Summary
DNA-Schäden reparieren Kinetik Studium erfordert ein System zur Läsionen an definierte Sub-atomaren Regionen zu induzieren. Wir beschreiben eine Methode zum Erstellen von lokalisierter Doppelstrang-Pausen mit einem konfokale Laserscanning-Mikroskop ausgestattet mit einem 405 nm-Laser und bieten automatisierte Verfahren zur Quantifizierung der Dynamik der Reparatur Faktoren bei dieser Läsionen.
Abstract
Die DNA-Schäden als Reaktion (DDR) verwendet eine Vielzahl von Proteinen zu erkennen, zu signalisieren und DNA-Läsionen zu reparieren. Abgrenzung dieser Reaktion ist entscheidend für die Genom-Wartung-Mechanismen zu verstehen. Da Rekrutierung und Austausch von Proteinen bei Läsionen sehr dynamisch sind, erfordert ihre Studie die Fähigkeit, DNA-Schäden schnell und räumlich abgegrenzt zu generieren. Hier beschreiben wir Verfahren zur DNA-Schäden in den menschlichen Zellen mit einem handelsüblichen Laserscanning-konfokale-Mikroskop verfügt über eine 405 nm Laserlinie lokal zu induzieren. Ansammlung von Genom-Wartung, die Faktoren bei Laser Streifen durch Immunfluoreszenz (IF) oder in Echtzeit bewertet werden können mittels Proteine mit fluoreszierenden Reporter verschlagwortet. Verwendung von phosphorylierten Histon H2A. X (γ-H2A.X) und Replikation Protein A (RPA) als Marker, die Methode bietet ausreichenden Auflösung lokal rekrutiert Faktoren von denen zu unterscheiden, die auf angrenzenden Chromatin verteilt. Wir bieten weitere ImageJ-basierte Skripts effizient überwachen die Kinetik der Protein Relokalisierung DNA Websites beschädigen. Diese Verfeinerungen erleichtern erheblich die Studie der DDR Dynamik.
Introduction
Zellen sind ständig endogenen und exogenen Quellen von DNA-Schäden ausgesetzt, die ihre genomischen Unversehrtheit bedrohen. Die DDR ist ein Ensemble der Signalwege, die erkennen, zu signalisieren und zu reparieren DNA-Läsionen um Genomstabilität aufrecht zu erhalten. Im DNA-Doppelstrang-Brüchen (DSB), tritt die DDR hauptsächlich auf zwei komplementäre Plattformen: γ-H2A.X-mit der Bezeichnung Chromatin und einer resezierten einzelsträngiger DNA (SsDNA) Region in der Regel mit dem SsDNA-Bindung komplexe RPA1,2beschichtet.
UV-Laser Mikro-Bestrahlung von Zellen, die bereits mit dem Thymidin analoge 5-Bromo-2' Deoxyuridine (BrdU) oder der Bisbenzimide Ethoxide Trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) DNA-Farbstoff sensibilisiert schafft eine Mischung aus einsträngiger Pausen (einschließlich DNA-Läsionen SSBs) und DSB, die eine lokalisierte DDR auf das Chromatin und SsDNA Plattformen3,4zu entlocken. Vorherigen Arbeiten zeigten, dass die Rekrutierung von Genom Wartungsfaktoren, diese zwei unterschiedlichen Plattformen auf DSB mit hochenergetischen UV-A-Lasern (335-365 nm) kombiniert mit IF2,5diskriminiert werden kann. Mikroskope mit solchen Lasern ausgestattet sind teuer, da sie ein Hochenergie-Laser und spezielle UV-A Übertragung Ziele damit weit weniger verbreitet in akademischen und pharmazeutischen Einstellungen als Laserscanning-konfokale Mikroskope mit 405 nm Laser erfordern Linien. Die Untersuchung von Protein-Rekrutierung und Austausch an Mikro-bestrahlten Standorten ist auch durch die mühsame manuelle Bildanalyse erforderlich, um das dynamische Verhalten des Genoms Wartungsfaktoren beschreiben ausgeschlossen.
Hier zeigen wir, dass die Pre-Sensibilisierung der Zellen mit BrdU oder BBET Nukleinsäure-Fleck gefolgt von Mikro-Bestrahlung mit einem 405 nm-Laser auf eine gemeinsame confocal Mikroskop ermöglicht die Überwachung des Genoms Wartung Faktor Dynamik bei DNA-Läsionen. Mit γ-H2A.X oder RPA komplexe Untereinheiten als Plattform Marker zusammen mit Z-Stapeln für größere Schärfentiefe und Dekonvolution für verbesserte Auflösung ermöglicht den Experimentator, Faktoren zu unterscheiden, die lokal zu DSB von denen geworben werden, die zu verbreiten großen Chromatin Domains rund um die ersten Läsion. Diese Untergliederungen nach unterschiedlichen Intra nuklearen Fächer hilft die möglichen Rollen des Fußgelenkes Proteine rekrutiert zu Mikro-bestrahlt Websites zu verfeinern. Wir bieten bequeme Protokolle und optimiert Rohrleitungen um die Dynamik des Genoms Wartungsfaktoren mit Open-Source-Software Fidschi (eine ImageJ-Verteilung)6,7,8schnell zu analysieren. Diese Verfeinerungen zu aktuellen Mikro-Bestrahlung Methoden ermöglichen die Studie der DDR in praktisch jedem Labor.
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Protocol
1. Pre-Sensibilisierung der Zellen
- 24 h vor der Mikro-Bestrahlung Experiment seed 40.000 U2OS Zellen pro Bohrloch in 1 X DMEM mit 10 % FBS in 8-Well Kultur mit 170 µm dicken Deckglas-wie Glas/Kunststoff-Böden gleitet zu gewährleisten maximale Durchlässigkeit von 405 nm Laserlicht und exzellente Bildgebung mit einem Laser-scanning invertiert confocal Mikroskop. Wenn ein 8-Brunnen-Objektträger, verwenden Sie 500 µL Medien oder Lösungen pro Bohrloch für alle nachfolgenden Behandlungen und waschen Schritte des Protokolls.
Hinweis: Durch ihre flache Morphologie, gute Haftung und große Kerne, U2OS Zellen erleichtern den Nachweis von Protein-Rekrutierung an Mikro-bestrahlten Standorten aber andere adhärenten Zelltypen können je nach Bedarf verwendet werden. Zellen sollten im Idealfall werden rund 80 % Konfluenz zum Zeitpunkt der Mikro-Einstrahlung auf die Zahl der bestrahlten Zellen pro Versuch. Sehr hohe Zusammenfluss kann Zellzyklus Änderungen ergeben, die spezifische Reparatur Wege wie homologe Rekombination stattfindet während der Phasen des Zellzyklus9S und G2 durcheinanderbringen können. - Brüten die Zellen über Nacht bei 37 ° C mit 5 % CO2, und dann die Zellen mit (Schritt 1.3) vorab zu sensibilisieren BrdU oder (Schritt 1.4) BBET (Hoechst 33342).
Hinweis: Um live Rekrutierung eines Proteins von Interesse (POI), DNA-Läsionen zu beobachten, transfizieren Sie oder transduzieren Sie Plasmid-DNA tragen eine Verschmelzung eines fluoreszierenden Proteins und ein POI-24 h nach Aussaat der Zelle. 24 h post-transfection/Transduktion, vorab zu sensibilisieren und Mikro-bestrahlen die Zellen um die Rekrutierung des POI an DNA-Schäden-Standorten in Echtzeit zu überwachen. - Um die Zahl der DSB durch Exposition gegenüber der 405 nm-Laser erzeugt fügen Sie 10 µM von BrdU an die Medien für 24 h vor dem Mikro-Bestrahlung hinzu. Spülen Sie vor dem Mikro-Bestrahlung, mit einer Mikropipette Zellen zweimal mit Medium ohne Phenol Red für maximale Belichtung der Zellen an den 405 nm Laser gewährleisten.
- Alternativ behandeln Sie Zellen für 15 min mit BBET bei 10 µg/mL in das entsprechende Medium in einer Zellkultur Inkubator bei 37 ° C. Spülen Sie nach der Behandlung zweimal mit Medium ohne Phenol rot vor Mikro-Bestrahlung.
2. Micro-Bestrahlung von Zellen
- Wählen Sie eine geeignete Laserscanning-confocal Mikroskop.
Hinweis: Die hier vorgestellten Experimente wurden auf einem Mikroskopsystem verfügt über eine 50 mW 405 nm Laserlinie und ein 63 X 1.4 numerische Apertur Öl Ziel durchgeführt. Um DSB zu generieren, Zellen wurden Mikro-bestrahlt, bei 1 X Scan Zoom bei 1.024 x 1.024 Pixel/Field (0,21 µm/Pixel bei 63 X Vergrößerung) und im unidirektionalen Modus 8 µs/Pixel. Die Laserleistung verwendet wurde bzw. 25 % und 80 % für BBET - und BrdU-Pre-sensibilisiert Zellen. Damit können Benutzer ihr System konfigurieren, war der Laser macht nach dem Ziel auf dem vorgestellten System mit einem Leistungsmesser gemäß Anweisungen des Herstellers gemessen. Die Messungen entsprechen 2,6 mW und 7.0 mW für BBET - und BrdU-Pre-sensibilisiert Zellen, beziehungsweise. -
Schalten Sie das Mikroskop und die Klimakammer.
- Legen Sie der Kammers auf 37 ° C mit 5 % CO2 , bevor Proben sich in den auf der Bühne Brutkasten befinden, unnötigen Stress zu den Zellen zu vermeiden und homogenen DDR Kinetik in Experimenten zu gewährleisten.
-
Wählen Sie Felder mit gut verteilten Zellen aus, stellen Sie den Fokus und registrieren Sie ihre Position zur Bildaufnahme nach dem IF-Protokoll zu erleichtern. Erwerben Sie mindestens ein Bild, das als Bezugspunkt zu überwachen, die Kinetik der Protein-Einstellung nach der Mikro-Bestrahlung vor Schäden dienen wird.
Hinweis: Gerasterten Kulturgefäße können auch verwendet werden, um die Lokalisierung von Mikro-bestrahlten Zellen in nachfolgenden Schritten zu erleichtern.- Stellen Sie für IF-Experimente mit BBET-markierten Zellen den Fokus auf Zellen unter Verwendung der 405 nm-Laser bei der niedrigsten Laserleistung ausreichen, um die Zellen zu visualisieren um ungerechtfertigte DNA-Schäden zu vermeiden.
- Vermeiden Sie die Verwendung Weitfeld Fluoreszenz zur Scharfeinstellung auf BBET-gefärbten Zellen wie UV-Licht von der Lampe abgegebenen DNA-Schäden an beleuchteten Orten induziert wird.
- Wenn BrdU-markierten Zellen verwenden, stellen Sie den Fokus mit differential Interferenz-Kontrast (DIC) oder Phasenkontrast-Bildgebung durch Sub-atomaren Funktionen wie Nukleolen betrachten.
- Wenn Sie Zellen mit dem Ausdruck Eindringmittel beschriftet POIs zu verwenden, wählen Sie eine Brennebene mit repräsentativen Fluoreszenzintensität.
Hinweis: Vermeiden Sie die Zellen, die sehr hohe Niveaus des POI zu äußern, wie starke Überexpression Serums Lokalisierung führen kann. Darüber hinaus wählen Sie Zellen, die den POI bei vergleichbarem ausdrücken (Auswahl der stabile Klone wird dringend empfohlen, um Variationen des POI Ausdruck und Rekrutierung zu minimieren).
- Stellen Sie für IF-Experimente mit BBET-markierten Zellen den Fokus auf Zellen unter Verwendung der 405 nm-Laser bei der niedrigsten Laserleistung ausreichen, um die Zellen zu visualisieren um ungerechtfertigte DNA-Schäden zu vermeiden.
- Konfigurieren Sie das Mikroskop für den Mikro-Bestrahlung Schritt mit dem Fluoreszenz-Recovery nach Immunofluoreszenz (FRAP) _module des Systems.
Hinweis: Die wichtigsten Parameter zu berücksichtigen, wenn das Mikroskopsystem Einrichtung für Mikro-Bestrahlung Experimente sind: die Ausgangsleistung der 405 nm Laser, Anzahl der Iterationen (d.h. die Anzahl der Zeiten, der Laser wird über dieselben Koordinaten gehen), Anzahl der Pixel/Feld (63 X Vergrößerung und 1.024 x 1.024 Auflösung, 1 Pixel = 0,21 µm), und Verweilzeit pro Pixel. All diese Faktoren wirken sich die Menge an Energie, die Zellen zu erleben und damit die Menge und Art der DNA schädigen generierten (siehe Diskussion weitere Dosis-Optimierung). - Mit dem FRAP-Modul von Mikroskopsystem, Mikro-bestrahlen Sie die Zellen.
Hinweis: Auf den meisten Systemen kann Mikro-Bestrahlung mehrerer Zellen in einem einzelnen Feld als Punkte oder Linien/Rechtecke (in der Regel 1-2 µm Breite) durchgeführt werden. Bei live-Imaging von Eindringmittel-markierten Proteinen sofort nach dem Schaden Sie, beschränken Sie die Mikro-Einstrahlung auf eine kleine Anzahl von Zellen pro Feld zu, da der Zeitaufwand für die Mikro-bestrahlen jede Zelle zu einer verzögerten Induktion der DDR führt. Dies ist besonders wichtig, bei der Überwachung von Proteinen, die sehr schnell zu DNA-Läsionen rekrutiert werden. -
Nach der Mikro-Bestrahlung, setzen Sie wieder den Multi-auch Folien oder Platten in einem Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 für die erforderliche Dauer vor der Proben für die Verarbeitung, wenn (Ziff. 5) oder gehen Sie sofort mit live-Imaging (Abschnitt 3).
- Als ersten Schritt beheben Sie die Zellen innerhalb von wenigen Minuten und bis zu ein paar Stunden nach Bestrahlung für das IF-Protokoll. Je nach der POI variieren Rekrutierung Kinetik. In der Regel Proteine, die im DSB und SSBs Chromatin verbunden sind werden sehr schnell auf die Läsion lokalisiert und werden manchmal innerhalb von 5 min. entfernt. Einige Faktoren wie diejenigen, die am SsDNA versammeln werden zu späteren Zeitpunkten rekrutiert werden, sobald die Resektion Maschinen engagiert hat und verbleiben dort für Stunden (siehe Abbildung 1 und Referenz4).
3. live-Imaging von Eindringmittel-markierten Proteinen
- Führen Sie Zeitraffer-Bildgebung der Mikro-bestrahlten Zellen. Für Proteine, die sind sehr schnell zu Läsionen rekrutiert, ein paar Sekunden pro Frame ist ideal, für Proteine, die auf den beschädigten Bereich später (z.B. Resektion Faktoren), Erwerb lokalisieren können jedoch alle 1 – 2 Minuten durchgeführt, bis ein Plateau erreicht wird.
Hinweis: Minimieren Sie die Laserleistung für die Bildaufnahme, Bleichen so weit wie möglich zu vermeiden und sicherzustellen, dass Protein Rekrutierung Standorten Schaden nicht Sättigung erreicht das Signal Quantifizierung ausschließen würde und anschließende analysiert (siehe Datenanalyse (Siehe Abschnitt 4). Auf dem vorgestellten System erfolgte die Bildgebung mit einem 63 X / 1,4 Öl-Objektive verwenden eine Verweilzeit 8 µs/Pixel, Auflösung 1.024 x 1.024, 1 X Zoom und Mittelung der 2. Beachten Sie, dass diese Parameter müssen für andere Systeme und/oder verschiedenen Experimenten optimiert werden können. - Mikro-bestrahlen die Zellen in weiteren Feldern bis Kinetik Messungen für 15-30 Zellen gewonnen werden. Wiederholen Sie die Experimente mindestens 3 Mal in biologischer Replikate, die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Rekrutierung Kinetik zu gewährleisten.
Hinweis: Wenn dieses Protokoll zu einem bestimmten konfokale System anzupassen, es möglicherweise sinnvoll, durch die Überwachung der Rekrutierung Kinetics von einem bekannten Fluoreszent-Label Genom Wartungsfaktor beginnen (z. B., 53BP1-GFP, RPA32-GFP, etc.). Mit live-Imaging zur Mikro-Bestrahlungsbedingungen Optimierung ermöglicht dem Benutzer, schnell mehrere Parameter zu testen.
4. Einstellung Kinetik Analyse
- Installieren Sie die Microirradiation Analyse Plugin10 in Fidschi Bild Analyse Software11.
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Öffnen Sie die aufgenommenen Bilder in Fidschi. Wählen Sie "The Schaden Analyzer" aus dem Pulldown-Plugins-Menü in der Microirradiation Analyse-Suite. Folgen Sie die Anweisungen, um eine Hintergrund-Region von Interest (ROI) (in der Regel 3 x 3 µm) und nicht bestrahlt und bestrahlten ROIs in jeder Mikro-bestrahlten Zelle definieren.
- Verwendung ROIs gleicher Größe zu minimieren mögliche Verzerrungen in meine Signalintensitäten. Gehören Sie für importierte Bilder auch mindestens ein Pre-Bestrahlung-Frame die Rekrutierung an Mikro-bestrahlten Standorten zu überwachen als Grundlage verwendet werden.
- Sobald alle Daten der ROI über die volle Zeitraffer Serie gesammelt wurden, speichern Sie die Datei durch das Plugin enthält die Ergebnisse als Csv (Komma getrennte Datei) oder Txt Datei (Registerkarte "getrennt") erstellt. Diese Datei enthält die Messungen der mittleren Intensität für jeden Zeitpunkt und jeden ROI (meine Intensität Hintergrund, meine Intensität nicht bestrahlt, und meine Intensität bestrahlt).
Hinweis: Das Plugin automatisch subtrahiert die Hintergrundintensität (ichb) von der Intensität des bestrahlten ROIs (ichs) und die nicht bestrahlten ROIs (ichn). Es berechnet auch ein Verhältnis zwischen beiden Werten (siehe die folgende Formel) um für Immunofluoreszenz (Irradiated/Non-bestrahlt) zu korrigieren.
Das Plugin auch berechnet eine Normalisierung zwischen den ersten Zeitpunkt (Wert auf 1 gesetzt) und all den anderen Zeitpunkten für jeden Kern (Verhältnis relativ zum ersten Zeitpunkt). Weitere Informationen finden auf der Plugin-Webseite-10.
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Führen Sie die Analyse mit dem Plugin für alle Mikro-bestrahlten Zellen (mindestens 15 – 30) und darstellen Sie die mittlere relative Anreicherung am Mikro bestrahlten Regionen im Laufe der Zeit grafisch. Berechnen Sie die Standardfehler des Mittelwerts für jeden Punkt und Plotten sie.
- Bestätigen Sie Unterschiede in der Einstellung Kinetik zwischen zwei Versuchsbedingungen durch Ausführen des Schülers t-Tests für jeden Datenpunkt.
5. wenn Protokoll
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Bereiten Sie IF Lösungen. Pre/post-extraction Lösung vorbereiten (eiskalte 1 X PBS mit 0,25 % Triton x-100), Waschlösung (1 X PBS mit 0,05 % Tween-20), blockiert Lösung (1 X PBS mit 3 % BSA und 0,05 % Tween-20), und Fixierung Lösung (Paraformaldehyd 3 % + 2 % Saccharose mit PBS-Puffer 1 X) in konischen Polypropylenröhrchen.
Hinweis: Für eine einzelne 8-Brunnen-Objektträger werden 10 mL Pre/post-extraction-Lösung, 50 mL Lösung, blockierende Lösung 10 mL und 5 mL der Lösung Fixierung zu waschen benötigt.- Bereiten Sie die Fixierung-Lösung.
- Unter einer chemischen Haube mix 400 mL bidestilliertem Wasser (DdH2O) mit 15 g Paraformaldehyd und 30 µL 10 N NaOH in einem 1 L-Erlenmeyer-Kolben.
- Schließen Sie die Container und Wärme bei 65 ° C auf einer Herdplatte Magnetrührer unter Rühren auf die Paraformaldehyd vollständig zu lösen.
- Mit einer 25-mL-Pipette, 50 mL 10 X PBS, rühren und mit einem 0,45 µm-Filter Filter hinzugeben.
- 10 g Saccharose und komplett bis 500 mL mit DdH2O.
- Aliquoten die Lösung 15 mL konische Röhrchen; bei-20 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
- Bereiten Sie die Kerne Färbelösung durch Verdünnung der Stammlösung von 1 mg/mL von 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) 1:1,000 mit 1 X PBS-Puffer.
- Bereiten Sie die Fixierung-Lösung.
- Mit einer Mikropipette, entfernen Sie vorsichtig die Medien aus den Brunnen des Multi-gut Mikroskopie Folien oder Platten und sofort waschen mit 500 µL IF Waschlösung durch Ändern der Lösung zweimal ohne lange Wartezeiten.
Hinweis: Die hier vorgestellten Daten IF wurden unter Verwendung von Zellen, die in 8-Brunnen-Mikroskopie-Folien, die gewaschen und in 500 µL aller Lösungen inkubiert wurden angebaut. Mengen sollten je nach verwendeten von Experimentatoren Zelle-Kultur-Behälter angepasst werden. Darüber hinaus führen Sie die IF-Protokoll mit äußerster Sorgfalt wie Zellen aus Glas/Kunststoff unten leicht lösen können. Verwenden einer Mikropipette für alle Lösung Änderungen Zellverlust zu minimieren. - Inkubation auf Eis für 5 min mit 500 µL des eiskalten wenn Pre/post-extraction Lösung und Wirbel sanft mit der Hand für 15-30 s vor Extraktion durchführen, die Schritt die meisten zytoplasmatischen und nucleoplasmic Proteine entfernt und das Signal von Chromatin maximiert / DNA-assoziierte Faktoren.
- Zweimal mit 500 µL IF Waschlösung abwaschen.
- 15 min bei Raumtemperatur in 500 µL IF Fixierung Lösung inkubieren. Alternativ können Sie eine vorgefertigte Paraformaldehyd-Lösung (3 – 4 %) für die Fixierung Schritt.
- Zweimal mit 500 µL IF Waschlösung abwaschen.
- Brüten auf Eis für 5 min in 500 µL eiskalte IF Pre/post-extraction Lösung und schwenken Sie die Folie vorsichtig von Hand um die Permeabilisierung Schritt auszuführen.
- Zweimal mit 500 µL IF Waschlösung abwaschen.
- Inkubieren Sie mindestens 30 min bei Raumtemperatur mit 500 µL IF blockierende Lösung.
- Entfernen Sie blockierende Lösung mittels einer Mikropipette und inkubieren Sie über Nacht in eine feuchte Kammer bei 4 ° C mit 250 µL Primärantikörper in blocking-Lösung verdünnt.
Hinweis: Es empfiehlt sich, führen Sie die Inkubation mit primären Antikörper gegenüber dem Vorquartal um mögliche Artefakte der Co Lokalisierung zu vermeiden. Sobald entsprechende Kontrollen durchgeführt wurden, inkubieren Sie gleichzeitig Primärantikörper um den Prozess zu beschleunigen. - Vier Mal für 5 min in 500 µL IF Waschlösung mit sanften Agitation (60 Rpms auf ein Rotator) waschen.
- 1 h bei 37 ° C mit 250 µL Sekundärantikörper verdünnt in blockierende Lösung in eine feuchte Kammer inkubieren.
Hinweis: Schützen Sie die Proben vor Licht auf Zugabe von Eindringmittel-markierten Sekundärantikörper. - Waschen Sie vier Mal jeweils für 5 min in 500 µL IF Waschlösung mit sanften Agitation.
- Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min in 500 µL 1 X PBS mit 1 µg/mL DAPI, Kerne zu beflecken.
- Zweimal mit 500 µL 1 X PBS waschen Sie und lassen Sie Zellen in 500 µL 1 x PBS-Lösung für die Bildgebung.
- Mit gerasterten Folien oder registrierte Bühne Positionen, finden die Mikro-bestrahlten Zellen mit einem gut charakterisierten DNA-Schäden-Marker (z.B., γ-H2A.X, RPA32, etc.).
- Bild der Multi-gut Kultur Folien oder Platten in alle relevanten Kanäle mit den entsprechenden Einstellungen am konfokale Laserscanning-Mikroskop.
Hinweis: Auf dem vorgestellten System die Bildgebung erfolgte mit einem 63 X / 1,4 Öl-Objektive verwenden eine Verweilzeit 8 µs/Pixel, Auflösung 1.024 x 1.024, 1 X Zoom und Mittelung der 2. Beachten Sie, dass diese Parameter müssen für andere Systeme und/oder verschiedenen Experimenten optimiert werden können.
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Representative Results
Nach Mikro-Bestrahlung dürfen Zellen für einen bestimmten Zeitraum abhängig von der Art des Genoms Wartung Proteine1,12zu erholen. DSB werden bearbeitet von Nukleasen, weitgehend in den S und G2-Phasen des Zellzyklus, eine begrenzte Region SsDNA erstellen, die schnell von RPA und andere Genom Wartung Faktoren9beschichtet ist. SsDNA Region ist umgeben von Chromatin, die ausgiebig in der DDR, die Rekrutierung und Vermittlung von anderen DDR Faktoren13Regeln geändert wird. Protein-Rekrutierung, Mikro-bestrahlten Regionen von IF überwacht werden kann (Abbildung 1A). Chromatin-assoziierte Faktoren (z.B., γ-H2A.X, 53BP1, etc.) sind in der Regel bei älteren (1 – 5 min) nachweisbar Zeitpunkten als SsDNA-gebundene Proteine, da Nuklease-vermittelten Resektion des DSB Enden erforderlich ist, um die RPA-SsDNA-Plattform zu generieren (≥10 min.) Um Bildanalyse und Veröffentlichung zu erleichtern, haben wir uns ausgedacht, Fidschi Skript (The Outliner)10 die automatisch über einen DNA-Farbstoff-assoziierten Kanal (z.B.DAPI), Zellkerne skizziert erleichtert das Mikro-Bestrahlung zu unterscheiden Streifen und einzelnen Zellen durch das Weglassen uninformativ DNA-Färbung von der endgültigen Bilder unter Beibehaltung der nuklearen Definition (Abbildung 1 b).
Γ-H2A.X und RPA komplexe Untereinheiten dienen als Marker für Chromatin - und SsDNA-assoziierte Faktoren bzw.. RPA-SsDNA erscheint als punktförmige Herde umgeben von großen fluoreszierende Chromatin Streifen verziert durch die γ-H2A.X Antikörper (Abbildung 1). Co Lokalisierung mit dieser Marker kann verwendet werden, um die Position des Genoms Wartungsfaktoren an DNA-Läsionen genau zu definieren. Zum Beispiel lokalisiert Co 53BP1, ein Chromatin-assoziierten Protein steuert die DSB Reparatur Weg Wahl, auch mit der γ-H2A.X Signal13. Umgekehrt, PRP19, eine E3 Ubiquitin Ligase, dass Funktionen auf RPA-SsDNA ATR Aktivierung und DNA-Reparatur zu fördern wird eingestellt, als punktförmige Herde, die entsprechen die RPA32 Verteilung14,15,16,17 (Abbildung 1). Der Hinweis einige Faktoren können auch auf das Chromatin angrenzend an die erste Läsionen rekrutiert werden aber Verbreite keine zu große Domänen, die rund um die DSB wie γ-H2A.X und 53BP1. In solchen Fällen diese Faktoren würde als punktförmige Herde erscheinen aber würde nicht perfekt zusammen mit SsDNA-gebundene Proteine lokalisiert.
Für live Cell imaging, Zellen mit dem Ausdruck eines POIs mit einer fluoreszierenden Marker gekennzeichnet werden kann detaillierte Mikro bestrahlt und in Echtzeit abgebildet um hoch zu erhalten Rekrutierung Kinetik (Abbildung 2A–C). Mehrere verschiedene Proteine können gleichzeitig beobachtet werden, vorausgesetzt, dass ihre Fluoreszenzmarkierungen spektral voneinander getrennt werden können. Zur Analyse von Zeitreihen zu erleichtern, haben wir zwei Fidschi Skripte erstellt ermöglicht den Benutzer zu Filmdateien mit Zeitreihen Informationen (Movie Maker, siehe Filme von Abbildung 2 als Online-Zusatzmaterial) zu produzieren und zu quantifizieren, protein Recruitment bei Mikro-bestrahlten Standorten (Schaden Analyzer)10. Statt die zeitraubende manuelle Bild-Kuration normalerweise erforderlich, um das Verhalten eines Proteins zu beschreiben führt das Schaden-Analyzer-Skript den Anwender durch optimierte Schritte die Signal Bereicherung an Mikro-bestrahlten Standorten, während automatisch überwachen Korrektur der Zellbewegung, jederzeit Bild Drift, Hintergrundsignal und bleichen Punkte des Experiments. Die generierten Daten können dann leicht in einer Tabellenkalkulationsanwendung kompiliert und als erforderlich (Abb. 2D) dargestellt.
Abbildung 1: Lokalisierung des Genoms Wartung Faktoren auf das Chromatin und RPA-SsDNA Plattformen am Mikro-Bestrahlung-induzierte Läsionen. (A) Mikro-Laserbestrahlung bei bereits sensibilisierten Zellen führt zu die Produktion von DNA-Doppelstrang-Brüchen, die von Endo und Exo-Nukleasen SsDNA generieren reseziert werden. Das SsDNA Sub Fach kann als punktförmige Herde mit Antikörpern gegen Replikation Protein A oder anderem SsDNA lokalisiert visualisiert werden. Im Gegensatz dazu erscheinen Proteine oder Modifikationen, die verteilt auf große Chromatin Domains als breiten Streifen an der Mikro bestrahlten Stelle ähnlich dem Muster beobachtet mit Antikörpern, die Ausrichtung der phosphorylierten Histon-Variante H2A. X (Γ-H2A.X). (B) Zellen sensibilisiert Pre mit BBET oder BrdU wurden Mikro-bestrahlt, bereits extrahierten feste und für die angegebenen Proteine gefärbt. 12-Bit-Bilder wurden bei 1 X Zoom gesammelt und verarbeitet, mit dem Outliner Fidschi-Skript. (C) Z-Stapeln von BBET oder BrdU bereits sensibilisierten Zellen ermöglicht die Auflösung von SsDNA - und Chromatin-assoziierte Faktoren (maximale Intensität Z-Projektion gezeigt). (D) mit dieser Methode, 53BP1 und PRP19 als Chromatin und SsDNA verbundenen Genom Wartungsfaktoren, bzw. eingestuft werden können. Skalieren von Balken = 10 µm; Bilder in D sind alle im selben Maßstab. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Live-Darstellung der RPA komplexe Einstellung auf Seiten von DNA-Schäden. (A) stabil oder transiente Transfektion von Plasmiden Codierung Kandidat Proteine getaggt mit fluoreszierenden Reporter gefolgt von Mikro-Bestrahlung von transfizierten Zellen ermöglicht die Überwachung von Protein Anwerbung für DNA-Läsionen in Echtzeit. (B) Zellen wurden mit einer pDEST47-RPA32-GFP-Plasmid transfiziert und lysiert 24 h später. Protein-Expression wurde durch Immunoblotting bestätigt. (C) Zellen mit pDEST-SFB EGFP transfiziert oder pDEST47 RPA32-GFP Plasmide Pre mit BrdU sensibilisiert wurden Mikro-bestrahlt, abgebildet bei 12-Bit auf 1 X Zoom einmal pro Minute nach Bestrahlung. Timing ist in Minuten nach Bestrahlung. 00:00 Zeitpunkt Bild wurde vor dem Mikro-Bestrahlung übernommen. Filmdateien wurden erstellt mit dem Movie Maker Fidschi-Skript und Keyframes angezeigt. Skalieren von Balken = 10 µm. (D) Einstellung der RPA32-GFP zu Mikro-Bestrahlung Streifen wurde quantitativ überwacht mit dem Schaden Analyzer Fidschi-Skript. Output-Daten wurden mithilfe von Microsoft Excel geplottet. Die schwarze Linie ist die mittlere Bereicherung-Falte des RPA32-GFP an Mikro-bestrahlten Standorten bezogen auf das Pre-Bestrahlung-Signal und die Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler des Mittelwerts 15 unabhängig Mikro bestrahlten Zellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Movie 1: Micro-Bestrahlung Zeitraffer der SFB-GLP mit dem Ausdruck ihrer Zellen. Zellen, die vorübergehend mit einer pDEST-SFB GFP Plasmid transfiziert wurden bereits sensibilisierten 24 h mit BrdU, Mikro-bestrahlt und abgebildeten einmal pro Minute 29 Min. Klicken Sie bitte hier, um diesen Film downloaden.
Movie 2: Mikro-Bestrahlung Zeitraffer RPA32-GLP mit dem Ausdruck ihrer Zellen. Zellen, die vorübergehend mit einer pDEST47-RPA32-GFP-Plasmid transfiziert wurden bereits sensibilisierten 24 h mit BrdU, Mikro-bestrahlt und abgebildeten einmal pro Minute 29 Min. Klicken Sie bitte hier, um diesen Film downloaden.
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Discussion
Verwenden die oben beschriebenen Methoden, ermöglicht 405 nm Laser Mikro-Bestrahlung von Zellen mit BBET oder BrdU bereits sensibilisiert die lokalisierte Erzeugung von DNA-Läsionen einschließlich der DSB in den Kernen der anhaftende menschliche Zellen. Kinetik der DDR bei diesen DSB ähneln denen generiert mit anderen Methoden in eukaryotischen Zellen9,18,19. DSB-Resektion an Mikro-bestrahlten Standorten führt zu SsDNA-Generation, die mit einer RPA32 gezielt Antikörper oder eine RPA32-GFP Fusion verfolgt werden kann. Chromatin-assoziierte Faktoren können auf der anderen Seite mit γ-H2A.X als Referenz befinden. Einige Chromatin-assoziierte Faktoren können nicht soviel wie γ-H2A.X Weg von der ersten DSB verteilt und erscheint als punktförmige Herde, die von SsDNA-Bindeproteine Schwerpunkte unterscheiden können.
Sobald DSB generiert werden, können Protein Rekrutierung und Genehmigungen durch Schaden Websites von IF auf festen Zellen überwacht werden. Diese Experimente erfordert nur einen geeigneten IF Antikörper gegen die POI. Wenn IF-kompatiblen Antikörper nicht verfügbar sind, Plasmide können konstruiert werden mit Genen von Interesse im Rahmen mit spezifische Epitope (z.B.: Flagge, His-Tag) oder fluoreszierende Proteine. Transiente und stabile Transfektion/Transduktion von diese Plasmide in adhärenten Zellen können dann verwendet werden, um festzustellen, ob ein bestimmten Faktor aktiv rekrutiert wird, beschädigt DNA. Überexpression von Proteinen kann zu MIS Lokalisierung führen und kann ihre Einstellung zu Mikro-bestrahlt Streifen künstlich zu erhöhen. Um Ergebnisse zu erzielen, die mehr repräsentativ für körpereigene Proteine, kann CRISPR-Cas9 Technologie jetzt routinemäßig eingesetzt werden, um jedes Gen des Interesses mit geeigneten Epitope20,21tag.
Die Python-Skripten zur Verfügung gestellt in der Mikro-Bestrahlung Analyse Fidschi Plugin erleichtern, Visualisierung, Präsentation, Publikation und Analyse der DDR Proteine Kinetik. Dieses Analysepaket ist Open-Source und Funktionen unabhängig von der Mikroskop-Plattform verwendet, um Mikro-Bestrahlung Experimente und Bildaufnahme durchzuführen. Alles was benötigt wird ist, dass die Aufnahmen auf der Mikroskopie-Plattform als Bio-Formaten kompatibel22Bilder gespeichert werden. Seit Hintergrund driften und bleichen Korrekturen erfolgen automatisch, Analyse von Protein-Ebene an DNA-Schäden Standorten mit den mitgelieferten Skripten ist unkompliziert und sehr schnell im Vergleich zu den typischen manuelle Signal Quantifizierung durchgeführt mit Mikroskop-Bild-Datenerfassungs-Software.
Wie im Protokoll beschrieben, Benutzer müssen sorgfältig konfigurieren, ihre jeweiligen Laserscanning confocal Mikroskop-Systeme um die entsprechende Menge an Schaden und induzieren DSB, die normalen DDR-Kinetik zu folgen. In der Tat hängt die Menge und Art der DNA-Läsionen erzeugt durch Mikro-Bestrahlung auf die Wellenlänge des Lasers und die Dosis sowie die Pre-Sensibilisierung-Methoden. Benutzer müssen im Hinterkopf behalten, dass obwohl DSB durch den hier beschriebenen Bedingungen entstehen, 405 nm Laser Mikro-Bestrahlung von photosensitized Zellen auch eine Mischung aus anderen DNA-Läsionen, einschließlich Cyclopyrimidine Dimere (CPDs) SSBs, generieren und oxidiert Grundlagen, die zwischen Mikroskopsystemen und Einstellungen23,24,25, variieren. Daher muss eine sorgfältige Überwachung der Läsionen an Mikro-bestrahlten Standorten durchgeführt werden, um ein umfassendes Bild des Schadens generiert und die Reaktion hervorgerufen zu erhalten. Wichtig ist, sollte um die Beantwortung der DSB zu studieren, jedes Mikroskopsystem durch die Überwachung der Kinetik der kanonischen DNA-Schäden-Proteine und post-translationalen Modifikationen an Mikro-bestrahlten Standorten optimiert werden. Z. B. γ-H2A.X und die RPA komplexe Untereinheiten (RPA70, RPA32 oder RPA14) verwendet werden können schnell und bequem, wie sie ganz einfach zu erkennen sind bei DSB ansammeln. Als eine Faustregel sollte γ-H2A.X Signal als Streifen am Anfang (5 min) sichtbar gemacht werden und spät (bis zu 3 – 4 h) Zeit weist nach dem Schaden während RPA als punktförmige Herde sammeln beginnen sollte ca. 10-15 min post-micro-Bestrahlung. Wenn ein Pan-nuklearen γ-H2A.X Signal zu beobachten ist, die Menge an Energie, die von den Zellen empfangen ist physiologisch und führt zum raschen Zelltod.
Es gibt einige Einschränkungen, die bei 405 nm Laser für die Untersuchung der spezifischen DNA-Reparatur-Wege mit berücksichtigt werden müssen. Zum Beispiel obwohl BBET-405 nm Kombination leicht eine Kombination von SSBs und DSB produziert, es erzeugt keine 6-4 Photoproducts (6-4 PPs) und infolgedessen die Kinetik der Rekrutierung von Nukleotid-Exzision-Reparatur-Proteine sind anders als die mit UV-C Mikro-Bestrahlung beobachtet. Die Kinetik und das Ausmaß der Rekrutierung von verschiedenen Proteinen, die in der Antwort an DSB können auch je nach der DNA Beschädigung Methode, das verwendete23wird. Aufgrund dieser Veränderungen empfehlen wir, dass Benutzer anpassen ihrer Systeme, um die Art der Läsionen zu maximieren, die möglicherweise durch ihre POIs erkannt werden. Obwohl solche Systeme weniger breit verfügbar sind, verwenden Sie andere Arten von Laser inklusive UV-A (337-355 nm) oder Femtosekunden Nah-Infrarot (800 nm) zusammen mit verschiedenen Sensibilisierung Reagenzien (z. B.: Tri-Methyl Psoralen) können Benutzern erlauben, mehr erzeugen spezifische DNA-Läsionen abhängig von der DNA Reparatur Wege unter Studie24,26.
Wann immer neue Bedingungen getestet werden, ist es bequem zu bedienen Eindringmittel beschriftet etablierten DNA-Reparatur-Proteine, Dosen, Wellenlängen und Pre-sensibilisierend Kombinationen zu testen und sicherzustellen, dass die Läsion des Interesses effizient erzeugt wird. Z. B. PARP1 und XRCC1 kann als Marker für SSB und Base Excision Repair Funktion XPA ist ein guter Indikator der Nucleotide Excision Repair und 53BP1 werden rekrutiert werden, DSB und Funktion in nicht-homologe Ende-Beitritt (Referenzen23,25 ,27,28). Antikörper, die erkennen, dass Änderungen verbunden mit bestimmten Arten von DNA-Schäden auch verwendet werden können, um das Niveau der DNA zu quantifizieren Addukte oder bricht. Es ist somit möglich, oxidierte Basen, Cyclopyrimidine Dimere 6-4 PPs, SSBs (mit Poly-ADP-Ribose-Antikörper) und DSB (γ-H2A.X und 53BP1) if zu überwachen und bestimmen die Parameter, die die gewünschte Läsionen23, auf höchste Niveau zu erreichen, wird 27 , 29. mit sorgfältige Überwachung, Benutzer sollten in der Lage, ihre Reparatur Weg mit Mikro-Bestrahlung zu studieren sein.
Insgesamt, die Verwendung von weit verbreiteten Laserscanning-konfokale Mikroskope mit 405 nm Laser-Linien ausgestattet, um lokalisierte DSB generieren kombiniert mit Plattform-spezifischen DNA-Schäden Markern Genom Wartungsfaktoren und optimierte Daten Sub zu klassifizieren Verarbeitung mit Hilfe von Mikro-Bestrahlung Analyse Fidschi Plugin, sollte die Untersuchung der DDR Faktoren Dynamik leichter zugänglich als je zuvor zu beiden erlebt und Anfänger Ermittler des Feldes Genom Wartung machen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada [Discovery Grant 5026 bis Uhr] und eine nächste Generation von Wissenschaftlern Stipendium von der Cancer Research Society [21531 bis Uhr] unterstützt. Wir danken Jean-François Lucier bietet hervorragende Qualitätskontrolle der Fidschi-Python-Skripten und Ratschläge zur statistischen Analyse. Wir danken Dr. Stephanie A. Yazinski für IF Fixierung Lösung Rezept. Wir danken Paul-Ludovic Karsenti für Hilfe bei Lasermessungen macht.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope | Olympus | ||
| FluoView FV3000 software (version 2.1) | Olympus | ||
| 405 nm laser | Coherent | Radiation source | |
| Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 | Okolab | OKO-UNO-1 | |
| 60X /1.4 Objective | Olympus | Oil immersion objective | |
| 8-well culture slides on coverglass (X-well) | Sarstedt | 94.6190.802 | |
| U2OS osteosarcoma human cell line | ATCC | HTB-96 | Stable cell lines |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | Caution toxic |
| 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | 59-14-3 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Caution toxic |
| Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | ThermoFisher | 62249 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher | BP1600-100 | |
| Trypsin EDTA 0.1% | ThermoFisher | 15400-054 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX777.100 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | BP337-500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| JetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI | ThermoFisher | P36962 | |
| DMEM 1X, + phenol red | Wisent | 319-005-CL | |
| DMEM 1X, - phenol red | Wisent | 319-051-CL | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Mouse anti-RPA32 antibody | Abcam | ab2175 | 1:500 for IF |
| Rabbit anti-γ-H2A.X antibody | Cell Signaling | 9718S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-53BP1 antibody | Cell Signaling | 4937S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-PRP19 antibody | Abcam | ab27692 | 1:500 for IF |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 | Cell Signaling | 4414S | 1:250 for IF |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling | 4408S | 1:250 for IF |
| Fiji image analysis open-source software | https://fiji.sc | ||
| 1918-K Power meter with a 918D-SL-0D3 sensor | Newport |
References
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).
- Limoli, A. C. L., Ward, J. F., May, N. A New Method for Introducing Double-Strand Breaks into Cellular DNA. Radiation Research. 134 (2), 160-169 (1993).
- Polo, S. E., Jackson, S. P. Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. Genes & development. 25 (5), 409-433 (2011).
- Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nature cell biology. 5 (3), 255-260 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Collins, T. J.
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual review of genetics. 45, 247-271 (2011).
- Garneau, D., Maréchal, A. Microirradiation Analysis Fiji Plugin. , Available from: https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/ (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Reports. 11 (9), 1-15 (2015).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2013).
- Maréchal, A., et al. PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry. Molecular Cell. 53 (2), 235-246 (2014).
- Dubois, J. -C., et al. A phosphorylation-and-ubiquitylation circuitry driving ATR activation and homologous recombination. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8859-8872 (2017).
- Wan, L., Huang, J. The PSO4 Complex Associates with RPA and Modulates the Activation of ATR. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6619-6626 (2014).
- Abbas, M., Shanmugam, I., Bsaili, M., Hromas, R., Shaheen, M. The role of the human Psoralen 4 (hPso4) complex in replication stress and homologous recombination. The Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 14009-14019 (2014).
- Chung, W. H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting. PLoS Genetics. 6 (5), (2010).
- Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
- Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5 (9592), (2015).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Dinant, C., et al. Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods. Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).
- Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 37 (9), e68 (2009).
- Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
- Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).
- Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. Chemical proteomics reveals a γH2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response. Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).
- Soultanakis, R. P., et al. Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy. Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).
