Summary
このプロトコルの目的は、臍帯血由来の血管内皮前駆細胞を分離することです。一部のアプリケーションは虚血性疾患の治療、心血管のリスクを持つ患者を識別するためのバイオ マーカーとしてこれらの細胞を使用して、作成組織設計の血管や心臓の弁を構築あります。
Abstract
末梢血血管内皮前駆細胞 (Epc) の存在とその血管関与 Ashara と同僚1によって報告されました。後で、他の人は骨髄2,3から発信された Epc の類似の種類の存在を記載されています。最近では、ヨーダとイングラム臍帯血由来の Epc を示した可能性があった、高い増殖大人周辺から分離されたものと比較して血の4,5,6。生後の発生に関与しているから離れて Epc また組織設計血管や心臓弁構造7、8を作成するための細胞源として約束を示しています。様々 な隔離のプロトコルが存在、内皮細胞および造血のマーカーの助けを借りて、上記のソースから派生した単核細胞 (多国籍企業) のセルの並べ替えや養殖専門内皮増殖とこれらの多国籍企業を含むいくつか媒体、またはこれらの技術9の組み合わせ。ここでは、隔離のためのプロトコルを提案する、Epc を使用しての文化専門血管内皮成長因子、西部にしみが付くことを使用して隔離されたセルの特性評価に続いて immunosorting を使用せず培と免疫染色。
Introduction
いくつかの調査官は、特性と人間 Epc5,10、11,12,13の可能性を勉強しています。Epc は、循環血管内皮組織低酸素、虚血、外傷、あるいは腫瘍形成のサイトに従うし、新しい血管構造4,14の形成に貢献する能力を持っている細胞として記述することができます。観測へ生後発生の形での血管新生の関与は、これらの細胞とその治療への応用4,15,の病態生理の理解につながっている16. 心血管の病理学9,15,16,17,と18,19 相関する個々 の Epc の数が示されています。 ,20。他の研究も Epc を弁線維芽細胞のような表現型に分化して組織工学心臓弁7、21のこれらの細胞を使用できることを提案しました。
調査4間の不一致のための Epc を分離するために必要な特定の細胞表面分子が明確に識別されていません。いくつかグループ1,17,22,23, Epc の推定される可能性があることを示唆によって実行された多国籍企業のさまざまな培養条件への露出で、特定のマトリックスへの接着異なる表現型プロパティを表示します。これらのプロパティには、貪食能力、マトリゲル、管形成と Dil アセチル化低密度リポタンパク質の摂取量の不足が含まれます。高いクローンと増殖能は、どの Epc と階層化された5をすることができます 2 つのプロパティです。Epc はまた4ひと胎児肺線維芽細胞の遊走と、体外に尿細管を形成できます。これらの細胞は、血管内皮細胞表面マーカーを表現して造血マーカー13,24,25のいくつかを共有するために知られています。フェノタイピング Epc の広く受け入れられている積極的に表現されたマーカーは CD31 CD34、血管内皮増殖因子受容体 2 (VEGFR2)、フォン ・ ヴィレブランド因子 (vWF)、CD133、c キットと血管内皮細胞のカドヘリン (VE カドヘリン)4,18. 共同 CD90、CD45、CD14、CD115、または α-平滑筋アクチン (α SMA) を発現する細胞が貪食、細菌およびde novo人間を形成することができない限られた増殖、潜在的な能力のため Epc をするとは見なされません船生体内で4,7。この資料では、プロトコルをソートの任意のセルを必要とせず人間の臍帯血から血管内皮前駆細胞の分離のための修正されたプロトコルについて説明します。この記事の負のインジケーターとして α SMA との肯定的なマーカーとして VEGFR2、CD34、CD31 を使いました。
この記事での分離及び細胞を使用して選別することがなく臍帯血由来の血管内皮前駆細胞を培養法特化成長因子 (EGM) と内皮増殖培を提案する.この EGM には、血管内皮増殖因子 (VEGF) と線維芽細胞成長因子 (FGF)、生存、増殖、および内皮細胞26の移行を強化が含まれています。セルの石畳の形態を維持するために責任があるアスコルビン酸も含まれていますインスリン様成長因子-1 (IGF-1 の)、血管新生と渡り鳥関数を提供します。成長因子の長期的な安定性の向上は、中型26ヘパリン。血管内皮細胞の培養液に追加他の成長因子には EGF26 に細胞の感受性を高める、ヒドロコルチゾンと分化、細胞増殖を刺激するのに役立ちます表皮の成長因子 (EGF) の補充が含まれています.この特定の成長媒体の使用の Epc 内皮細胞基本培地 (EBM) またはダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) と比較して高い数値を生成することを示す.
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Protocol
アーカンソー制度検討委員会 (承認番号 16-04-722) の大学の承認を得て本研究を行った。クエン酸リン酸ブドウ糖 (CPD) ソリューション アーカンソー臍帯血バンクでの臍帯血の単位が採集し、ストレージの要件を満たしていないユニット研究寄付しました。臍帯血の単位が周囲温度でコレクションの 24 h 内のラボに取った
。1 臍帯血から血管内皮前駆細胞の分離
- 試薬の準備。。
- インスリン様成長因子 (IGF) の 20 ng/mL、1 μ G/ml アスコルビン酸、5 ng/mL 組換えひと上皮増殖因子 (rhEGF)、22.5 μ G/ml を添加した内皮細胞基本培地 (EBM) を 10% 牛胎児血清 (FBS) に追加することで EGM を準備ヘパリン、および 0.5 ng/mL 血管内皮増殖因子 (VEGF)、10 ng/mL 組換えひと線維芽細胞成長因子 B の (rhFGF-B)、0.2 μ g/mL ヒドロコルチゾン 2% ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミンと。0.2 μ m ポリエーテルサルホン (PES) 膜の真空フィルターを用いた培養培地を滅菌します 。
- 準備ラットの尾私コラーゲン液 0.02 N 酢酸を使用して 50 μ g/mL の濃度で。0.2 μ m のシリンジ フィルターを使用してこのソリューションを滅菌します 。 準備されたラットの 2 mL で
- 前コート 6 ウェル プレートは私に各ウェルのコラーゲン溶液を尾します。播種前に 5% CO 2 1 h 以上の 37 ° C で維持されるインキュベーター内に配置します 。
- 臍帯血とハンクス平衡塩ソリューション (HBSS) 1:1 の濃度の約 25 mL の希釈します 。
- 準備ラジオ免疫沈澱試金塩化ナトリウム 150 mM、1% トリトン X-100, デオキシ コール酸ナトリウム 0.5%、1 mM の β-グリセロリン酸、0.1 %sds と 50 mM トリス (pH 8.0) を使用して (RIPA) バッファーします 。
- 血管内皮前駆細胞の単離。
- 暖かいすべて準備隔離前の 37 ° C で維持水浴の試薬 。
- 密度勾配中の試薬の 20 mL を 50 mL の遠心管に追加します 。
- 慎重にチューブの側の壁に向かってピペットを目指すことでこの層を壊すことがなく密度勾配媒体を含む遠心管中の希薄臍帯血 20 mL をレイヤーします 。
- は、オフ遠心ローターのブレーキと、室温で 30 分間 800 × g で遠心分離によって血液の密度 ( 図 1) に基づくコンポーネントを区切ります。異なるレイヤーを邪魔しないでください 。
- は、慎重にピペット チップが MNC に到達できるまでのレイヤー層 ( 図 1 を参照)、他のセルを乱すことがなくチューブからそれをピペッティングによるプラズマ層を削除します。削除されたプラズマを破棄します
。 注: プラズマを削除するピペット チップを使用している間プラズマ MNC 層擾乱を抑える ( 図 1) の上の小さい層のままにします 。
- 18 g 針に装着する注射器を使用して多国籍企業を含むバフィー コートを収集し、新鮮な遠心管にそれを転送します 。
- EBM の等量に追加収集した遠心多国籍企業これらの管 500 × g 10 分間で 4 ° c. 破棄上澄み。
。 注: 細胞ペレットが表示されます赤い赤血球・赤血球の存在のため 。
- は、赤色の血液細胞を溶解する塩化アンモニウム溶液 5 mL を追加します。時折揺れとの 5-10 分のための氷にこのチューブをインキュベートします
。 注: 注意が必要このステップの間に時間の長さを超えないように多国籍企業に有害することができます 。
- (500 g) x 4 ° C で 10 分間のチューブを遠心分離し、上澄みを廃棄します。赤血球が持続する場合手順を繰り返して 1.2.8 と 1.2.9 ペレットでは赤い色は認められなかった 。
- 準備 EGM でペレットを再懸濁し、多国籍企業をカウントするため、検定を使用します 。
- 吸引ラット尾私 (ステップ 1.1.3) からのコラーゲン膜 6 ウェル プレート、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) × 1 で 3 回洗浄します 。
- 種子 1 x 10 7 各ウェルの多国籍企業の濃度のコラーゲン プレートに EGM で再停止される多国籍企業ペレットです。37 ° C、5% CO 2 インキュベーターにそれを配置します 。
- 後 24 h、培地を吸引、EGM で一度洗浄します。各ウェルに EGM 培地 3 mL を追加し、37 ° C、5% CO 2 インキュベーターに戻した 。
- は、毎日 7 日間新鮮な EGM 媒体とプレートを補充します。7 日後 EGM 媒体に他の毎日を変更します 。
- 血管内皮細胞コロニーの進行を追跡するため、毎日 6 ウェル プレートの画像を取る明視野顕微鏡を用いたします。マーク プレート、コロニーが彼らの成長を追跡するため発生します
。 注: それは通常文化に表示する植民地、5 ~ 9 日かかります 。
- 血管内皮前駆細胞の拡張。
- コート T-25 培養用フラスコのラット尾私のコラーゲン (50 μ g/mL) 37 ° C、5% CO 2 インキュベーター、少なくとも 60 分吸引それを置くし、T-25 細胞培養用フラスコ、細胞を播種する前に 1x PBS で 3 回洗う 。
- は、各ウェルに 0.05% トリプシン EDTA 溶液を 150 μ l 添加を使用サイズ約 3 mm に達すると内皮細胞コロニーを trypsinize します。6 ウェル プレートを 37 ° C、2-3 分のため 5% CO 2 インキュベーターに配置
- は、添付の細胞を除去する 6 ウェル プレートを軽きます。すぐに EGM の 2 mL を加えて 15 mL 遠心管の細胞を回復します 。
- 診断を使用してセルをカウントし、初期播種密度を計算します 。 400 x g で 5 分間
- スピン 15 mL 遠心管は EGM で細胞ペレットを再懸濁しますで 〜 500,000 細胞 T-25 フラスコをシードします。通路 1 としてこのフラスコをマークし、37 ° C、5% CO 2 インキュベーターに戻って T-25 フラスコを配置します
。 注: セルは EGM の成長を比較する EBM と DMEM でめっきすることをがします 。
- さらに通路のフラスコでは、90% の合流点に達すると、手順 1.3.1 - 1.3.5 と T-75 または T-175 細胞培養フラスコに 10 の 4 セル/cm 2 で細胞を再シードします。隔離されたセル (手順 2 および 3) の評価に進みます 。
2。隔離されたセルを使用して西部にしみが付く特性
隔離されたセルを特徴付ける拡張手順に従うときすべての通路に- 追加 50-100 μ L の換散バッファー。約 500,000 以上の細胞から蛋白質を収集します 。
- の細胞を破壊し、蛋白質を解放する精力的にピペットを上下。収集し、遠心管にバッファーを転送します 。
- は 500 × g で遠心管を回転し、新しい微量遠心チューブに上清を慎重に転送します。ラベル付けし、長期保存用-80 ° c チューブを保存します 。
- いずれかのブラッドフォードを使用して各チューブの蛋白質の量を定量化する ' s または BCA アッセイ 27 , 28 , 29 。
- は、ウエスタンブロット標準手順 27 , 28 , 29 を使用して実行します。総蛋白質 CD31、CD34、VEGFR2、α SMA の表現のための 5 μ g を分析します。データの正規化のため α-チューブリンを使用します 。
3。間接蛍光抗体法
- 50% エタノールで 18 mm ガラス coverslips に超音波を照射して乾燥させる。それらを殺菌する光 uv クリーン coverslips を残すバイオ セーフティ フードで一晩 12 ウェル プレートで 。
- コート 50 ・ #18 と coverslips1; グラム/mL のラットの尾私のコラーゲンと 37 ° C, 60 分、少なくとも 5% CO 2 インキュベーターにプレートを転送
- は、コラーゲンを吸引し、洗浄、coverslips に 12 ウェル プレートに 1 mL の 1x PBS を追加します。1 × PBS を吸引し、2 回繰り返します 。
- シード 250,000 培養も 37 ° C では、免疫染色を行う前に、少なくとも 3 日間 5% CO 2 インキュベーターに戻ってそれらの場所で Epc 。
- 1x PBS で 3 回洗浄します。各ウェルに冷たいメタノール 1 mL を追加し、セルを修復するのに 15 分間、室温でインキュベートします 。
- は、標準プロトコル 27 , 28 , 29 を使用して染色を行います。抗体を使用して、彼らの適切な希薄で (例えば CD31 (1:20)、CD34 (1:50)、α SMA (1: 100) と VEGFR2 (1:50)).
- 落射蛍光顕微鏡を用いた immunostained coverslips の画像を撮影します 。
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Representative Results
分離と血管内皮前駆細胞の拡張:
総合的なプロトコルを描いた模式図 (図 1) を提供します。次の密度勾配媒体でひと臍帯血の密度勾配遠心法別の血コンポーネント レイヤーが観察されました。コラーゲン治療プレートに多国籍企業を播種時にコロニーの副産物が最初日 5 と 7 (図 2A) の間観察されました。これらの植民地は成長を続け、石畳のような形状 (図 2E 2 階) に進んで後初期の段階で紡錘形細胞の形態 (図 2A 2 D) を持っていた。図 3A文化、時間対セルの合計数を示しています、各データ ポイントを表す各通路で採取した細胞数の累計。図 3Bは、多国籍企業を播種後コラーゲン処理 6 ウェル プレートで発生する最初の植民地は、平均時間を示しています。
西部にしみが付くことを使用しての評価:
図 4Aは、西部のしみの膜種々 の抗体に対してテストされた代表者を示しています。細胞は CD31 CD34 に陽性が示唆されました。CD31 の式 (図 4B) と CD34 (図 4C) 登場以降の通路上の減少に対し VEGFR2 最初の後の通路で同様に発現していた (図 4D)高い表現を通路します。我々 はまた、Epc は、間葉系細胞マーカー α-SMA (図 4E) を表現しなかったことを観察しました。ひと臍帯静脈血管内皮細胞 (新生活)、弁間質細胞 (VIC) セル lysates はそれぞれ正と負のコントロールとして使用されました。比較は、VICs 表現 α SMA VEGFR2、CD34、CD31 を表現する知られています。
図 1: EPC 分離のスケマティック。ように HBSS 密度勾配媒体上に慎重にそれを重ねると血液の希釈コードによって分離開始。層状の血液の密度勾配遠心法は、多国籍企業 (バフィー コート)、密度勾配媒体や顆粒球、赤血球から構成される血の独立した層を取得する行われます。提供されたサブセットのイメージは、これらの異なる層を示しています。多国籍企業は収集され、コラーゲン治療細胞培養プレートを再シードします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.細胞コロニーの進行です。(A ~ E)時間をかけて EPC コロニー進行の代表的な明るいフィールド画像。植民地では、初期の段階では、石畳の形態を採用することの紡錘形細胞に注意してください。(E) 通路 3 T-75 フラスコで培養した EPC の代表的なイメージ。スケール バー = 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:Epc の成長曲線します。(A) グラフ、時間の期間にわたって育つセルの数と、データ ポイントのセルを示します (P0 - P10) 各通過中に収穫数 (n = 4)。6 ウェル プレートに表示する最初の EPC のコロニーは、(B) 時間 (n = 4)。誤差範囲 (SEM) 平均値の標準誤差を示します。一方通行 ANOVA を使用して統計的有意性が見つかりませんでした。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 西部のしみ。(A) 西部のしみの膜が様々 な抗体で染色します。新生活ライセートとヴィック lysate はポジティブ コントロールとして使用されました。(B) α-チューブリンと正規化 CD31 バンドの平均輝度。(C) α-チューブリンと正規化 CD34 バンドの平均輝度。(D) α-チューブリンと正規化 VEGFR2 バンドの平均輝度。(E) α SMA バンドの平均輝度正規化 α-チューブリン (n = 3-6)。誤差範囲を示す SEM一方通行 ANOVA を使用して統計的有意性が見つかりませんでした。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5:免疫染色。EGM で培養 7 日、様々 な文章で immunostained CD31、CD34、VEGFR2、α SMA に Epc の代表的なイメージ。スケール バー - 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1:7 日間の期間にわたってグラフの単位面積あたりの細胞数、EGM、EBM、DMEM 培養した場合。EGM (EBM および DMEM) メディアと比較してより高い細胞の成長を示した。データは、p の統計的有意性を示した < 0.01、一方通行 ANOVA を使用して (n = 2)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
/>補足図 2: EBM に培養 7 日と immunostained CD31、CD34、VEGFR2、α SMA に Epc の代表的なイメージ。スケールバー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 3:7 日間の immunostained DMEM 培養 CD31、CD34、VEGFR2、α SMA に Epc の代表的なイメージ。スケールバー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
前述したように、付着性の Epc は、石畳の形態を所有しています。私たちの孤立した多国籍企業から進歩した紡錘形細胞コロニー (図 2A 2 D) 初期段階で石畳の植民地 (図 2E 2 階) に 10 日間の培養期間。Epc ラベル付けされている異なる研究グループによって異なる後期の血管内皮前駆細胞の10、としてすなわち内皮細胞コロニー形成細胞5、または血管内皮前駆細胞12。それは、これらの細胞は機能的に同じと類似の細胞表面マーカーを表現こと注意してください。ほぼ 108セル、前の出版物に類似して、Epc3、5の高い増殖能の典型的な増資文化期間 (図 3) の間に観察したセル数です。確かに、Epc が大人のひと末梢血5から分離された Epc と比較して老化を経る前に、高い増殖可能性と実証いくつか人口 doublings ひと臍帯血から得られることが分かった,10。
西部のしみが付く結果 (図 4A) は、肯定的な制御、螢光に比べて Epc から得られたセル lysates の CD31、CD34、VEGFR2 の存在を示した。Huvec は、CD31、CD34、VEGFR2 の表現し、ヴィック エクスプレス α sSMA を活性化します。以前レポート10,18と同様に、CD31 の式は高い通路で減少しました。表現パターンも CD34 と VEGFR2、最初の通路および後の通路で比較的低いが、等しい量で両方のマーカーが強く表現の場合と同様だった。このデータは、前のグループの結果、臍帯血由来 Epc12を隔離するため immunosorting ベースのプロトコルを用いてと一致している傾向を示しています。一般的に、Epc は間葉系マーカーを表現しないと、隔離されたセルが自然の中で間葉系でなかったことを確認する私たちカルビンディン抗体 α SMA と私達の西部のしみの膜。我々 の結果は、培養 Epc α SMA 抗体の強い表現を表わす VICs から収集した肯定的な制御セル lysates と比較した場合に α SMA 表現があったことを明確に示します。
3 つの異なる種類のメディアで細胞培養を行った EGM が Epc の使用他の培地と比較して高められた細胞増殖のできることを示すため、: DMEM、EBM、EGM (すなわち、前述したように成長因子を添加した EBM)。すべては 10% と補われた政府短期証券。12 ウェル プレートの各ウェルに異なる通路の細胞の種をまいた。補足図 1配合で、さまざまなメディア文化の時間をかけて各ウェルで単位面積あたりのセル数を示します。我々 は EGM の培養の Epc を示したこと着実に増加 ebm、細胞、細胞数、遅い速度の頭打ちになった後、最初の 3 日間の細胞数の増加があった注意してください。これは、Epc は、ebm、まだ生き残れるが、成長因子の不在を妨げ増殖を示唆しています。この特定の媒体の定式化は自分の生存や増殖に適していないことを示唆している数、DMEM 減少で培養した Epc も注意してください。免疫染色データは、EGM (図 5) で培養した Epc 表現 CD31 Epc では EBM (補足図 2) や DMEM (補足図 3) 培養と比較してより多くであることを示しています。補足図 2 補足の図 3と図 5を比較すると、それ見ることができる、細胞が他の細胞型にないに汚染されていた。また、immunostained Epc (図 5) を比較すると、ことができる質的状態 CD31 および CD34 発現が高い箇所を減少すること私達の西部のしみのデータ (図 4) をサポートします。
繰り返しますが、私たちの提案の主な目的は、1 つは専門の選択培地で培養血多国籍企業によって血管内皮前駆細胞を分離することを示すことです。これは Epc が洗練された機器とフローサイトメトリー - 多国籍企業分離1,3,20後すぐにいずれかの使用を含む他のメソッドとは異なり、手続きすることがなく分離することができますを示すもの,30 - 単層にコロニーが成長して4,10,12,13,23replating 続いてまたは。EPC のコロニーは、通常 5 日から 9 日間表示されます。本手法は、Epc を隔離するためのより速くよりコスト効率の高い方法です。この手法の主な制限は、セルがその前駆細胞の表現型を失っていることを示唆その後通路で CD31 CD34 の発現を減少させることです。したがって、1 つ必要がありますこのプロトコルを使用する場合は、実験を実施する 5 または下の通路から得られた細胞を使用をお勧めします。
フードに戻って遠心チューブを撮影するときに別のレイヤーを邪魔しないように密度遠心分離後講じる必要がありますまた、プラズマを削除するとき。もう一つの重要なステップより長い培養時間可能性があります潜在的 MNC を損傷赤血球溶解に関係します。このように、2 倍以上この手順を繰り返すことをお勧めします。確かに、中の誤嚥はめっき後 24 h 実施、ので微量赤血球が削除されます、彼らは非付着性。フィブロネクチン、ゼラチンなどの代替基板、未確認ながらも使用できます特定のプロトコルによると文化コーティング セルを作成するため。初期の段階にマイナーな変更を採用し、研究者非付着 Epc30を分離することがあります。
結論として、我々 は臍帯血から Epc を分離する方法を報告しています。Epc を表明しない α SMA のようなマーカーのような間葉系細胞ではないことを示唆しているに注意することが重要です。確かに、Epc の内皮間葉転換 (遠藤 MT) を研究しようとしたとき、α SMA は重要なマーカーとして機能します。遠藤 MT は、彼らの特定のマーカーを失うし、間葉系細胞の表現型に変換中に内皮細胞が知られている細胞の分化転換プロセスです。Epc が増殖因子 β7を変換の存在下でこの遷移に入ることができ、彼らの足場の組織設計の8細胞外膜タンパク質を解放できることが示されています。.これらすべての観測は、心臓弁または他の心血管系組織設計の構造を作成する自家細胞ソースとして使用するための Epc の約束を示しています。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この材料はグラント号下の国立科学財団によってサポートされる作業に基づいてください。CMMI 1452943、アーカンソー大学の名誉の大学によって。我々 はまたアーカンソーの臍帯血バンク臍帯血の単位を提供する私たちを認識したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A) For isolation and culturing | |||
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 26140079 | |
| Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
| Ammonium Chloride | Stem Cell Technologies | 7850 | |
| 1x Phosphate Buffer Saline | Thermofisher Scientific | 14190250 | |
| Rat Tail I Collagen | Corning | 354236 | |
| Glacial Acetic Acid | Amresco | 0714-500ML | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| HEPES buffer | Thermofisher Scientific | 15630080 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
| B) Antibodies and cell lysates | |||
| CD31 | Abcam | ab28364 | 1:250 dilution for Western blotting |
| CD34 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-SMA | abcam | ab5694 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-tubulin | abcam | ab7291 | 1:2,500 dilution for Western blotting |
| VEGFR2 | abcam | sc504 | 1:100 dilution for Western blotting |
| Human umbilical vein endothelial cell lysate | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
| Valve interstitial cell lysate | Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer | ||
| C) Western blotting and immunostaining | |||
| 10x Tris/Glycine/SDS buffer | Biorad | 161-0772 | Used as running buffer |
| 10x Tris/Glycine buffer | Biorad | 161-0771 | Used as transfer buffer |
| Immobilon-FL transfer membrane | Merck Millipore | IPFL0010 | This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane |
| 4x Laemmli sample buffer | Biorad | 161-0747 | |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | 161-0710 | |
| 10% Criterion TGX precast gel | Biorad | 5671033 | |
| Prolong Gold antifade | Thermofisher Scientific | P36930 | Used for mounting immunostained coverslips for long term storage |
| Methanol | VWR Analytical | BDH1135-4LP |
References
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