Summary
Изучение кинетики ремонт повреждений ДНК требует системы побудить поражений в определенных регионах югу ядерного. Мы описываем метод для создания локализованных двуцепочечные разрывы, с помощью лазерного сканирования Конфокальный микроскоп оснащен 405 нм лазер и автоматизированных процедур для количественного определения динамики ремонт факторов на этих поражений.
Abstract
Ответ повреждения ДНК (РДР) использует множество белков для обнаружения, сигнал и ремонт повреждений ДНК. Разграничения этот ответ имеет решающее значение для понимания механизмов обслуживания генома. Так как набора и обмен белков в поражения высокой динамичностью, их исследование требует способность генерировать повреждения ДНК в основе быстрого и пространственно запятыми. Здесь мы описываем процедуры локально вызвать повреждения ДНК в клетках человеческого организма с помощью обычно доступных лазерное сканирование Конфокальный микроскоп оборудованы с линией лазера 405 нм. Накопление генома обслуживания, которую можно оценить факторы, лазерным полосы иммунофлюоресценции (IF) или в режиме реального времени с помощью белков, отмеченных флуоресцентные журналистам. Использование фосфорилированных гистона Н2А. X (γ-H2A.X) и репликации белка (РПА) как маркеры, метод обеспечивает достаточное разрешение подвергать набранных факторы от тех, которые распространяются на соседние хроматина. Мы далее предлагаем ImageJ скриптам эффективно контролировать кинетика relocalization белка в ДНК повреждения сайтов. Эти усовершенствования значительно упростить изучение динамики DDR.
Introduction
Клетки постоянно подвергаются эндогенных и экзогенных источники повреждения ДНК, которые угрожают их геномной целостности. DDR-ансамбль сигнальные пути, которые обнаружить, сигнал и ремонт повреждений ДНК для поддержания стабильности генома. В разрывы двуцепочечной ДНК (DSBs), РДР происходит главным образом на двух взаимодополняющих платформ: γ-H2A.X-меченых хроматина и резекции одноцепочечной ДНК (ssDNA) регион обычно покрытием с1,комплекс РПА ssDNA binding,2.
УФ лазер микро облучения клеток, предварительно сенсибилизированных с тимидина аналоговых 5-бром-2' дезоксиуридина (BrdU) или trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) ДНК bisbenzimide ethoxide краска создает смесь поражения ДНК одноцепочечной перерывы (включая Рабочего тормоза РСРТ) и DSBs, которые вызывают локализованных DDR на хроматина и ssDNA платформ3,4. Предыдущие работы показал, что набор факторов поддержания генома для этих двух различных платформ в ДГЖД могут подвергаться с использованием высокой энергии UV-A лазеров (335-365 Нм) в сочетании с если2,5. Микроскопы, оборудованы такие лазеры являются дорогостоящим, поскольку они требуют высокой энергии лазера и посвященный UV-A передачи целей делает их гораздо менее распространены в научных и фармацевтических параметров, чем сканирование лазерного конфокального микроскопов с 405 нм лазер линии. Исследование протеина набора и обмен на микро облучении сайтов также исключается путем анализа трудоемкий ручной изображения, необходимые для описания динамического поведения факторов поддержания генома.
Здесь мы покажем, что предварительное информирование клеток с BrdU или BBET пятен нуклеиновой кислоты после микро облучения с помощью 405 нм лазер на общей Конфокальный микроскоп позволяет осуществлять мониторинг динамики фактор поддержания генома в ДНК повреждения. Γ-H2A.X или комплекс подразделений пар как маркеры платформы вместе с z укладка для большей глубины резкости и деконволюция для улучшения разрешения позволяет экспериментатор различать факторы, которые набираются на местной DSBs от тех, которые распространяются на большие хроматина домены вокруг первоначального очага поражения. Этот подпункт классификация отдельных отсеков внутри ядерной помогает уточнить потенциальной роли uncharacterized белков, набранных для микро облучении сайтов. Кроме того мы предоставляем удобный протоколы и оптимизированы трубопроводов быстро анализировать динамику факторов поддержания генома используя программное обеспечение open-source Фиджи (распределение ImageJ)6,7,8. Эти уточнения нынешних методов микро облучения оказывают исследования РДР можно практически в любых условиях лаборатории.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Предварительное информирование клеток
- за 24 часа до микро облучения эксперимент, семян 40 000 ячеек U2OS на скважину в 1 x DMEM содержащий 10% FBS в культуре 8-Ну слайды с 170 мкм толщиной coverslip как стекло/полимерных днища обеспечить максимальное пропускание 405 нм лазерного света и отличные изображения с лазерное сканирование Перевернутый конфокального микроскопа. При использовании 8-Ну микрослайдовому, используйте 500 мкл СМИ или решения на хорошо для всех последующих процедур и мыть действия протокола.
Примечание: Из-за их плоские морфологии, хорошая адгезия и крупными ядрами, U2OS клетки облегчить обнаружение белка вербовки на микро облучении сайтов, но при необходимости могут применяться другие типы адэрентных клеток. Клетки в идеале должен быть около 80% confluency в то время микро-облучения увеличить количество облученных клеток на эксперимент. Очень высокая слияния может привести к изменения клеточного цикла, которые могут повлиять конкретные ремонт путей таких как гомологичных рекомбинации, которая происходит во время S и G2 фазы клеточного цикла9. - Инкубировать клетки на ночь при 37 ° C с 5% CO2, а затем предварительного информирования клетки с (шаг 1.3) BrdU или (шаг 1.4) BBET (Hoechst 33342).
Примечание: Наблюдать за живой набор протеина интереса (POI) для поражения ДНК, transfect или передают плазмида ДНК, перевозящих слияние между флуоресцентный белок и POI 24 ч после заполнения ячейки. 24 ч после-transfection/трансдукции, предварительного информирования и микро облучить клетки для мониторинга набора POI в местах повреждения ДНК в режиме реального времени. - Чтобы увеличить количество DSBs порожденных экспозиция 405 нм лазер, добавьте 10 мкм BrdU в СМИ за 24 часа до микро облучения. До микро облучения, используя микропипеткой промойте клетки дважды с среднего без фенола Красного для обеспечения максимального воздействия на клетки 405 нм лазер.
- Кроме того обработать клетки на 15 мин с BBET на 10 мкг/мл в соответствующей среде в культуре клеток инкубатора 37 ° c. После лечения промойте дважды среднего без фенола красного до микро облучения.
2. микро облучение клеток
- Выберите подходящий сканирование лазерного конфокального микроскопа.
Примечание: В системе микроскопа с 50 МВт 405 нм лазер линию и цель нефти числовая апертура 63 X 1.4 были проведены эксперименты, представленные здесь. Чтобы создать DSBs, клетки были микро облученных в 1 X зум сканирования на 1 024 x 1 024 пикселей/поле (0,21 мкм/пиксель на 63 кратном) и режиме однонаправленной на 8 МКС/пиксель. Мощность лазера используется был 25% и 80% для BBET и BrdU-pre сенсибилизированных клеток, соответственно. Чтобы помочь пользователям настраивать свои системы, мощность после цель лазера на представленной системы была измерена с помощью измерителя мощности согласно инструкциям производителя. Размеры соответствуют 2,6 МВт и 7,0 МВт для BBET и BrdU-pre сенсибилизированных клеток, соответственно. -
Включите микроскоп и экологической палаты.
- Установка камеры до 37 ° C с 5% CO2 прежде чем образцы помещаются в сцене инкубатор избежать ненужного стресса в клетки и для обеспечения однородной DDR кинетики экспериментов.
-
Выберите поля с четко распределенными клетки, настроить фокус и зарегистрировать их положение, чтобы облегчить получение изображения после если протокол. Приобрести по крайней мере одно изображение, которое будет служить в качестве точки отсчета до повреждения для мониторинга кинетики набора белка после микро облучения.
Примечание: Сетчатая культура судов также может использоваться для облегчения локализации микро облученных клеток в последующих шагах.- Для если эксперименты с использованием BBET-меченых клетки Отрегулируйте фокус на клетки с помощью 405 нм лазер на минимальной мощности лазера достаточно, чтобы визуализировать клетки для того чтобы избежать неоправданной повреждения ДНК.
- Избегайте использования widefield флуоресценции для регулировки акцент на BBET-окрашенных клеток как УФ света лампа будет вызывать повреждения ДНК в освещенных местах.
- При использовании BrdU меченых клетки, Отрегулируйте фокус с помощью дифференциальной помехи контраст (DIC) или фазово контрастной визуализации, глядя на югу ядерных функций, таких как ядрышек.
- Если с использованием клеток, выражая дневно меченых POIs, выберите фокальной плоскости с интенсивностью представитель флуоресценции.
Примечание: Избегайте клетки, которые выражают очень высокий уровень POI, как сильный гиперэкспрессия может привести к артефакты локализации. Кроме того выделите ячейки, которые выражают POI на сопоставимых уровнях (выбор стабильных клонов настоятельно рекомендуется свести к минимуму изменения в уровнях выражения и набора POI).
- Для если эксперименты с использованием BBET-меченых клетки Отрегулируйте фокус на клетки с помощью 405 нм лазер на минимальной мощности лазера достаточно, чтобы визуализировать клетки для того чтобы избежать неоправданной повреждения ДНК.
- Настройте микроскоп для микро облучения шаг, используя флуоресценции восстановления после _module Фотообесцвечивание (FRAP) системы.
Примечание: Наиболее важные параметры для рассмотрения когда настройка системы микроскопа для микро облучения эксперименты являются: Выходная мощность лазера 405 нм, количество итераций (то есть, количество раз, лазер будет идти за те же координаты), количество пикселей/поле (на 63 X увеличение и 1024 x 1024 резолюции, 1 пиксел = 0,21 мкм) и время нахождения на пиксель. Все эти факторы будут влиять на количество энергии, что опыт клетки и таким образом количество и тип ДНК повреждения сгенерированный (см. обсуждение дополнительной дозы оптимизации информации). - С помощью модуля FRAP Микроскоп системы, микро облучить клетки.
Примечание: На большинстве систем, микро облучения нескольких ячеек могут быть выполнены в одном поле как пятна или линии/прямоугольники (обычно 1-2 мкм). При выполнении жить изображений дневно меченых белков сразу после повреждения, ограничить микро облучения на небольшое количество клеток на поле, потому что время, затраченное на микро облучить каждой ячейке приведет к задержки индукции РДР. Это особенно важно, когда мониторинг белки, которые очень быстро набираются для поражения ДНК. -
После микро облучения, положил обратно несколькими хорошо слайды или пластины в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO2 на требуемый срок до обработки образцов для если (раздел 5) или немедленно приступить к жить изображений (раздел 3).
- В качестве первого шага исправьте клетки в течение нескольких минут и до нескольких часов после облучения для протокола, если. В зависимости от POI кинетики набора может меняться. Как правило белки, которые хроматина, связанные в DSBs и рабочего тормоза РСРТ будет очень быстро локализовать для поражения и иногда удаляются в течение 5 мин. Некоторые факторы, такие, как те, которые собирают в ssDNA будут набраны в позднее время точках после резекции машины занимается и остаются там для часов (см. рис. 1 и ссылка4).
3. жить изображения дневно обозначенных белков
- Выполняйте покадровый изображений микро облученных клеток. Для белков, которые очень быстро набираются для поражения, через несколько секунд на кадр будет идеальным, но для белков, которые локализовать к поврежденной области позже (например, резекция факторы), приобретение может быть происходит каждые 1 – 2 мин до достижения плато.
Примечание: Минимизации мощности лазера для захвата изображений во избежание обесцвечивания как можно больше и обеспечить, что набор белков в местах повреждения не достиг насыщения, которое исключало бы сигнал количественной оценки и последующего анализа (см. анализ данных Раздел 4). На системе представленных изображений было сделано с 63 X / 1.4 масло объективных с помощью продолжительность 8 МКС/пикселей, 1024 x 1024 резолюции, 1 X зум и в среднем 2. Обратите внимание, что эти параметры могут быть оптимизированы для других систем и/или различных экспериментов. - Микро облучить клетки в дополнительные поля до кинетика измерения получаются для 15-30 ячеек. Повторите эксперименты по крайней мере 3 раза в биологических репликация для обеспечения точности и воспроизводимости кинетики набора.
Примечание: При адаптации этот протокол к определенной конфокальный системы, это может быть полезно начать путем наблюдения за кинетики набора коэффициент обслуживания известный дневно меченых генома (например, 53BP1-GFP, RPA32-GFP и т.д.). Использование live изображений для оптимизации условий микро облучения позволит пользователю быстро проверить несколько параметров.
4. Вербовка анализ кинетики
- Установите плагин Microirradiation анализ10 в Фиджи изображение анализа программного обеспечения11.
-
Откройте приобретенные изображения в Фиджи. Выберите «Ущерб анализатор» из меню раскрывающемся плагинов в наборе Microirradiation анализа. Следуйте указаниям для определения фона региона интерес (ROI) (обычно 3 x 3 мкм) и необлученных и облученного ROIs в каждой ячейке микро облученных.
- Использование ROIs одинакового размера для сведения к минимуму потенциальных перекосов в означают интенсивности сигнала. Для изображений также включают в себя по крайней мере один кадр предварительного облучения, который будет использоваться в качестве базовых для наблюдения за вербовку на микро облучении сайтов.
- После того, как были собраны все данные ROI над полным покадровой серии, сохраните файл, созданный модуль, содержащий результаты как csv (разделители-запятые-файл) или txt файл (с разделителями табуляции). Этот файл содержит измерения средней интенсивности для каждой точки время и каждый ROI (означает интенсивность фона, означают интенсивности необлученных и означает интенсивностью облученного).
Примечание: Плагин автоматически вычитает интенсивность фона (яб) от интенсивности облученного трансформирования (яs) и необлученных трансформирования (яn). Она также вычисляет отношение между оба значения (см. Приведенная ниже формула) исправить для Фотообесцвечивание (Irradiated/Non облученных).
Плагин также вычисляет нормализации между точкой первый раз (значение 1) и все другие моменты времени для каждого ядра (отношение по отношению к первой точке времени). Дополнительную информацию можно найти на веб-сайте плагин10.
-
Выполнять анализ, используя плагин для всех микро облученных клеток (по крайней мере 15-30) и Диаграмма Средняя относительная обогащения на микро облученных регионах со временем. Рассчитайте стандартные ошибки означают для каждого данных точки и участок их.
- Подтвердить различия в наборе кинетики между двух экспериментальных условиях, выполняя студента t-тесты для каждой точки данных.
5. Если протокол
-
Подготовьте если решения. Приготовляют раствор pre/после-extraction (ледяной ПБС, содержащие 0,25% Тритон X-100), моющего раствора (ПБС, содержащие 0,05% Tween-20), преграждая разрешение (ПБС, содержащие 3% BSA и 0,05% Tween-20) и фиксации решение (параформальдегида 3% + 2% сахарозы в PBS 1 x) в конической полипропиленовые трубы.
Примечание: Для одного микрослайдовому 8-а, 10 мл раствора pre/после-extraction, 50 мл моющего раствора, 10 мл раствора блокировки и 5 мл раствора фиксации не требуется.- Приготовляют раствор фиксации.
- Под капотом химического смешайте с 15 g параформальдегида и 30 мкл 10 N NaOH в колбу Эрленмейера 1 Л 400 мл двойной дистиллированной воды (ddH2O).
- Закройте контейнер и тепла при 65 ° C на горячей плите магнитной мешалкой помешивая, чтобы солюбилизировать последнего параформальдегида полностью.
- С помощью пипетки 25 мл, добавьте 50 мл 10 X PBS, перемешать и фильтр с помощью фильтра 0.45 мкм.
- Добавить 10 г сахарозы и завершить до 500 мл с ddH2O.
- Алиготе решение в 15 мл конические трубы; хранить при температуре от-20 ° C до использования.
- Подготовка ядер, окрашивание раствора путем разбавления Стоковый раствор 1 мг/мл 1:1,000 (DAPI) 4,6-Diamidino-2-phenylindole в однократном ПБС.
- Приготовляют раствор фиксации.
- С помощью микропипеткой, тщательно удалить медиафайл из скважин нескольких хорошо микроскопии слайды или пластин и немедленно промойте 500 мкл если моющего раствора, изменив решение дважды без ожидания.
Примечание: Если данные, представленные здесь были получены с использованием клеток, выращиваемых в 8-Ну микроскопии слайды, которые были вымыты и инкубировали в 500 мкл всех решений. Тома должна быть скорректирована в зависимости от клетки культуры контейнеры, используемые экспериментаторов. Кроме того выполните если протокол с крайней осторожностью, как клетки можно легко отсоединить от дна стекла/полимерных. Используйте микропипеткой для всех изменений, решение свести к минимуму потери клеток. - Инкубируйте на льду за 5 мин с 500 мкл ледяной если pre/после-extraction решения и вихрем аккуратно от руки для 15-30 s для выполнения предварительного извлечения шаг, который удаляет наиболее цитоплазматический и nucleoplasmic белков и максимизирует сигнал от хроматина / Факторы, связанные с ДНК.
- Мыть два раза с 500 мкл если моющего раствора.
- Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре в 500 мкл раствора Если фиксации. В качестве альтернативы используйте готовые параформальдегида решение (3 – 4%) для фиксации шаг.
- Мыть два раза с 500 мкл если моющего раствора.
- Инкубируйте на льду в течение 5 мин в 500 мкл раствора ледяной если pre/после-extraction и вихрем слайд аккуратно от руки для выполнения permeabilization шаг.
- Мыть два раза с 500 мкл если моющего раствора.
- Инкубируйте по крайней мере 30 минут при комнатной температуре с 500 мкл если блокирования решения.
- Удалять блокирующие решение с использованием микропипеткой и инкубировать на ночь в увлажненные камере при температуре 4 ° C с 250 мкл первичного антитела разводят в преграждая разрешение.
Примечание: Это хорошая практика для выполнения инкубации с первичного антитела последовательно, чтобы избежать возможных артефактов Сопредседатель локализации. После того, как были выполнены соответствующие элементы управления, одновременно Инкубируйте первичного антитела, чтобы ускорить этот процесс. - Мойте четыре раза по 5 минут в 500 мкл если моющего раствора с нежным агитации (60 RPM на вращателе).
- Инкубируйте 1 час при 37 ° C с 250 мкл вторичных антител, разбавленный блокирования решения в камере увлажненной.
Примечание: Защищайте образцы от света при добавлении дневно меченых вторичных антител. - Вымойте четыре раза каждый 5 минут в 500 мкл если моющего раствора с нежным агитации.
- Инкубации при комнатной температуре за 5 мин в 500 мкл ПБС, содержащие 1 мкг/мл DAPI пятно ядер.
- Мыть два раза с 500 мкл ПБС и оставить клетки в 500 мкл 1 x PBS решение для визуализации.
- С помощью сетчатая слайды или зарегистрированные стадии позиции, найти микро облученных клеток с помощью хорошо изученных маркеров повреждения ДНК (например, γ-H2A.X, RPA32, и т.д.).
- Изображения нескольких хорошо культуры слайды или пластины во всех соответствующих каналах, используя соответствующие настройки на сканирование лазерного конфокального микроскопа.
Примечание: На системе представленных изображений было сделано с 63 X / 1.4 масло объективных с помощью продолжительность 8 МКС/пикселей, 1024 x 1024 резолюции, 1 X зум и в среднем 2. Обратите внимание, что эти параметры могут быть оптимизированы для других систем и/или различных экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После микро облучения клетки могут восстановить для определенного периода времени в зависимости от характера генома содержание белков в1,12. DSBs будут обработаны nucleases, наиболее широко во время S и G2 фазы клеточного цикла, для создания ограниченной области ssDNA, который быстро покрывается РПА и другие обслуживания генома факторов9. Этот регион ssDNA окружен хроматина, который значительно изменена во время процесса РДР для регулирования найма и обмен другие факторы DDR13. Набор белков микро облученных регионы могут контролироваться если (рис. 1A). Как правило, хроматина связанные факторы (например, γ-H2A.X, 53BP1 и т.д.) обнаруживаются в ранее (1 – 5 мин) время очков, чем белки ssDNA привязкой, потому что нуклеиназы опосредованной резекция DSB концы необходим для создания РПА ssDNA платформы (≥10 мин). Для облегчения анализа изображений и публикации, мы разработали Фиджи скрипта (линер)10 , который автоматически структурирует клеточных ядер с помощью ДНК краситель связанные канала (например, DAPI), что делает его легче отличить микро облучения полос и отдельных ячеек, оставляя неинформативные ДНК окрашивания от окончательного изображения при сохранении ядерного определение (рис. 1B).
Γ-H2A.X и РПА комплекс подразделения функционируют в качестве маркеров для хроматина и ssDNA связанные факторы, соответственно. РПА ssDNA появляется как пунктата очагов, окруженный большой флуоресцентный хроматина полосы, украшен γ-H2A.X антитела (рис. 1 c). Точно определить положение факторов поддержания генома в ДНК повреждения может использоваться совместно локализации с этих маркеров. Например 53BP1, хроматина связанный белок, который управляет DSB ремонт выбор пути, локализует совместно с γ-H2A.X сигнал13. И наоборот PRP19, E3 убиквитин лигаза, что функции на РПА ssDNA содействовать ATR активации и репарации ДНК набирается как пунктата очагов, которые тесно соответствуют RPA32 распределения14,,1516,17 (Рис. 1 d). Следует отметить некоторые факторы также могут набираться на хроматина, прилегающих к первоначальной поражений, но не распространился в больших доменах, окружающих DSBs как γ-H2A.X и 53BP1. В таких случаях эти факторы будет выглядеть как пунктата очагов, но будет не совместно отлично локализации с привязкой к ssDNA белков.
Для живых клеток изображений, клетки, выражая POI, отмеченных флуоресцентные маркер может быть микро облученных и отражаться в реальном времени для получения весьма подробно кинетики набора (рисунок 2A–C). Несколько различных белков может наблюдаться одновременно при том условии, что их флуоресцентные метки могут быть спектрально отделены друг от друга. Для облегчения анализа временных рядов, мы создали два Фиджи скриптов, которые позволяют пользователю производить кино файлы, содержащие информацию времени серии (Movie Maker, смотрите фильмы Рисунок 2 c как онлайн дополнительного материала) и количественно белка набор микро облучении сайтов (повреждение анализатор)10. Вместо курирование трудоемкой ручной изображения, обычно требуемой для описания поведения белок повреждение анализатор сценарий проводит пользователя через обтекаемый шаги, которые отслеживать сигнал обогащения на микро облучении сайтов, в то время как автоматически Исправление для клеточного движения, дрейф изображения, фон сигнала и отбеливания все время точки эксперимента. Сформированные данные можно затем легко компилируются в приложение электронной таблицы и как необходимое (Рисунок 2D).
Рисунок 1: Локализации содержания генома факторы хроматина и РПА ssDNA платформ на микро облучение индуцированных повреждений. (A) лазер микро облучение в предварительно сенсибилизированных клеток приводит к производству двуцепочечные разрывы ДНК, которые являются резецируется, эндо - и экзо nucleases для создания ssDNA. Отсеке суб ssDNA могут быть визуализированы как пунктата с использованием антител против Репликативный белок А или другие факторы ssDNA локализованные очаги. В отличие от этого белки или модификации, которые распространяются на большие хроматина доменов отображаются как большие полосы на сайте микро облученных похож на схеме с антителами, ориентация фосфорилированных гистона вариант Н2А. X (Γ-H2A.X). (B) клетки предварительно сенсибилизированных с BBET или BrdU были микро облученных, предварительно извлеченные, фиксированной и окрашенных для указанных белков. 12-битные изображения были собраны в 1 X зум и обрабатывается с помощью скрипта Outliner Фиджи. (C) Z-укладки BBET или BrdU предварительно сенсибилизированных клеток позволяет разрешение ssDNA и хроматина, связанных факторов (максимальная интенсивность Z-проекция показано). (D) использование, которую этот метод, 53BP1 и PRP19 могут быть классифицированы как связанные хроматина и ssDNA генома обслуживания факторов, соответственно. Масштаб баров = 10 мкм; изображения в D являются все на той же шкале. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Live изображений РПА сложного набора сайты повреждения ДНК. (A) стабильная или переходные трансфекции плазмид кодирования белков кандидата, отмеченных флуоресцентные репортеров, следуют микро облучения transfected клеток позволяет мониторинга белка вербовки в повреждения ДНК в режиме реального времени. (B) клетки были transfected с pDEST47-RPA32-GFP плазмида и лизированы 24 часа позже. Выражение протеина был подтвержден immunoblotting. Transfected клеток (C) с pDEST-SFB EGFP или pDEST47 RPA32-GFP плазмид, предварительно сенсибилизированных с BrdU были микро облученных и отражаться в 12-бит в 1 X зум один раз в минуту после облучения. Время в минутах после облучения. Изображение точки времени 00:00 было принято до микро облучения. Файлы фильмов были созданы с помощью сценария фильма чайник Фиджи и показаны ключевые кадры. Масштаб баров = 10 мкм. (D) набор из RPA32-GFP микро облучения полосы количественно контролируется с помощью скрипта ущерб анализатор Фиджи. Выходные данные были нанесены с помощью Microsoft Excel. Черная линия означает обогащение раза RPA32-ГФП в микро облучении сайтов относительно сигнала до облучения и погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего 15 самостоятельно микро облученных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Фильм 1: микро облучения покадровой выражая клеток SFB-GFP. Клетки, временно transfected с плазмида pDEST-SFB ГФП были предварительно сенсибилизированных 24 h с BrdU, микро облученных и фотосъемка один раз в минуту для 29 мин пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Фильм 2: микро облучения покадровой выражая клеток RPA32-GFP. Клетки, временно transfected с плазмида pDEST47 RPA32-ГФП были предварительно сенсибилизированных 24 h с BrdU, микро облученных и фотосъемка один раз в минуту для 29 мин пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Используя методы, описанные выше, 405 нм лазер микро облучения клеток, предварительно сенсибилизированных с BBET или BrdU позволяет локализованные поколение поражения ДНК, включая DSBs в ядрах адэрентных клеток человека. Кинетика процесса РДР в этих DSBs аналогичны с другими методами в эукариотической клетки9,18,19. DSB резекции на микро облученных объектов приводит к ssDNA поколения, которое можно выполнить с помощью RPA32-таргетинг антитела или RPA32-GFP-фьюжн. Хроматин связанные факторы, с другой стороны, может быть расположен, с помощью γ-H2A.X как ссылка. Некоторые факторы, связанные хроматина не может распространяться от первоначального DSB как γ-H2A.X и будет отображаться как пунктата очагов, которые могут отличаться от очагов ssDNA связывающих белков.
После того, как создаются DSBs, набор белков и распродажа от повреждения сайтов может контролироваться если на фиксированные клетки. Выполнение этих экспериментов требуется только подходит если антитела против POI. Если недоступны если совместимых антитела, плазмиды могут быть спроектированы гены интереса к раме с конкретными epitopes (например: флаг, его тег) или флуоресцентные белки. Преходящий или стабильной трансфекции/трансдукции этих плазмид в адэрентных клеток может затем использоваться для определения ли конкретный коэффициент активно привлекается к поврежденной ДНК. Гиперэкспрессия белка может привести к неправильной локализации и может искусственно повысить их вербовки в микро облученных полосы. Для получения результатов, которые являются более репрезентативными эндогенного белков, ТРИФОСФАТЫ-Cas9 технология теперь может быть использован регулярно для тегов любой ген с подходящим epitopes20,21.
Python скриптов в микро облучения анализ Фиджи плагин облегчения визуализации, презентации, публикации и анализа кинетики DDR белков. Этот пакет анализа является открытым исходным кодом и функций независимо от Микроскоп платформа, используемая для выполнения экспериментов микро облучения и захвата изображений. Все что требуется это, что снимки, сделанные на платформе микроскопии сохранены как био-форматы совместимые файлы22. Так как фон дрейфующих и отбеливания исправления автоматически выполняются, анализ уровня белка в местах повреждения ДНК с сценариев является простым и очень быстро по сравнению с количественной оценки типичных ручной сигнала, с Микроскоп изображение приобретение программного обеспечения.
Как описано в протоколе, пользователям необходимо тщательно настроить их соответствующих лазерное сканирование системы Конфокальный микроскоп для достижения соответствующей суммы ущерба и побудить DSBs, которые следовать нормальной кинетики DDR. Действительно количество и тип поражения ДНК, порожденных микро облучения будет зависеть длина волны лазера и дозы, а также методы предварительной сенсибилизации. Пользователи должны иметь в виду, что даже несмотря на то, что DSBs создаются условия, описанные здесь, 405 нм лазер микро облучения фотовозбуждаемых клетки также создаст смесь других повреждений ДНК, включая cyclopyrimidine димеров (ДСП), рабочего тормоза РСРТ и окисленных основы, которые будут отличаться между системами микроскопа и параметров23,24,25. Таким образом тщательный мониторинг поражений на микро облучении сайтов необходимо быть выполнены, чтобы получить всеобъемлющую картину ущерба генерируется и вызвал ответ. Главное изучить ответ DSBs, каждая Микроскоп система должна быть оптимизирована путем мониторинга кинетика канонических белков повреждение ДНК и столб-поступательные изменения на микро облучении сайтов. К примеру, γ-H2A.X и комплекс подразделений пар (RPA70, RPA32 или RPA14) могут быть использованы удобно, поскольку они являются довольно легко обнаружить и быстро накапливаются в DSBs. Как правило, γ-H2A.X сигнал должен быть визуализированы как полосы на ранних (5 мин) и позднего времени (до 3-4 h) очка после повреждения в то время как РПА следует начать накопление как пунктата очагов приблизительно 10-15 мин после-микро-облучения. Если наблюдается Пан ядерная γ-H2A.X сигнал, количество энергии, полученные клетки не физиологические и приведет к быстрому клеточной гибели.
Существуют некоторые ограничения, которые должны быть рассмотрены при использовании 405 нм лазер для изучения конкретных путей восстановления ДНК. Например хотя BBET-405 нм сочетание легко производит сочетание рабочего тормоза РСРТ и DSBs, он не генерирует фотопродуктов 6-4 (6-4 PPs) и, следовательно, кинетики набора нуклеотидов иссечение ремонт белков отличаются от тех наблюдается, с помощью УФ-C микро облучения. Кинетика и масштабы вербовки различных белков, участвующих в реагировании на DSBs может также варьироваться в зависимости от ДНК повреждения метод, который в настоящее время используются23. Из-за этих вариантов мы рекомендуем пользователям адаптировать свои системы для максимизации тип поражений, которые потенциально признаются их POIs. Хотя менее широко доступны такие системы, использование других типов лазеров включая UV-A (337 – 355 Нм) или Фемтосекундный ближней ИК-области спектра (800 Нм) наряду с различных просветительских реагенты (например: tri метил псорален) можно разрешить пользователям создавать больше конкретные повреждения ДНК в зависимости от ДНК ремонт путей под исследования24,26.
Всякий раз, когда испытываются новые условия, это удобно использовать дневно меченых устоявшихся протеинов ремонта ДНК для тестирования дозы, волн и предварительно сенсибилизатор комбинаций и обеспечить, что поражение интерес формируется эффективно. К примеру PARP1 и XRCC1 могут функционировать в качестве маркеров для SSB и ремонт базы иссечение, XPA является хорошим показателем ремонта эксцизии нуклеотидов и 53BP1 будут набраны DSBs и функции в не гомологичных конец присоединение (ссылается на23,25 ,,27-28). Антитела, которые признают, что изменения, связанные с конкретными типами повреждения ДНК может также использоваться для количественного определения уровней ДНК аддукты или разрывы. Таким образом можно контролировать окисленных баз, димеры cyclopyrimidine, 6 – 4 PPs, рабочего тормоза РСРТ (с помощью поли АДФ-рибоза антитела) и DSBs (γ-H2A.X и 53BP1), если и определить параметры, обеспечивающие высокий уровень желаемой поражения23, 27 , 29. с тщательного мониторинга, пользователи должны иметь возможность изучить пути их ремонт интерес с помощью микро облучения.
В целом использование широко распространены лазерное сканирование конфокальные микроскопы оснащены 405 нм лазерные линии для создания локализованных DSBs, в сочетании с платформа специфического ДНК повреждения маркеров к югу классификации факторов поддержания генома и упорядочение данных обработка с помощью плагина Фиджи анализ микро облучения, должно оказать изучения DDR факторов динамики более доступным, чем когда-либо прежде для обеих опытных и начинающих следователи поля поддержание генома.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержку естественных наук и инженерных исследований Совет Канады [открытие Грант 5026 A.M] и следующего поколения ученых стипендию от общества исследований рака [21531 до A.M]. Мы благодарим Жан-Франсуа Люсьера за отличные качества Фиджи Python скриптов и советы по статистического анализа. Мы благодарим д-р Стефани а. Yazinski за рецепт решения если фиксации. Мы благодарим Пол-Людовик Karsenti за помощь с измерения мощности лазера.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope | Olympus | ||
| FluoView FV3000 software (version 2.1) | Olympus | ||
| 405 nm laser | Coherent | Radiation source | |
| Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 | Okolab | OKO-UNO-1 | |
| 60X /1.4 Objective | Olympus | Oil immersion objective | |
| 8-well culture slides on coverglass (X-well) | Sarstedt | 94.6190.802 | |
| U2OS osteosarcoma human cell line | ATCC | HTB-96 | Stable cell lines |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | Caution toxic |
| 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | 59-14-3 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Caution toxic |
| Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | ThermoFisher | 62249 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher | BP1600-100 | |
| Trypsin EDTA 0.1% | ThermoFisher | 15400-054 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX777.100 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | BP337-500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| JetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI | ThermoFisher | P36962 | |
| DMEM 1X, + phenol red | Wisent | 319-005-CL | |
| DMEM 1X, - phenol red | Wisent | 319-051-CL | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Mouse anti-RPA32 antibody | Abcam | ab2175 | 1:500 for IF |
| Rabbit anti-γ-H2A.X antibody | Cell Signaling | 9718S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-53BP1 antibody | Cell Signaling | 4937S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-PRP19 antibody | Abcam | ab27692 | 1:500 for IF |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 | Cell Signaling | 4414S | 1:250 for IF |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling | 4408S | 1:250 for IF |
| Fiji image analysis open-source software | https://fiji.sc | ||
| 1918-K Power meter with a 918D-SL-0D3 sensor | Newport |
References
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).
- Limoli, A. C. L., Ward, J. F., May, N. A New Method for Introducing Double-Strand Breaks into Cellular DNA. Radiation Research. 134 (2), 160-169 (1993).
- Polo, S. E., Jackson, S. P. Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. Genes & development. 25 (5), 409-433 (2011).
- Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nature cell biology. 5 (3), 255-260 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Collins, T. J.
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual review of genetics. 45, 247-271 (2011).
- Garneau, D., Maréchal, A. Microirradiation Analysis Fiji Plugin. , Available from: https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/ (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Reports. 11 (9), 1-15 (2015).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2013).
- Maréchal, A., et al. PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry. Molecular Cell. 53 (2), 235-246 (2014).
- Dubois, J. -C., et al. A phosphorylation-and-ubiquitylation circuitry driving ATR activation and homologous recombination. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8859-8872 (2017).
- Wan, L., Huang, J. The PSO4 Complex Associates with RPA and Modulates the Activation of ATR. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6619-6626 (2014).
- Abbas, M., Shanmugam, I., Bsaili, M., Hromas, R., Shaheen, M. The role of the human Psoralen 4 (hPso4) complex in replication stress and homologous recombination. The Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 14009-14019 (2014).
- Chung, W. H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting. PLoS Genetics. 6 (5), (2010).
- Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
- Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5 (9592), (2015).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Dinant, C., et al. Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods. Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).
- Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 37 (9), e68 (2009).
- Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
- Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).
- Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. Chemical proteomics reveals a γH2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response. Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).
- Soultanakis, R. P., et al. Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy. Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).
