا بطانية (هوفيك) والخلايا الخلالي صمامات القلب (فيكتوريا) خلية ليساتيس كانت تستخدم كعناصر إيجابية وسلبية، على التوالي. هوفيكس معروفة للتعبير عن CD31 و CD34، و VEGFR2، في حين أعرب VICs α-SMA.
الشكل 1 : التخطيطي ل EPC العزلة. ابدأ العزل بواسطة سلك تمييع الدم بحبس وطبقات عليه بعناية على رأس المتوسطة الكثافة المتدرجة، كما هو موضح. ويتم الطرد المركزي التدرج كثافة الدم الطبقات للحصول على طبقات متميزة من الدم، والذي يتكون من الشركات المتعددة الجنسيات (بافي معطف)، والمتوسطة الكثافة المتدرجة، المحببة، وكرات الدم الحمراء. وتوضح الصورة مجموعة فرعية تقدم هذه الطبقات المختلفة. الشركات المتعددة الجنسيات وتم جمعها وريسيديد على طبق من ذهب في ثقافة خلية المعالجة بالكولاجين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . تطور مستعمرة الخلية. (ألف-هاء) صور مشرقة الحقل الممثل EPC مستعمرة تطور مع مرور الوقت. ملاحظة أن المستعمرة خلايا على شكل المغزل في المراحل الأولى، اعتماد مورفولوجية حصاة كبيرة. (ه) صورة تمثيلية EPC مثقف في قارورة T-75 في مرور 3. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: منحنيات النمو من ابكس- (أ) يصف الرسم البياني عدد الخلايا التي تنمو على مدى فترة من الزمن، وكل نقطة بيانات تشير إلى الخلية رقم حصادها خلال كل مرور (P0-P10) (n = 4). (ب) الوقت الذي يستغرقه لأول مستعمرة EPC تظهر في لوحة 6-جيدا (n = 4). أشرطة الخطأ تدل على الخطأ المعياري للوسط (SEM). لا توجد دلالة إحصائية تم العثور على استخدام ANOVA أحادي الاتجاه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : النشاف الغربية- (أ) لطخة غربية الغشاء الملون مع الأجسام المضادة المختلفة. واستخدمت هوفيك ليستي وفيك ليستي كعناصر إيجابية. (ب) متوسط كثافة عصابات CD31 تطبيع مع α-توبولين. (ج) متوسط كثافة عصابات CD34 تطبيع مع α-توبولين. (د) متوسط كثافة عصابات VEGFR2 تطبيع مع α-توبولين. (ﻫ) متوسط كثافة العصابات α-SMA تطبيع مع α-tubulin (n = 3-6). أشرطة الخطأ الدلالة sem. لا توجد دلالة إحصائية تم العثور على استخدام ANOVA أحادي الاتجاه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
5 الرقم: إيمونوستينينج- صور الممثل ابكس مثقف في اجتماع فريق الخبراء لمدة 7 أيام وإيمونوستينيد في مقاطع مختلفة ل CD31، CD34، VEGFR2، و α-SMA. مقياس بار-100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الإضافي رقم 1: يصف الرسم البياني عدد الخلايا في وحدة المساحة خلال فترة 7 أيام عند مثقف في اجتماع فريق الخبراء، والمراعية ودميم. وأظهر اجتماع الخبراء نمو الخلية أعلى بالمقارنة مع وسائل الإعلام (EBM ودميم). وأظهرت البيانات دلالة إحصائية، مع ف < 0.01، استخدام ANOVA أحادي الاتجاه (n = 2). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
/> تكميلية الشكل 2: صور الممثل من ابكس مثقف في EBM لمدة 7 أيام وإيمونوستينيد CD31، CD34، VEGFR2، و α-SMA. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تكميلية الشكل 3: صور الممثل ابكس مثقف في دميم لمدة 7 أيام وإيمونوستاينيد CD31، CD34، VEGFR2، و α-SMA. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كما ذكر آنفا، تمتلك ملتصقة ابكس مورفولوجيا حصاة كبيرة. تقدم لدينا الشركات المتعددة الجنسيات معزولة من مستعمرة خلية على شكل محور الدوران (الشكل 2أ-2D) في المراحل الأولى إلى مستعمرة حصاة كبيرة (الشكل 2ه-2F) على مدى فترة مدتها عشرة أيام في الثقافة. ابكس قد وصفت بشكل مختلف من مجموعات بحثية مختلفة، أي كالراحل السلف غشائي الخلايا10، مستعمرة غشائي تشكيل خلايا5، أو السلف غشائي الخلايا12. تجدر الإشارة إلى أن هذه الخلايا هي نفسها وظيفيا والتعبير عن علامات سطح خلية مماثلة. عدد الخلايا التي لوحظت خلال فترة الثقافة (الشكل 3) ارتفع إلى تقريبا 108 خلايا، مماثلة للمنشورات السابقة ونموذجية من إمكانات عالية التكاثري ابكس3،5. وفي الواقع، تبين أن ابكس التي تم الحصول عليها من دم الحبل السري البشري أظهر عالية التكاثري المحتملة وأظهرت عدة سكان دوبلينجس قبل أن يخضع الشيخوخة ابكس المعزولة من الدم المحيطي البشري البالغين5 بالمقارنة , 10.
نتائجنا blotting الغربية (الشكل 4أ) أظهرت وجود CD31، CD34، و VEGFR2 على ليساتيس الخلايا التي تم الحصول عليها من ابكس مقارنة بعنصر التحكم الإيجابي، هوفيك. التعبير عن CD31 و CD34 VEGFR2 هوفيكس وتنشيط مركز فيينا الدولي صريح α-sSMA. على غرار التقارير السابقة10،18، انخفض التعبير عن CD31 مع مقاطع من أعلى. وكان نمط التعبير أيضا مماثلة في حالة CD34 و VEGFR2، حيث كل العلامات وأبديت بشدة في المقطع الأول وفي كميات أقل نسبيا ولكنها متساوية في فقرات لاحقة. تظهر هذه البيانات هو اتجاه الذي يتفق مع نتائج الفريقين السابقة، استخدمت فيها بروتوكولات المستندة إلى إيمونوسورتينج لعزل ابكس المشتقة من دم الحبل السري12. عموما، لا تعبر عن ابكس علامات الوسيطة، والتحقق من أن الخلايا المعزولة لم تكن الوسيطة في الطبيعة، ونحن إيمونولابيليد لنا الأغشية لطخة غربية مع α-SMA. النتائج التي توصلنا إليها تظهر بوضوح أن كان هناك أي تعبير α-SMA في ابكس مثقف بالمقارنة مع ليساتيس خلية المراقبة الإيجابية التي تم جمعها من VICs، الذي يحمل التعبير القوى عن جسم α-SMA.
وللتدليل على أن اجتماع الخبراء يسمح لتكاثر الخلايا زيادة مقارنة بوسائط الثقافة الأخرى المستخدمة ابكس، نحن مثقف الخلايا في ثلاثة أنواع مختلفة من الوسائط: دميم و EBM EGM (أي EBM تستكمل مع عوامل النمو، كما ورد سابقا). الجميع واستكملت مع 10% FBS. نحن المصنف خلايا مقاطع مختلفة في كل من لوحة 12-جيدا جيدا. تكميلية الشكل 1 يبين عدد الخلايا في وحدة المساحة في كل بئر على مر الزمن في الثقافة في تركيبات مختلفة من وسائل الإعلام. ونلاحظ أن ابكس المستزرعة في اجتماع الخبراء أظهرت زيادة مطردة في عدد الخلايا، والخلايا في EBM، كان هناك بمعدل أبطأ من الزيادة في عدد الخلايا خلال الأيام الثلاثة الأولى، التي استقرت في وقت لاحق. وهذا يوحي بأن لا يزال يمكنه البقاء ابكس في EBM، ولكن غياب عوامل النمو يعرقل انتشار. ونلاحظ أيضا أن ابكس مثقف دميم انخفاض في العدد، مما يوحي بأن هذه الصيغة المتوسطة خاصة غير ملائم للبقاء على قيد الحياة أو الانتشار. لدينا بيانات إيمونوستاينينج يبين أن ابكس المستزرعة في اجتماع الخبراء (الشكل 5) أعرب عن CD31 أكثر بالمقارنة مع ابكس مثقف في EBM (تكميلية الشكل 2) ودميم (تكميلية الشكل 3). مقارنة الرقم 5 مع الإضافي رقم 2 و تكميلية الشكل 3، يتبين أن الخلايا كانت غير ملوثة بأنواع الخلايا الأخرى. أيضا، عند مقارنة إيمونوستينيد ابكس (الشكل 5)، يمكن نوعيا نعلن بأن التعبير عن CD31 و CD34 انخفض خلال الممرات العليا، تدعم بياناتنا لطخة غربية (الشكل 4).
أن أؤكد من جديد، الهدف الأساسي لأن البروتوكول المقترح لإثبات أن أحد يمكن عزل خلايا غشائي السلف بالدم تثقيف الشركات المتعددة الجنسيات في وسائل الإعلام المتخصصة الانتقائية. هذا هو لإظهار أن ابكس يمكن أن تكون معزولة دون معدات متطورة، والإجراءات، وخلافا للطرق الأخرى التي تنطوي على استخدام التدفق الخلوي-أما مباشرة بعد الشركات متعددة الجنسيات العزلة1،3،20 , 30 أو تليها بعد المستعمرات قد نمت أحادي الطبقة-ريبلاتينج4،10،،من1213،23. وعادة ما تظهر المستعمرات EPC بين 5 و 9 أيام. أسلوبنا هكذا طريقة أسرع وأكثر فعالية من حيث التكلفة لعزل ابكس. القيد الرئيسي من هذا الأسلوب هو أن التعبير عن CD31 و CD34 يتناقص مع المقاطع اللاحقة، التي يمكن أن توحي بأن تفقد الخلايا النمط الظاهري السلف. وهكذا، من المستحسن أن واحدة ينبغي استخدام الخلايا التي تم الحصول عليها من مرور 5 أو أقل لإجراء تجارب في حالة استخدام هذا البروتوكول.
يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة بعد الطرد المركزي الكثافة عدم الإزعاج طبقات مختلفة عند أخذ أنابيب سينتريفوجيد مرة أخرى في غطاء محرك السيارة، وكذلك عند إزالة البلازما. خطوة حاسمة أخرى تتعلق بتحلل كرات الدم الحمراء، حيث يحتمل أن تكون على فترة حضانة أطول يمكن أن يلحق الضرر الشركات متعددة الجنسيات. وبالتالي يوصي لا بتكرار هذه الخطوة أكثر من مرتين. وفي الواقع، حيث ينفذ تطلع متوسطة 24 ساعة بعد الطلاء، كميات نزرة من الكريات الحمراء تتم إزالة، كما غير ملتصقة. ركائز بديلة، مثل فيبرونيكتين أو الجيلاتين، بينما لم تختبر بالنسبة لنا، يمكن أيضا استخدام وفقا لبروتوكولات معينة لإنشاء خلية الطلاء الثقافة. عن طريق استخدام تعديلات طفيفة في الخطوات الأولية، قد عزل الباحثون غير ملتصقة ابكس30.
وفي الختام، لقد أبلغ وسيلة لعزل ابكس من دم الحبل السري. من المهم ملاحظة أن ابكس لا تعبر عن علامات مثل α-SMA، مما يوحي بأنهم ليسوا الوسيطة مثل الخلايا. وفي الواقع، α-SMA كعلامة هامة عند محاولة لدراسة انتقال غشائي الوسيطة (إندو-MT) ابكس. إندو-النقل المتعدد الوسائط هو عملية ترانسديفيرينتييشن خلوية خلالها معروفة خلايا بطانية لتفقد علامات محددة وتحويل للنمط الظاهري خلايا الوسيطة الشبيهة. فقد ثبت أن ابكس يمكن أن يخضع لهذا الانتقال حضور تحويل عامل النمو-β7 ويمكن الإفراج عن بروتينات غشاء الخلية على السقالات هندسة الأنسجة على8. كل هذه الملاحظات تشير إلى وعد ابكس لاستخدامها كمصدر لخلايا ذاتي لإنشاء صمام قلب أو أخرى ثوابت هندسيا أنسجة القلب والأوعية الدموية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذه المواد ويستند إلى العمل المدعوم من "المؤسسة الوطنية للعلوم" تحت "رقم المنحة" CMMI 1452943 وكلية يكرم جامعة اركنساس. ونود أيضا أن نعترف "بنك الدم الحبل أركنسو" لتزويدنا بوحدات دم الحبل السري.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A) For isolation and culturing | |||
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 26140079 | |
| Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
| Ammonium Chloride | Stem Cell Technologies | 7850 | |
| 1x Phosphate Buffer Saline | Thermofisher Scientific | 14190250 | |
| Rat Tail I Collagen | Corning | 354236 | |
| Glacial Acetic Acid | Amresco | 0714-500ML | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| HEPES buffer | Thermofisher Scientific | 15630080 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
| B) Antibodies and cell lysates | |||
| CD31 | Abcam | ab28364 | 1:250 dilution for Western blotting |
| CD34 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-SMA | abcam | ab5694 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-tubulin | abcam | ab7291 | 1:2,500 dilution for Western blotting |
| VEGFR2 | abcam | sc504 | 1:100 dilution for Western blotting |
| Human umbilical vein endothelial cell lysate | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
| Valve interstitial cell lysate | Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer | ||
| C) Western blotting and immunostaining | |||
| 10x Tris/Glycine/SDS buffer | Biorad | 161-0772 | Used as running buffer |
| 10x Tris/Glycine buffer | Biorad | 161-0771 | Used as transfer buffer |
| Immobilon-FL transfer membrane | Merck Millipore | IPFL0010 | This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane |
| 4x Laemmli sample buffer | Biorad | 161-0747 | |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | 161-0710 | |
| 10% Criterion TGX precast gel | Biorad | 5671033 | |
| Prolong Gold antifade | Thermofisher Scientific | P36930 | Used for mounting immunostained coverslips for long term storage |
| Methanol | VWR Analytical | BDH1135-4LP |
References
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105 (1), 71-77 (2000).
- Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92 (2), 362-367 (1998).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Sales, V. L., et al. Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds. Circulation. 114, 1 Suppl 193-199 (2006).
- Sales, V. L., et al. Endothelial Progenitor Cells as a Sole Source for Ex Vivo Seeding of Tissue-Engineered Heart Valves. Tissue Eng Pt A. 16 (1), 257-267 (2010).
- Liew, A., Barry, F., O'Brien, T. Endothelial progenitor cells: diagnostic and therapeutic considerations. Bioessays. 28 (3), 261-270 (2006).
- Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
- Ingram, D. A., Caplice, N. M., Yoder, M. C. Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells. Blood. 106 (5), 1525-1531 (2005).
- Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).
- Yoder, M. C.
- Siddique, A., Shantsila, E., Lip, G. Y. H., Varma, C. Endothelial progenitor cells: what use for the cardiologist. J Angiogenes Res. 2 (6), (2010).
- Camci-Unal, G., et al. Surface-modified hyaluronic acid hydrogels to capture endothelial progenitor cells. Soft Matter. 6 (20), 5120-5126 (2010).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
- Young, P. P., Vaughan, D. E., Hatzopoulos, A. K. Biologic properties of endothelial progenitor cells and their potential for cell therapy. Prog Cardiovasc Dis. 49 (6), 421-429 (2007).
- Mehta, J. L., Szwedo, J. Circulating endothelial progenitor cells, microparticles and vascular disease. J Hypertens. 28 (8), 1611-1613 (2010).
- Nevskaya, T., et al. Circulating endothelial progenitor cells in systemic sclerosis are related to impaired angiogenesis and vascular disease manifestations. Ann Rheum Dis. 66, 67-67 (2007).
- Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, 1 Suppl 132-137 (2006).
- Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
- Vasa, M., et al. Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 103 (24), 2885-2890 (2001).
- Wu, X., et al. Tissue-engineered microvessels on three-dimensional biodegradable scaffolds using human endothelial progenitor cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 480-487 (2004).
- Boyer, M., et al. Isolation of endothelial cells and their progenitor cells from human peripheral blood. J Vasc Surg. 31 (1), Pt 1 181-189 (2000).
- Huber, B., Czaja, A. M., Kluger, P. J. Influence of epidermal growth factor (EGF) and hydrocortisone on the co-culture of mature adipocytes and endothelial cells for vascularized adipose tissue engineering. Cell Biol Int. 40 (5), 569-578 (2016).
- Sturdivant, N. M., Smith, S. G., Ali, S. F., Wolchok, J. C., Balachandran, K. Acetazolamide Mitigates Astrocyte Cellular Edema Following Mild Traumatic Brain Injury. Sci Rep. 6, 33330 (2016).
- Lam, N. T., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N., Balachandran, K. Valve interstitial cell contractile strength and metabolic state are dependent on its shape. Integr Biol (Camb). 8 (10), 1079-1089 (2016).
- Tandon, I., et al. Valve interstitial cell shape modulates cell contractility independent of cell phenotype. J Biomech. 49 (14), 3289-3297 (2016).
- Cockshell, M. P., Bonder, C. S. Isolation and Culture of Human CD133+ Non-adherent Endothelial Forming Cells. Bio-Protocol. 6 (7), (2016).
