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Developmental Biology

मानव गर्भनाल रक्त से Endothelial जनक कोशिकाओं का अलगाव

Published: September 14, 2017 doi: 10.3791/56021
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य नाल गर्भनाल रक्त से endothelial जनक कोशिकाओं को अलग करना है । कुछ अनुप्रयोगों हृदय जोखिम के साथ रोगियों की पहचान करने के लिए एक के रूप में इन कोशिकाओं का उपयोग कर शामिल, कोरोनरी रोगों के इलाज, और ऊतक इंजीनियर संवहनी और दिल वाल्व का निर्माण.

Abstract

परिधीय रक्त में endothelial जनक कोशिकाओं (ईपीसी) का अस्तित्व और vasculogenesis में इसकी भागीदारी पहले आशारा और सहकर्मियों द्वारा सूचित किया गया था1. बाद में, दूसरों को अस्थि मज्जा2,3से उद्भव ईपीसी के समान प्रकार के अस्तित्व प्रलेखित । हाल ही में, Yoder और Ingram से पता चला है कि गर्भनाल रक्त से व्युत्पंन ईपीसी एक उच्च प्रफलन वयस्क परिधीय रक्त4,5,6से अलग लोगों की तुलना में संभावित था । इसके अलावा प्रसव vasculogenesis में शामिल किया जा रहा है, ईपीसी भी ऊतक-इंजीनियर संवहनी और हृदय वाल्व बनाने के लिए एक सेल स्रोत के रूप में वादा दिखाया है7,8constructs । विभिंन अलगाव प्रोटोकॉल मौजूद है, जिनमें से कुछ mononuclear कोशिकाओं (बहुराष्ट्रीय) endothelial और टेम मार्करों की मदद से पहले उल्लेख किया स्रोतों से व्युत्पंन, या विशेष संवर्धन विकास के साथ इन बहुराष्ट्रीय endothelial की छंटाई सेल शामिल मध्यम, या इन तकनीकों का एक संयोजन9। यहां, हम अलगाव और ईपीसी की संस्कृति विशेष endothelial मध्यम विकास कारकों के साथ पूरक का उपयोग कर के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद, immunosorting के उपयोग के बिना, पृथक पश्चिमी सोख्ता कोशिकाओं के लक्षण वर्णन द्वारा पीछा किया और immunostaining ।

Introduction

कई जांचकर्ताओं ने मानव ईपीसी5,10,11,12,13की विशेषताओं और क्षमता का अध्ययन किया है । ईपीसी परिसंचारी कोशिकाओं है कि हाइपोक्सिया, ischemia, चोट, या ट्यूमर गठन की साइटों में endothelial ऊतक का पालन करने की क्षमता है और नए संवहनी संरचनाओं के गठन4,14के लिए योगदान के रूप में वर्णित किया जा सकता है । neovascularization में उनके मनाया भागीदारी, प्रसव vasculogenesis के रूप में, इन कोशिकाओं के pathophysiology की समझ के लिए नेतृत्व किया है और चिकित्सीय अनुप्रयोगों में उनके उपयोग के4,15, 16. एक व्यक्ति में ईपीसी की संख्या हृदय विकृति से संबंधित होने के लिए दिखाया गया है9,15,16,17,18,19 ,20. अंय अध्ययनों से भी एक वाल्व में ईपीसी विभेदित fibroblast-phenotype की तरह है और प्रस्तावित है कि इन कोशिकाओं ऊतक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है इंजीनियरिंग हार्ट वाल्व7,21।

विशेष सेल सतह अणुओं को अलग करने की जरूरत ईपीसी स्पष्ट रूप से जांच के बीच विसंगतियों के कारण नहीं पहचाना गया है4। एक निश्चित मैट्रिक्स को बहुराष्ट्रीय के आसंजन, संस्कृति की स्थिति की एक किस्म के लिए जोखिम के साथ, कई समूहों द्वारा किया गया है1,17,22,23, सुझाव है कि ख्यात ईपीसी मई भिंन phenotypic गुण प्रदर्शित करें । इन गुणों में phagocytotic क्षमता, Matrigel में ट्यूब गठन, और दिल की acetylated कम घनत्व लिपो की कमी शामिल है । उच्च clonogenic और प्रफलन क्षमता दो गुण है जिनके साथ ईपीसी को5पदानुक्रमित किया जा सकता है । ईपीसी भी इन विट्रो नलिकाओं जब मानव भ्रूण फेफड़े fibroblasts4के साथ cocultured रूप में कर सकते हैं । इन कोशिकाओं को endothelial सेल सतह मार्करों एक्सप्रेस और टेम मार्करों13,24,25में से कुछ साझा करने के लिए जाना जाता है । सकारात्मक व्यक्त मार्करों कि व्यापक रूप से phenotyping ईपीसी के लिए स्वीकार कर रहे हैं CD31, CD34, संवहनी endothelial वृद्धि कारक रिसेप्टर 2 (VEGFR2), वॉन Willebrand फैक्टर (vWF), CD133, सी-किट, और संवहनी endothelial cadherin (VE-cadherin)4 , 18. कोशिकाओं है कि सह-एक्सप्रेस CD90, CD45, CD14, CD115, या अल्फा-चिकनी मांसपेशी actin (α-SMA) के कारण उनके सीमित ईपीसी क्षमता के प्रफलन नहीं माना जाता है, बैक्टीरिया phagocytose करने की क्षमता, और अक्षमता फार्म डी नोवो मानव vivo4,7 मेंजहाजों । यह लेख मानव गर्भनाल रक्त से endothelial जनक कोशिकाओं के अलगाव के लिए किसी भी सेल छंटाई कक्ष के लिए की आवश्यकता के बिना रूपरेखा एक संशोधित प्रोटोकॉल । इस अनुच्छेद के लिए, हम नकारात्मक सूचक के रूप में α-SMA के साथ सकारात्मक मार्करों के रूप में, CD31, CD34, और VEGFR2 का इस्तेमाल किया ।

इस अनुच्छेद में, हम अलग और संवर्धन endothelial कोशिका के बिना गर्भनाल रक्त से जनक कोशिकाओं को विशेष endothelial विकास के माध्यम से पूरक विकास कारकों का उपयोग कर छंटाई के एक विधि का प्रस्ताव (ईजीएम) । इस ईजीएम में संवहनी endothelial वृद्धि कारक (वीईजीएफ़) और fibroblast वृद्धि कारक (FGF) शामिल हैं, जो endothelial कोशिकाओं के अस्तित्व, प्रसार, और प्रवास को बढ़ाते हैं26. यह भी ascorbic एसिड, जो कोशिकाओं की cobblestone आकृति विज्ञान को बनाए रखने के लिए जिंमेदार है शामिल हैं; इंसुलिन जैसे विकास कारक-1 (IGF-1), जो angiogenic और प्रवासी समारोह प्रदान करता है; और हेपरिन, जो मध्यम26में वृद्धि कारकों की दीर्घकालिक स्थिरता में सुधार का कारण बनता है । अंय विकास कारकों endothelial सेल संस्कृति माध्यम में जोड़ा एपिडर्मल वृद्धि कारक (EGF), जो सेल प्रसार और भेदभाव उत्तेजक में मदद करता है के साथ पूरकता भी शामिल है, और hydrocortisone है, जो कोशिकाओं को संवेदनशील 26 EGF के लिए . हम बताते है कि इस विशिष्ट वृद्धि के माध्यम का उपयोग पैदावार ईपीसी की उच्च संख्या endothelial बेसल मध्यम (इबीएम) या Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) की तुलना में ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > यह शोध यूनिवर्सिटी ऑफ Arkansas इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड (अनुमोदन संख्या 16-04-722) के अनुमोदन से किया गया । गर्भनाल रक्त इकाइयों Arkansas गर्भनाल रक्त बैंक में साइट्रेट फॉस्फेट डेक्सट्रोज (सीपीडी) समाधान में एकत्र थे, और इकाइयों कि भंडारण के लिए आवश्यकता को पूरा नहीं किया अनुसंधान के लिए दान किया गया । गर्भनाल रक्त इकाइयों परिवेशी तापमान पर संग्रह के 24 एच के भीतर प्रयोगशाला में कूरियर थे ।

< p class = "jove_title" > 1. गर्भनाल खून से Endothelial जनक कोशिकाओं का अलगाव

  1. रिएजेंट की तैयारी.
    1. endothelial बेसल मध्यम (इबीएम) को 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक इंसुलिन की तरह विकास कारक (IGF) के 20 एनजी/एमएल जोड़कर ईजीएम तैयार, 1 & #181; छ/एमएल ascorbic एसिड की, 5 एनजी/एमएल संयोजक ह्यूमन एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (rhEGF), २२.५ & #181; जी/एमएल हेपरिन, और ०.५ एनजी/एमएल संवहनी endothelial वृद्धि कारक (वीईजीएफ़), संयोजक मानव Fibroblast विकास कारक बी (rhFGF-बी), ०.२ & #181; g/एमएल hydrocortisone, और 2% पेनिसिलिन-streptomycin-glutamine के 10 एनजी/ एक ०.२ & #181 का उपयोग कर संस्कृति माध्यम निष्फल; एम polyethersulfone (पी इ एस) झिल्ली वैक्यूम फ़िल्टर.
    2. ५० के एक एकाग्रता में चूहे पूंछ मैं कोलेजन समाधान तैयार & #181; g/एमएल ०.०२ एन एसिटिक एसिड का उपयोग कर । एक ०.२ & #181; m सिरिंज फ़िल्टर का उपयोग करके इस समाधान को निष्फल करें.
    3. पूर्व कोट 6-तैयार चूहे पूंछ मैं एक अच्छी तरह के लिए कोलेजन समाधान के 2 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से प्लेटें । उंहें एक मशीन में रख 5% सह 2 और ३७ & #176; सी के लिए कम 1 के लिए बीज बोने से पहले ज ।
    4. एक 1:1 एकाग्रता पर हैंक्स संतुलित नमक समाधान (HBSS) के साथ गर्भनाल रक्त के लगभग 25 मिलीलीटर पतला ।
    5. १५० mm सोडियम क्लोराइड, 1% ट्राइटन X-१००, ०.५% सोडियम deoxycholate, 1 मिमी & #946;-glycerophosphate, ०.१% एसडीएस, और ५० mm Tris (पीएच ८.०) का उपयोग कर रेडियो-bliss तेज़ी परख (RIPA) बफर तैयार करें ।
  2. अलगाव की endothelial जनक कोशिकाओं.
    1. गर्म सभी तैयार रिएजेंट एक जल स्नान में ३७ पर बनाए रखा & #176; ग अलगाव से पहले ।
    2. एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए घनत्व ढाल मध्यम एजेंट के 20 मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. ध्यान से परत 20 ट्यूब के साइड दीवारों की ओर पिपेट लक्ष्य द्वारा इस परत को तोड़ने के बिना घनत्व ढाल माध्यम युक्त ट्यूब में पतला गर्भनाल रक्त के मिलीलीटर ।
    4. अपने घनत्व के आधार पर रक्त के घटकों को अलग करें (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 ) द्वारा ८०० x g पर 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर, केंद्रापसारक के ब्रेक के साथ बंद रोटर । अलग परतें परेशान मत करो ।
    5. द्वारा प्लाज्मा परत को हटाने के लिए ध्यान से इसे pipetting अंय कोशिका परतों परेशान बिना ट्यूब के बाहर जब तक पिपेट टिप को बहुराष्ट्रीय कंपनी परत तक पहुंचने में सक्षम है (देखें < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 ) । हटाए गए प्लाज्मा को छोड़ें ।
      नोट: प्लाज्मा को हटाने के लिए पिपेट युक्तियों का उपयोग करते हुए, बहुराष्ट्रीय कंपनी की परत के ऊपर प्लाज्मा की एक छोटी सी परत को छोड़ दें (< मज़बूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 ) गड़बड़ी को कम करने के लिए.
    6. एक 18-गेज सुई करने के लिए फिट एक सिरिंज का उपयोग कर बहुराष्ट्रीय शामिल है कि buffy कोट इकट्ठा करने और एक ताजा केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण.
    7. एकत्रित बहुराष्ट्रीय करने के लिए इबीएम के बराबर वॉल्यूम जोड़ें । केंद्रापसारक इन ट्यूबों पर ५०० एक्स जी के लिए 10 मिनट में 4 & #176; C. supernatant.
      छोड़ें नोट: सेल गोली लाल रक्त कोशिकाओं/एरिथ्रोसाइट्स.
      8. की उपस्थिति की वजह से रेड दिखाई देगा
    8. लाल रक्त कोशिकाओं लाइसे करने के लिए अमोनियम क्लोराइड समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें । 5-10 मिनट के लिए बर्फ पर इस ट्यूब गर्मी, कभी मिलाते के साथ ।
      नोट: सावधानी इस कदम के दौरान लिया जाना चाहिए समय अवधि से अधिक नहीं है, के रूप में यह बहुराष्ट्रीय के लिए हानिकारक हो सकता है ।
    9. ५०० x g पर ट्यूबों के लिए 10 मिनट में 4 & #176; C और supernatant को त्यागें । यदि एरिथ्रोसाइट्स जारी रहती है, दोहराएं कदम 1.2.8 और 1.2.9 जब तक कोई लाल रंग गोली में मनाया जाता है ।
    10. तैयार ईजीएम में गोली reसस्पेंड और hemocytometer का उपयोग करने के लिए बहुराष्ट्रीय.
      11. गिनती
    11. महाप्राण चूहा पूंछ मैं कोलेजन-लेपित 6 अच्छी तरह से थाली (1.1.3 कदम से) और कुओं धो 1x फॉस्फेट के साथ तीन बार-खारा (पंजाब) ।
    12. बीज बहुराष्ट्रीय कंपनी गोली ईजीएम में 1 x 10 7 बहुराष्ट्रीय के एक एकाग्रता पर कोलेजन प्लेट को एक अच्छी तरह से में reसस्पैंड । इसे ३७ में रखें & #176; ग, 5% कं 2 मशीनी.
    13. के बाद 24 ज, यम को महाप्राण और ईजीएम के साथ एक बार कुएं को धो लें । एक अच्छी तरह से ईजीएम मध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ें और इसे वापस ३७ में जगह & #176; ग, 5% कं 2 मशीनी.
    14. ताजा ईजीएम माध्यम से हर दिन 7 दिनों के लिए प्लेट मंगाया । 7 दिन के बाद ईजीएम मीडियम को हर दूसरे दिन बदलें ।
    15. एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, endothelial सेल कालोनियों की प्रगति को ट्रैक करने के लिए हर दिन 6 अच्छी थाली की छवियों को ले । प्लेट जहां कालोनियों उनके विकास का ट्रैक रखने के लिए पैदा चिह्नित करें ।
      नोट: यह आमतौर पर कालोनियों के लिए 5 और 9 दिनों के बीच लगता है संस्कृति में दिखाई देते हैं ।
  3. तारण endothelial जनक कोशिकाओं.
    1. कोट टी-२५ संस्कृति कुप्पी के साथ चूहा पूंछ मैं कोलेजन (५० & #181; जी/एमएल) और यह ३७ & #176 में जगह; ग, 5% कं 2 के लिए ंयूनतम ६० min. महाप्राण और धो के लिए टी-25 सेल संस्कृति कुप्पी तीन बार की कोशिकाओं को बोने से पहले 1x पंजाबियों के साथ ।
    2. Trypsinize endothelial सेल कालोनियों जब वे आकार में लगभग 3 मिमी तक पहुंचने का उपयोग कर १५० & #181; एल के ०.०५% Trypsin-EDTA समाधान में एक अच्छी तरह से । 6-वेल प्लेट को वापस ३७ & #176 में रखें; सी, 5% कं 2 मशीन के लिए 2-3 min.
    3. धीरे से संलग्न कोशिकाओं को उखाड़ फेंक करने के लिए 6 अच्छी प्लेट नल । तुरंत ईजीएम के 2 मिलीलीटर जोड़ें और एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में कोशिकाओं को ठीक ।
    4. एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना और प्रारंभिक बीज घनत्व की गणना.
    5. 5 मिनट के लिए ४०० x जी पर 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों स्पिन ईजीएम और बीज ~ ५००,००० कोशिकाओं के साथ टी-25 कुप्पी में सेल गोली reसस्पेंड । इस कुप्पी को गद्यांश 1 के रूप में चिह्नित करें और ३७ & #176 में टी-25 कुप्पी वापस रखें; C, 5% कं 2 मशीनी.
      नोट: कोशिकाओं इबीएम और DMEM में चढ़ाया जा सकता है ईजीएम.
      6. के साथ विकास की तुलना
    6. आगे बीतने के लिए, जब कुप्पी ९०% संगम तक पहुँचता है, तो चरणों का पालन करें 1.3.1-1.3.5 और कोशिकाओं पर 10 4 कोशिकाओं/सेमी 2 टी-७५ या टी-१७५ सेल संस्कृति कुप्पी पर । अलग कोशिकाओं के लक्षण वर्णन करने के लिए आगे बढ़ें (चरण 2 और 3).
< p class = "jove_title" > 2. पृथक कोशिकाओं का लक्षण वर्णन पश्चिमी सोख्ता

  1. Add ५०-१०० & #181; L lysis बफ़र के हर गद्यांश में जब विस्तार चरणों का पालन करने के लिए अलग कक्षों की विशेषता है । लगभग ५००,००० या अधिक कोशिकाओं से प्रोटीन लीजिए.
  2. पिपेट ऊपर और नीचे जोरदार कोशिकाओं टूटना और प्रोटीन जारी करने के लिए । इकट्ठा करने और एक microcentrifuge ट्यूब के लिए बफर हस्तांतरण ।
  3. ५०० x जी पर microcentrifuge ट्यूब स्पिन और ध्यान से एक नई microcentrifuge ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण । लेबल और ट्यूब पर स्टोर-८० & #176; ग लंबी अवधि के लिए भंडारण.
  4. या तो ब्रैडफोर्ड & #39; s या बीसीए की परख < सुप वर्ग = "xref" > 27 , < सुप वर्ग = "xref" > 28 , < सुप class = "xref" > 29 .
  5. मानक कार्यविधियों का उपयोग कर पश्चिमी सोख्ता बाहर ले < सुप वर्ग = "xref" > २७ , < सुप वर्ग = "xref" > २८ , < सुप क्लास = "xref" > २९ . श्लेष 5 & #181; CD31, CD34, VEGFR2, और & #945;-SMA की अभिव्यक्ति के लिए कुल प्रोटीन का g. data.
    6. को सामान्य करने के लिए & #945;-tubulin का प्रयोग करें
< p class = "jove_title" > 3. अप्रत्यक्ष रूप से इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. Sonicate 18 एमएम के ग् coverslips में ५०% एथेनॉल और इन् हें सुखाएं । एक 12-अच्छी तरह से रात भर की थाली में एक यूवी प्रकाश के साथ उंहें निष्फल पर स्वच्छ coverslips छोड़ दें ।
  2. कोट ५० & #18 के साथ coverslips1; जी/चूहे की पूंछ मैं कोलेजन और प्लेट एक ३७ & #176 के लिए स्थानांतरण; सी, 5% सह 2 मशीन के लिए कम से ६० min.
  3. महाप्राण कोलेजन और 12-अच्छी प्लेट को coverslips धोने के लिए 1x पंजाबियों के 1 मिलीलीटर जोड़ें । 1x पंजाबियों महाप्राण और दो बार दोहराएं ।
  4. बीज २५०,००० प्रत्येक कुआं में ईपीसी कल्चरल और उन्हें वापस ३७ & #176; C, 5% कं 2 मशीन से बाहर ले जाने से पहले कम 3 दिनों के लिए immunostaining.
  5. प्लेट धो 1x पंजाबियों के साथ 3 बार । प्रत्येक अच्छी तरह से बर्फ ठंडा मेथनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी कोशिकाओं को ठीक करने के लिए ।
  6. एक मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर immunostaining बाहर ले < सुप वर्ग = "xref" > २७ , < सुप वर्ग = "xref" > २८ , < सुप क्लास = "xref" > २९ . उनके उपयुक्त कमजोर पड़ने पर एंटीबॉडी का प्रयोग करें ( उदा., CD31 (1:20), CD34 (1:50), & #945;-SMA (1:100), आणि VEGFR2 (1:50)).
  7. एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर immunostained coverslips की छवियों को ले लो.

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Representative Results

अलगाव और Endothelial जनक कोशिकाओं का विस्तार:
एक योजनाबद्ध (चित्रा 1) समग्र प्रोटोकॉल चित्रण प्रदान की जाती है. विभिंन रक्त घटक परतों घनत्व ढाल माध्यम के साथ मानव गर्भनाल रक्त के घनत्व ढाल केंद्रापसारक निंनलिखित मनाया गया । कोलेजन का इलाज प्लेटों पर बहुराष्ट्रीय बोने पर, कालोनियों के विकास के पहले 5 और 7 दिनों के बीच मनाया (चित्रा 2ए) था । इन कॉलोनियों के विकास के लिए जारी रखा है और एक धुरी के आकार की कोशिका आकृति विज्ञान (चित्रा 2ए 2d) प्रारंभिक चरण में है, जो बाद में एक cobblestone की तरह आकृति विज्ञान (चित्रा 2ई-2F) के लिए प्रगति की थी । चित्र 3 एक संस्कृति में समय बनाम कक्षों की कुल संख्या दिखाता है, और प्रत्येक डेटा बिंदु प्रत्येक बीतने पर काटी गई कक्षों की संचई संख्या का प्रतिनिधित्व करता है । चित्र 3 ख औसत पहली कॉलोनी के लिए लिया समय के लिए कोलेजन में उठता-6-अच्छी तरह से बहुराष्ट्रीय बीज बोने के बाद प्लेट का चित्रण किया है ।

पश्चिमी सोख्ता का उपयोग कर लक्षण वर्णन:
चित्र 4 एक पश्चिमी दाग झिल्ली है कि विभिंन एंटीबॉडी के खिलाफ परीक्षण किया गया के प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है । हमारे परिणाम सुझाव है कि कोशिकाओं CD31 और CD34 के लिए सकारात्मक थे । CD31 की अभिव्यक्ति (चित्रा 4बी) और CD34 (चित्रा 4सी) के बाद के मार्ग में कमी दिखी, जबकि VEGFR2 (चित्रा 4डी) के बाद के मार्ग में समान रूप से व्यक्त किया गया था, पहले के साथ उच्च अभिव्यक्ति होने बीतने । हमने यह भी देखा कि ईपीसी ने mesenchymal सेल मार्कर α-SMA (चित्रा 4ई) को व्यक्त नहीं किया । मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVEC) और वाल्वुलर मध्यवर्ती कोशिकाओं (विक) सेल lysates क्रमशः सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । HUVECs CD31, CD34, और VEGFR2 व्यक्त करने के लिए जाना जाता है, जबकि VICs एक्सप्रेस α-स्म ।

Figure 1
चित्र 1 : ईपीसी अलगाव की योजनाबद्ध । HBSS के साथ कमजोर गर्भनाल रक्त से अलगाव शुरू और यह घनत्व ढाल माध्यम के शीर्ष पर ध्यान से लेयरिंग, के रूप में दिखाया गया है । स्तरित रक्त के घनत्व ढाल केंद्रापसारक बाहर किया जाता है रक्त है, जो बहुराष्ट्रीय (buffy कोट), घनत्व ढाल माध्यम, granulocytes, और कोशिकाओं के शामिल है की विशिष्ट परतों को प्राप्त करने के लिए । सबसेट छवि प्रदान की इन विभिंन परतों से पता चलता है । बहुराष्ट्रीय और एकत्र कर रहे है एक कोलेजन पर बीज-कोशिका संस्कृति प्लेट का इलाज किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . सेल कॉलोनी की प्रगति । (A-E) प्रतिनिधि उज्ज्वल समय के साथ ईपीसी कॉलोनी प्रगति के क्षेत्र छवियों । ध्यान दें कि इस कॉलोनी प्रारंभिक चरण में धुरी के आकार की कोशिकाओं है, cobblestone आकृति विज्ञान को गोद लेने । (ई) ईपीसी की प्रतिनिधि छवि एक टी-७५ कुप्पी में 3 गद्यांश में हुई । स्केल बार = २०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: ईपीसी का विकास घटता । (A) ग्राफ़ में समय की अवधि में बढ़ती हुई कोशिकाओं की संख्या को दर्शाया गया है, और प्रत्येक डेटा बिंदु प्रत्येक गद्यांश (P0-P10) (n = 4) के दौरान काटी गई सेल संख्या को दर्शाता है । (B) पहले ईपीसी कॉलोनी में 6-वेल प्लेट में दिखने के लिए लिया गया समय (n = 4) । त्रुटि पट्टियों मतलब (SEM) के मानक त्रुटि निरूपित । कोई सांख्यिकीय महत्व एक तरह ANOVA का उपयोग कर पाया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : वेस्टर्न सोख्ता । (एक) पश्चिमी दाग झिल्ली विभिंन एंटीबॉडी के साथ दाग । HUVEC lysate और विक lysate को पॉजिटिव कण्ट्रोल के तौर पर इस्तेमाल किया गया । (ख) CD31 बैंड की औसत तीव्रता α-tubulin के साथ सामान्यीकृत । (ग) CD34 बैंड की औसत तीव्रता α-tubulin के साथ सामान्यीकृत । (D) VEGFR2 बैंड की औसत तीव्रता α-tubulin के साथ सामान्यीकृत है । (E) α-tubulin (n = 3-6) के साथ सामान्यीकृत α-SMA बैंड की औसत तीव्रता । त्रुटि सलाखों SEM निरूपित । कोई सांख्यिकीय महत्व एक तरह ANOVA का उपयोग कर पाया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5: Immunostaining । ईपीसी के प्रतिनिधि छवियों ईजीएम में 7 दिनों के लिए और CD31, CD34, VEGFR2, और α-SMA के लिए विभिन्न मार्ग पर immunostained के लिए cultureed. स्केल बार-१०० µm. इस आंकड़े का बड़ा वर्शन देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Supplemental Figure 1
पूरक चित्रा 1: ग्राफ ईजीएम, इबीएम, और DMEM में जब संस्कृति 7 दिनों की अवधि में प्रति इकाई क्षेत्र कोशिकाओं की संख्या को दर्शाया गया है । ईजीएम मीडिया (इबीएम और DMEM) के साथ तुलना में उच्च कोशिका वृद्धि दिखाई । डेटा में, p & #60; ०.०१ के साथ, एक-तरफ़ा ANOVA (n = 2) का उपयोग करते हुए सांख्यिकीय महत्व दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplemental Figure 2

/> पूरक चित्रा 2: इबीएम में ईपीसी कल्चर्ड की प्रतिनिधि छवियां 7 दिनों के लिए और immunostained के लिए CD31, CD34, VEGFR2, और α-SMA के लिए । स्केल बार = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Supplemental Figure 3
पूरक चित्रा 3: DMEM में ईपीसी कल्चर्ड की प्रतिनिधि छवियां 7 दिनों के लिए और immunostained के लिए CD31, CD34, VEGFR2, और α-SMA के लिए । स्केल बार = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

जैसा कि पहले उल्लेख किया है, अनुयाई ईपीसी एक cobblestone आकृति विज्ञान के अधिकारी । हमारे पृथक बहुराष्ट्रीय एक धुरी के आकार का सेल कॉलोनी से प्रगति की (चित्रा 2ए-2d) प्रारंभिक दौर में एक cobblestone कॉलोनी (चित्रा 2ई-2F) संस्कृति में दस दिनों की अवधि में । ईपीसी विभिंन अनुसंधान समूहों द्वारा अलग लेबल किया गया है, अर्थात् के रूप में देर endothelial जनक कोशिकाओं को10, endothelial कॉलोनी बनाने कोशिकाओं5, या endothelial जनक कोशिकाओं12। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इन कोशिकाओं को कार्यात्मक एक ही है और इसी तरह के सेल सतह मार्करों व्यक्त कर रहे हैं । संस्कृति अवधि (चित्रा 3) के दौरान मनाया कोशिकाओं की संख्या लगभग 108 कोशिकाओं, पिछले प्रकाशनों के अनुरूप है और ईपीसी3,5की उच्च प्रफलन क्षमता की खासियत के लिए वृद्धि हुई । वास्तव में, यह पाया गया कि मानव गर्भनाल रक्त से प्राप्त ईपीसी एक उच्च प्रफलन क्षमता दिखाया और वार्धक्य के दौर से गुजर से पहले कई जनसंख्या दोहरीकरण का प्रदर्शन किया ईपीसी वयस्क मानव परिधीय रक्त से अलग5 , 10.

हमारे वेस्टर्न सोख्ता परिणाम (चित्रा 4ए) ने सकारात्मक नियंत्रण, lysates की तुलना में ईपीसी से प्राप्त सेल HUVEC पर CD31, CD34, और VEGFR2 की उपस्थिति दिखाई । HUVECs एक्सप्रेस CD31, CD34, र VEGFR2 र आपन विक व्यक्त α-sSMA । पिछले रिपोर्टों के समान10,18, CD31 की अभिव्यक्ति उच्च मार्ग के साथ कम हुई । अभिव्यक्ति पैटर्न भी CD34 और VEGFR2 के मामले में समान था, जहां दोनों मार्करों दृढ़ता से पहले पारित होने में व्यक्त किया गया और अपेक्षाकृत कम लेकिन बाद में मार्ग में बराबर मात्रा में । यह डेटा पिछले समूह के परिणामों के साथ अनुबंध में मौजूद एक रुझान दिखाता है, जिसमें immunosorting-आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग गर्भनाल रक्त-व्युत्पंन ईपीसी12को अलग करने के लिए किया गया था । आम तौर पर, ईपीसी mesenchymal मार्करों व्यक्त नहीं करते हैं और, सत्यापित करने के लिए कि प्रकृति में अलग कोशिकाओं mesenchymal नहीं थे, हम α-SMA के साथ हमारे पश्चिमी दाग झिल्ली immunolabeled । हमारे परिणाम स्पष्ट रूप से बताते हैं कि जब VICs से एकत्र सकारात्मक नियंत्रण सेल lysates से तुलना की जाती है, जो α-sma एंटीबॉडी की मजबूत अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करते हैं, तो कल्चरल ईपीसी में कोई α-sma अभिव्यक्ति नहीं थी ।

प्रदर्शित करने के लिए कि ईजीएम अंय संस्कृति ईपीसी के लिए इस्तेमाल मीडिया की तुलना में वृद्धि की सेल प्रसार के लिए अनुमति देता है, हम मीडिया के तीन विभिंन प्रकार में कोशिकाओं संस्कृति: DMEM, इबीएम, और ईजीएम (यानी, विकास कारकों के साथ पूरक इबीएम, के रूप में पहले उल्लिखित) । सभी 10% FBS के साथ पूरक थे । हम एक 12-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं में विभिंन मार्ग की कोशिकाओं को वरीयता प्राप्त है । पूरक आरेख 1 विभिंन मीडिया योगों में संस्कृति में प्रत्येक well समय में प्रति इकाई क्षेत्र कक्षों की संख्या दिखाता है । हम ध्यान दें कि ईजीएम में ईपीसी संस्कृति कक्ष संख्या में एक स्थिर वृद्धि दिखाई, और इबीएम में कोशिकाओं के लिए, वहां पहले तीन दिनों के दौरान सेल संख्या में वृद्धि की एक धीमी दर थी, जो बाद में पठारी । यह पता चलता है कि ईपीसी अभी भी इबीएम में बच सकता है, लेकिन विकास कारकों के अभाव प्रसार रुकावट । हम यह भी ध्यान दें कि संख्या में DMEM गिरावट में ईपीसी संस्कृति, सुझाव है कि इस विशेष माध्यम निर्माण उनके अस्तित्व या प्रसार के लिए उपयुक्त नहीं है । हमारे immunostaining डेटा से पता चलता है कि ईजीएम में ईपीसी कल्चरित (चित्रा 5) ईपीसी (पूरक चित्रा 2) और इबीएम (पूरक चित्रा 3) में DMEM संस्कृति की तुलना में अधिक CD31 व्यक्त किया. पूरक चित्रा 2 और पूरक चित्रा 3के साथ चित्रा 5 की तुलना, यह देखा जा सकता है कि कोशिकाओं अन्य सेल प्रकार के साथ दूषित नहीं थे. इसके अलावा, जब immunostained ईपीसी (चित्रा 5) की तुलना, हम गुणात्मक राज्य कर सकते है कि CD31 और CD34 की अभिव्यक्ति उच्च मार्ग पर कमी आई है, हमारे पश्चिमी दाग डेटा (चित्रा 4) का समर्थन ।

पुनरावृत्ति करने के लिए, हमारे प्रस्तावित प्रोटोकॉल का प्राथमिक लक्ष्य यह प्रदर्शित करना है कि एक विशिष्ट चुनिंदा मीडिया में संवर्धन रक्त बहुराष्ट्रीय द्वारा endothelial जनक कोशिकाओं को अलग कर सकते हैं । यह दिखाने के लिए कि ईपीसी परिष्कृत उपकरण और प्रक्रियाओं के बिना अलग किया जा सकता है, अंय तरीकों कि प्रवाह cytometry के उपयोग को शामिल करने के विपरीत-या तो तुरंत बहुराष्ट्रीय कंपनी अलगाव के बाद1,3,20 , 30 या उसके बाद कालोनियों में एक monolayer में वृद्धि हुई है-बाद में4,10,12,13,23। ईपीसी कालोनियों आमतौर पर 5 और 9 दिनों के बीच दिखाई देते हैं । हमारे विधि इस प्रकार ईपीसी अलग करने के लिए एक तेजी से और अधिक लागत कुशल विधि है । इस तकनीक की प्राथमिक सीमा यह है कि CD31 और CD34 की अभिव्यक्ति बाद के मार्ग के साथ कम हो जाती है, जो सुझाव दे सकता है कि कोशिकाओं को अपने जनक phenotype खो रहे हैं । इस प्रकार, यह सिफारिश की है कि एक 5 गद्यांश या कम से प्राप्त कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए प्रयोग करना चाहिए अगर इस प्रोटोकॉल का उपयोग ।

सावधानियों घनत्व के बाद लिया जाना चाहिए विभिंन परतों को परेशान नहीं जब केंद्रापसारक ट्यूबों ले वापस हुड में और भी जब प्लाज्मा को हटाने । एक और महत्वपूर्ण कदम एरिथ्रोसाइट lysis से संबंधित है, जहां एक लंबी मशीन समय संभावित बहुराष्ट्रीय कंपनी को नुकसान पहुंचा सकता है । यह इस प्रकार दो बार से अधिक इस कदम को दोहराने की सिफारिश नहीं है । दरअसल, के बाद से मध्यम आकांक्षा किया जाता है बाहर चढ़ाना के बाद 24 ज, एरिथ्रोसाइट्स की मात्रा का पता लगाने हटा रहे हैं, के रूप में वे गैर अनुयाई हैं । fibronectin या जिलेटिन की तरह वैकल्पिक सब्सट्रेट, जबकि हमारे द्वारा परीक्षण नहीं, भी सेल संस्कृति कोटिंग्स बनाने के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल के अनुसार इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रारंभिक चरणों में मामूली संशोधन को रोजगार से, शोधकर्ताओं गैर अनुयाई ईपीसी30को अलग कर सकते हैं ।

अंत में, हम गर्भनाल रक्त से अलग ईपीसी की एक विधि की सूचना दी है । यह ध्यान रखें कि ईपीसी α-SMA की तरह व्यक्त मार्करों नहीं है, सुझाव है कि वे mesenchymal की तरह कोशिकाओं नहीं कर रहे है महत्वपूर्ण है । दरअसल, α-SMA ईपीसी के endothelial-mesenchymal संक्रमण (इंडो-एमटी) का अध्ययन करने की कोशिश करते समय एक महत्वपूर्ण मार्कर के रूप में कार्य करता है । इंडो-मीट्रिक टन एक सेलुलर transdifferentiation प्रक्रिया है जिसके दौरान endothelial कोशिकाओं को अपने विशिष्ट मार्करों खो जाने के लिए और एक mesenchymal की तरह सेल phenotype को बदलने के लिए जाना जाता है । यह दिखाया गया है कि ईपीसी को बदलने की उपस्थिति में इस संक्रमण से गुजरना कर सकते है विकास कारक-β7 और उनके ऊतक-इंजीनियर मचान पर extracellular झिल्ली प्रोटीन जारी कर सकते हैं8. इन सभी टिप्पणियों के लिए एक ऑटोलॉगस सेल स्रोत के रूप में उपयोग के लिए एक दिल वाल्व या अंय हृदय ऊतक-इंजीनियर निर्माण बनाने के लिए ईपीसी का वादा संकेत मिलता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह सामग्री अनुदान नहीं के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित काम पर आधारित है । CMMI-१४५२९४३ और विश्वविद्यालय द्वारा Arkansas ऑनर्स कॉलेज. हम भी हमें गर्भनाल रक्त इकाइयों के साथ उपलब्ध कराने के लिए Arkansas गर्भनाल रक्त बैंक स्वीकार करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A) For isolation and culturing
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162 This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium
Fetal Bovine Serum Thermofisher Scientific 26140079
Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100x) Thermofisher Scientific 10378016
Ficoll-Paque GE Heatlhcare 17-1440-02
Hank's Balanced Salt Solution Thermofisher Scientific 14170-112
Ammonium Chloride Stem Cell Technologies 7850
1x Phosphate Buffer Saline Thermofisher Scientific 14190250
Rat Tail I Collagen Corning 354236
Glacial Acetic Acid Amresco 0714-500ML
0.05% Trypsin-EDTA Thermofisher Scientific 25300054
HEPES buffer Thermofisher Scientific 15630080
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Thermofisher Scientific 10566-016
B) Antibodies and cell lysates
CD31  Abcam ab28364 1:250 dilution  for Western blotting
CD34 Santa Cruz Biotechnology sc-7045 1:100 dilution for Western blotting
α-SMA abcam ab5694 1:100 dilution for Western blotting
α-tubulin abcam ab7291 1:2,500 dilution for Western blotting
VEGFR2 abcam sc504 1:100 dilution for Western blotting
Human umbilical vein endothelial cell lysate Santa Cruz Biotechnology sc24709 
Valve interstitial cell lysate Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer
C) Western blotting and immunostaining
10x Tris/Glycine/SDS buffer Biorad 161-0772 Used as running buffer
10x Tris/Glycine buffer Biorad 161-0771 Used as transfer buffer
Immobilon-FL transfer membrane Merck Millipore IPFL0010 This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane
4x Laemmli sample buffer Biorad 161-0747
2-mercaptoethanol Biorad 161-0710
10% Criterion TGX precast gel Biorad 5671033
Prolong Gold antifade Thermofisher Scientific P36930 Used for mounting immunostained coverslips for long term storage
Methanol VWR Analytical BDH1135-4LP

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मानव गर्भनाल रक्त से Endothelial जनक कोशिकाओं का अलगाव
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Ravishankar, P., Zeballos, M. A.,… More

Ravishankar, P., Zeballos, M. A., Balachandran, K. Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood. J. Vis. Exp. (127), e56021, doi:10.3791/56021 (2017).

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