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Genetics

Investigación de reclutamiento de la proteína a las lesiones del ADN usando 405 Nm láser Micro-irradiación

Published: March 20, 2018 doi: 10.3791/57410
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Université de Sherbrooke
* These authors contributed equally

Summary

Estudiar la cinética de reparación de daños de ADN requiere un sistema para inducir lesiones en regiones definidas del nucleares. Se describe un método para crear localizados roturas de doble cadena utilizando un microscopio confocal de escaneo láser equipado con un 405 nm láser y procedimientos automatizados para cuantificar la dinámica de los factores de reparación de estas lesiones.

Abstract

La respuesta de daño de DNA (DDR) utiliza una gran cantidad de proteínas para detectar la señal y reparar las lesiones del ADN. Delineación de esta respuesta es fundamental para entender los mecanismos de mantenimiento del genoma. Puesto que el reclutamiento y el intercambio de proteínas en las lesiones son altamente dinámicos, su estudio requiere la capacidad para generar daños en el ADN de una manera rápida y espacialmente delimitado. Aquí, describimos los procedimientos para inducir localmente el daño de la DNA en células humanas usando un microscopio confocal escaneo láser comúnmente disponible equipado con una línea de láser de 405 nm. Acumulación de mantenimiento genoma factores en rayas de láser pueden evaluarse por inmunofluorescencia (IF) o en tiempo real utilizando proteínas etiquetadas con reporteros fluorescentes. Utilizando fosforiladas histonas H2A. X (γ-H2A.X) y replicación de proteína A (RPA) como marcadores, el método proporciona suficiente resolución para discriminar factores contratados localmente que difunda en cromatina adyacente. Además proporcionamos scripts basados en ImageJ para controlar eficientemente la cinética de la relocalización de la proteína al ADN dañan sitios. Estos refinamientos simplifican enormemente el estudio de la dinámica de la DDR.

Introduction

Las células están constantemente expuestas a las fuentes endógenas y exógenas de daño en el ADN que amenazan su integridad genómica. El DDR es un conjunto de vías que detectan, señalan y reparacion las lesiones del ADN para mantener la estabilidad del genoma de señalización. En roturas de doble hebra de DNA (distritales), lo DDR se produce principalmente en dos plataformas complementarias: γ-H2A.X-labeled cromatina y una región de ADN (ssDNA) monocatenario resecada normalmente recubierta de ssDNA-enlace complejo EPR1,2.

UV-láser micro-irradiación de células sensibilizadas previamente con la timidina analógica 5-bromo-2' desoxiuridina (BrdU) o el tinte de ADN bisbenzimide etóxido trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) crea una mezcla de lesiones de ADN, como roturas de cadena simple ( SSBs) y distritales que provocan una DDR localizada en la cromatina y el ssDNA plataformas3,4. Trabajos previos demostraron que reclutamiento de factores de mantenimiento del genoma para estas dos plataformas distintas en el OSD puede ser discriminado con láseres de alta energía UV-A (335-365 nm) combinados con IF2,5. Microscopios equipados con estos láseres son costosos ya que requieren un láser de alta energía y dedicados objetivos de transmisión UV-A haciéndolos mucho menos frecuente en contextos académicos y farmacéuticos que microscopios confocales de escaneo láser con láser de 405 nm líneas. El estudio de reclutamiento de la proteína y el intercambio en los sitios de micro-irradiado también queda excluido por el análisis de imagen manual laborioso requerido para describir el comportamiento dinámico de los factores de mantenimiento del genoma.

Aquí, mostramos que la sensibilización previa de las células con tinción de ácido nucleico BrdU o BBET seguida de irradiación de micro usando una 405 nm láser a un microscopio confocal común permite el monitoreo de la dinámica de factor de mantenimiento de genoma en las lesiones del ADN. Γ-H2A.X o subunidades complejo de RPA como marcadores de la plataforma junto con z de apilamiento para mayor profundidad de campo y deconvolución resolución permite al experimentador discriminar los factores que son reclutados localmente a distritales a las que se extendió a Dominios de cromatina grande que rodea la lesión inicial. Esta sub-clasificación según distintos compartimentos intra nucleares ayuda a perfeccionar los roles potenciales de desacostumbrada proteínas reclutadas a sitios irradiados de micro. Además, ofrecemos protocolos convenientes y optimizado tuberías para analizar rápidamente la dinámica de los factores de mantenimiento del genoma usando el software de código abierto Fiji (una distribución de ImageJ)6,7,8. Estos refinamientos a los métodos de micro-irradiación actuales hacen el estudio de la DDR posible en prácticamente cualquier entorno de laboratorio.

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Protocol

1. la sensibilización de las células

  1. 24 h antes del experimento de micro-irradiación de semillas 40.000 U2OS células por pocillo en 1 x DMEM que contiene 10% FBS en cultivo 8-bien diapositivas con fondos de 170 μm de espesor como cubreobjetos de vidrio y polímeros para transmitancia máxima de 405 nm de luz láser y la proyección de imagen excelente con un escaneo láser confocal microscopio invertido. Si usa un 8 bien microslide, use 500 μl de medios o soluciones por pozo para todos los tratamientos posteriores y pasos de lavado del protocolo.
    Nota: Debido a su morfología plana, buena adherencia y núcleos grandes, U2OS células facilitan la detección de reclutamiento de la proteína en sitios irradiados micro pero pueden utilizarse otros tipos de células adherentes según sea necesario. Las células deben idealmente ser alrededor 80% irradiado de confluencia en el tiempo de irradiación de micro para aumentar el número de células por experimento. Confluencia de muy alta puede resultar en alteraciones del ciclo celular que pueden perturbar vías de reparación específicos como recombinación homóloga que ocurre durante las fases S y G2 del ciclo celular9.
  2. Incube las células durante la noche a 37 ° C con 5% CO2y luego la sensibilizar las células (paso 1.3) BrdU o (1.4) BBET (Hoechst 33342).
    Nota: Para observar el reclutamiento directo de una proteína de interés (POI) para las lesiones del ADN, transfectar o transduce la DNA del plasmid llevando una fusión entre una proteína fluorescente y un POI las 24 horas después de la siembra de la célula. 24 h post-transfection/transducción de señales, la sensibilizar y micro-irradian las células para controlar la contratación de la PDI en los sitios de daño de ADN en tiempo real.
  3. Para aumentar el número de consejos escolares distritales generados por exposición a la 405 nm láser, añadir 10 μm de BrdU a los medios durante 24 h antes de la irradiación de micro. Antes de la irradiación del micro, utilizando una micropipeta, enjuague las células dos veces con medio sin rojo de fenol para máxima exposición de las células a los láser de 405 nm.
  4. Por otra parte, tratar células durante 15 min con BBET a 10 μg/mL en el medio apropiado en una incubadora de cultivo de células a 37 ° C. Después del tratamiento, Lave dos veces con medio sin rojo de fenol antes micro-irradiación.

2. micro-irradiación de células

  1. Seleccionar un adecuado microscopio confocal de escaneo láser.
    Nota: Los experimentos aquí presentados fueron realizados en un sistema de microscopio equipado con una 50 mW 405 nm láser línea y un objetivo de aceite de apertura numérica de 1.4 X 63. Para generar distritales, células fueron irradiadas por micro 1 X scan zoom a 1.024 x 1.024 píxeles/campo (0.21 μm/píxeles en 63 X de ampliación) y en modo unidireccional en 8 μs/píxel. La potencia del láser utilizada fue de 25% y 80% para las células BBET y BrdU-pre-sensibilizadas, respectivamente. Para ayudar a los usuarios configurar su sistema, el objetivo después de la energía láser en el sistema presentado se midió con un medidor de potencia según las instrucciones del fabricante. Las mediciones corresponden al 2.6 mW y 7.0 mW para BBET y BrdU-pre-sensibilizadas las células, respectivamente.
  2. Encienda el microscopio y la cámara.
    1. Fijar la cámara a 37 ° C con 5% CO2 antes de que las muestras se colocan en la incubadora escenario para evitar estrés innecesario a las células y para asegurar cinética homogénea de la RDA a través de experimentos.
  3. Seleccionar campos con células bien-distribuidas, ajustar el enfoque y registrar su posición para facilitar la adquisición de imágenes después del Protocolo de IF. Adquirir al menos una imagen que servirá como punto de referencia de daños previos para monitorizar la cinética de reclutamiento de la proteína después de la irradiación de micro.
    Nota: Recipientes de cultivo cuadriculada pueden usarse para facilitar la localización de las células irradiadas por micro en los pasos posteriores.
    1. Para los experimentos de IF usando las células etiquetadas BBET, ajuste el enfoque en las células mediante el láser de 405 nm en la menor potencia del láser suficiente para visualizar las células para evitar daños injustificados en el ADN.
      1. Evitar el uso de fluorescencia de campo amplio para ajustar el enfoque en células con tinción BBET como la luz ultravioleta emitida por la lámpara inducen daño en el ADN en sitios iluminados.
    2. Si utiliza células BrdU marcado, ajuste el enfoque con contraste de interferencia diferencial (DIC) o proyección de imagen de contraste de fase mirando el nucleares características como nucleolos.
    3. Si usa las células con marcada con fluorescencia POIs, seleccione un plano focal con intensidad de fluorescencia representante.
      Nota: Evite las células que expresan altos niveles del PDI como fuerte sobreexpresión puede resultar en localización artifactual. Además, seleccionar las células que expresan el POI en niveles comparables (selección de clones estables recomienda reducir al mínimo las variaciones en los niveles de expresión y selección de POI).
  4. Configurar el microscopio para el paso de micro-irradiación con la recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) _module del sistema.
    Nota: Los parámetros más importantes a considerar al establecer el sistema de microscopio para experimentos de micro-irradiación son: la potencia de salida de los 405 nm láser, número de iteraciones (es decir, número de veces el láser a entrar en las mismas coordenadas), número de píxeles/campo (63 X aumento y resolución de 1.024 x 1.024, 1 píxel = 0,21 μm) y tiempo de permanencia por píxel. Todos estos factores afectará la cantidad de energía que experimentan las células y por lo tanto la cantidad y el tipo de ADN dañan generado (véase discusión para más información de optimización de dosis).
  5. Con el módulo FRAP del sistema de microscopio, micro-irradian las células.
    Nota: En la mayoría de los sistemas micro-irradiación de células múltiples puede realizarse en un solo campo como manchas o líneas/rectángulos (típicamente 1-2 μm de ancho). Al realizar imágenes en vivo de marcada con fluorescencia de proteínas inmediatamente después daños, limitar la irradiación de micro a un pequeño número de células por campo ya que el tiempo tomado para micro-irradiar cada célula dará lugar a una inducción retardada del DDR. Esto es particularmente importante cuando el control de proteínas que son reclutadas muy rápidamente a las lesiones del ADN.
  6. Después de la micro-irradiación, devolver diapositivas varios pocillos o platos en una incubadora a 37 ° C con 5% CO2 durante el tiempo necesario antes de procesar las muestras para si (sección 5) o proceder de inmediato con imágenes en vivo (sección 3).
    1. Como primer paso, fijar las células en pocos minutos hasta unas pocas horas post-irradiation del protocolo IF. Según el PDI, cinética de reclutamiento puede variar. Por lo general, proteínas asociadas a cromatina distritales y SSBs se localización muy rápidamente a la lesión y a veces se quitan dentro de 5 minutos. Algunos factores como los que montan en ssDNA se reclutarán en momentos más tardías una vez que se ha dedicado a la maquinaria de la resección y permanecen allí durante horas (véase figura 1 y la referencia4).

3. en vivo imágenes de proteínas marcada con fluorescencia

  1. Realizar proyección de imagen de Time-lapse de las células irradiadas por micro. Proteínas que son reclutadas muy rápidamente a las lesiones, unos segundos por fotograma serán ideal, pero para las proteínas que localización a la zona dañada más adelante (p. ej., factores de resección), la adquisición pueden ser llevado a cabo cada 1 – 2 min hasta alcanza una meseta.
    Nota: Reducir al mínimo la potencia del láser para la adquisición de la imagen para evitar blanqueo tanto como sea posible y para asegurar el reclutamiento de la proteína en sitios de daño no alcanza la saturación que impediría la cuantificación de la señal y posterior análisis (véase el análisis de datos Sección 4). En el sistema actual, la proyección de imagen se realizó con un 63 X 1.4 aceite objetiva usando un tiempo de permanencia de 8 μs/píxel, resolución de 1.024 x 1.024, zoom X 1 y un promedio de 2. Tenga en cuenta que estos parámetros deben optimizarse para otros sistemas o experimentos diferentes.
  2. Micro-irradian las células en campos adicionales hasta mediciones de cinética se obtienen células de 15-30. Repetir los experimentos al menos 3 veces en muestras biológicas para asegurar la exactitud y la reproducibilidad de la cinética de captación.
    Nota: Cuando la adaptación de este protocolo a un específico sistema confocal, puede ser útil iniciar mediante el control de la cinética de la contratación de un factor de mantenimiento del genoma conocido marcada con fluorescencia (p. ej., 53BP1-GFP, RPA32-GFP, etc.). Usando proyección de imagen en vivo para optimizar las condiciones micro-irradiación permite medir varios parámetros rápidamente.

4. Análisis de la cinética de reclutamiento

  1. Instalar el plugin de análisis Microirradiation10 en de software de análisis de imagen de Fiji11.
  2. Abra las imágenes adquiridas en Fiji. Seleccione "El analizador de daños" en el menú desplegable plugins en la suite de análisis de Microirradiation. Siga las instrucciones para definir una región del fondo de interés (ROI) (por lo general de 3 x 3 μm) y ROIs irradiados y no irradiados en cada célula irradiada por el micro.
    1. ROIs de uso del mismo tamaño para minimizar los sesgos potenciales en decir intensidades de la señal. Para imágenes adquiridas, también incluyen al menos un marco de irradiación previa que se utilizará como base para vigilar la contratación en sitios de micro-irradiado.
    2. Una vez que se han recogido todos los datos de retorno de la inversión sobre la serie full time-lapse, guarde el archivo creado por el plugin que contiene el resultado como un archivo de txt (archivo delimitado por tabuladores) o csv (archivo delimitado por comas). Este archivo contiene las mediciones de la intensidad media para cada momento y cada ROI (significa fondo de intensidad, intensidad significa no-irradiados y significa intensidad irradiado).
      Nota: El plugin resta automáticamente la intensidad de fondo (b) de la intensidad de los ROIs irradiados (s) y el ROI no irradiado (In). También calcula una relación entre ambos valores (ver la fórmula abajo) para corregir por photobleaching (irradiadas/no-irradiado).
      Equation 1
      El plugin también calcula una normalización entre el primer punto de tiempo (valor 1) y todos los otros puntos del tiempo para cada núcleo (cociente relativo al primer punto de tiempo). Puede encontrar información adicional en el plugin web10.
  3. Realizar el análisis utilizando el plugin para todos irradiado de micro células (por lo menos 15 – 30) y ver el enriquecimiento relativo promedio en las regiones irradiadas por micro con el tiempo. Calcular los errores estándar de la media para los datos de cada punto y les trama de.
    1. Confirmar las diferencias en la cinética de captación entre dos condiciones experimentales mediante la realización del estudiante t-pruebas para cada punto de datos.

5. Si protocolo

  1. Preparar soluciones de IF. Preparar solución de pre/post-extraction (helada 1 x PBS con un 0.25% Tritón X-100), solución de lavado (1 x PBS que contenga 0.05% Tween-20), solución de bloqueo (PBS 1 x con un 3% de BSA y 0.05% Tween-20) y la solución de fijación (paraformaldehido 3% + sacarosa 2% en PBS 1 x) en tubos cónicos de polipropileno.
    Nota: Para un solo pozo 8 microslide, 10 mL de solución de pre/post-extraction, 50 mL de solución, 10 mL de solución de bloqueo y 5 mL de solución de fijación de lavado se requieren.
    1. Preparar la solución de fijación.
      1. Debajo de una campana química, mezcla 400 mL de agua destilada doble (ddH2O) con 15 g de paraformaldehído y 30 μl de 10 N NaOH en un matraz Erlenmeyer de 1 L.
      2. Cerrar el recipiente y el calor a 65 ° C en una agitador magnético placa agitando para solubilizar completamente el paraformaldehído.
      3. Usando una pipeta de 25 mL, agregar 50 mL de 10 X PBS, remover y filtro utilizando un filtro de 0.45 μm.
      4. Añadir 10 g de sacarosa y completar a 500 mL con ddH2O.
      5. Alícuota de la solución en tubos cónicos de 15 mL; almacenar a-20 ° C hasta su uso.
    2. Preparar los núcleos coloración solución por dilución de una solución stock de 1 mg/mL de 4, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1:1,000 en PBS 1 x.
  2. Usando una micropipeta, retire con cuidado los medios de comunicación de los pocillos del portaobjetos de microscopía varios pocillos o placas e inmediatamente lavar con 500 μl de solución de lavado IF cambiando la solución dos veces sin necesidad de esperar.
    Nota: Los datos IF presentados aquí fueron obtenidos usando las células cultivadas en portaobjetos de microscopía 8-bien que se lavaron y se incubaron en 500 μl de las soluciones. Volúmenes deben ajustarse dependiendo de los contenedores de cultura de célula utilizados por experimentadores. Además, realizar el protocolo de IF con extremo cuidado como células pueden separar fácilmente de la parte inferior de vidrio y polímeros. Utilice una micropipeta para todos los cambios de solución para minimizar la pérdida de la célula.
  3. Incubar en hielo por 5 min con 500 μl de helada si solución de pre/post-extraction y agitar suavemente a mano durante 15 – 30 s. realizar la extracción previa paso que elimina más proteínas citoplásmicas y nucleoplasmática y maximiza la señal de la cromatina / Factores asociados de ADN.
  4. Lavar dos veces con 500 μl de solución de lavado de IF.
  5. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente en 500 μl de solución de fijación de IF. Como alternativa, utilice una solución de paraformaldehído pre-hechos (3 – 4%) para el paso de fijación.
  6. Lavar dos veces con 500 μl de solución de lavado de IF.
  7. Incubar en hielo por 5 min en 500 μl de helada IF pre/post-extraction solución y deslice suavemente con la mano para efectuar el paso de permeabilización del remolino.
  8. Lavar dos veces con 500 μl de solución de lavado de IF.
  9. Incubar al menos 30 min a temperatura ambiente con 500 μl de solución de bloqueo de IF.
  10. Eliminar bloqueo de solución con una micropipeta e incubar durante una noche en una cámara humidificada a 4 ° C con anticuerpos primarios de 250 μl diluidos en solución de bloqueo.
    Nota: Es buena práctica realizar la incubación con los anticuerpos primarios secuencialmente para evitar posibles artefactos de la co-localización. Una vez que se han realizado los controles adecuados, al mismo tiempo incuban anticuerpos primarios para acelerar el proceso.
  11. Lavar cuatro veces durante 5 minutos en 500 μl de solución de lavado IF con suave agitación (60 RPM en un rotador).
  12. Incubar durante 1 h a 37 ° C con 250 μl de anticuerpos secundarios diluido en solución de bloqueo en una cámara humidificada.
    Nota: Proteger las muestras de la luz sobre la adición de anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia.
  13. Lavar cuatro veces cada 5 minutos en 500 μl de solución de lavado IF con agitación suave.
  14. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos en 500 μl de PBS de x 1 que contiene 1 μg/mL DAPI para teñir núcleos.
  15. Lavar dos veces con 500 μl de PBS 1 x y dejar las células en 500 μl de solución de PBS para la proyección de imagen de 1 x.
  16. Utilizando diapositivas cuadriculadas o posiciones etapa registrada, encontrar las células irradiadas por micro con un marcador de daño de ADN bien caracterizado (por ejemplo, γ-H2A.X, RPA32, etc.).
  17. Imagen de diapositivas cultura varios pocillos o placas en todos los canales pertinentes mediante los ajustes apropiados en un microscopio confocal de escaneo láser.
    Nota: En el sistema actual, la proyección de imagen se realizó con un 63 X 1.4 aceite objetiva usando un tiempo de permanencia de 8 μs/píxel, resolución de 1.024 x 1.024, zoom X 1 y un promedio de 2. Tenga en cuenta que estos parámetros deben optimizarse para otros sistemas o experimentos diferentes.

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Representative Results

Tras micro-irradiación, las células pueden recuperar para un período específico de tiempo dependiendo de la naturaleza del genoma mantenimiento proteínas1,12. Distritales se procesarán por nucleasas, más extensivamente durante las fases S y G2 del ciclo celular, para crear una región limitada de ssDNA que rápidamente es cubierto por RPA y otros de factores de mantenimiento de genoma9. Esta región de ssDNA está rodeada por la cromatina que es modificada extensivamente durante la DDR a reglamentar la contratación y el intercambio de otros factores DDR13. Reclutamiento de proteínas a regiones irradiadas por micro puede ser monitoreado por IF (figura 1A). Por lo general, factores asociados de cromatina (por ejemplo, γ-H2A.X, 53BP1, etc.) son detectables en el anterior (1-5 min) tiempo puntos de ssDNA-enlazado a proteínas porque resección mediada por la nucleasa de OSD extremos se requiere para generar la plataforma de RPA-ssDNA (≥10 min). Para facilitar el análisis de imágenes y publicación, hemos ideado un script (el Outliner) de Fiji10 que automáticamente los núcleos de célula ADN asociados tinte canales (por ejemplo, DAPI), haciéndolo más fácil de distinguir micro-irradiación rayas y células individuales dejando fuera poco informativo DNA manchas de las imágenes finales conservando definición nuclear (figura 1B).

Γ-H2A.X y subunidades complejo EPR funcionan como marcadores para los factores asociados de cromatina y ssDNA, respectivamente. RPA-ssDNA aparece como focos punteados rodeados de cromatina fluorescentes grandes franjas decoradas por el anticuerpo de la γ-H2A.X (figura 1). Co-localización con estos marcadores puede utilizarse para definir con precisión la posición de los factores de mantenimiento del genoma en las lesiones del ADN. Por ejemplo, 53BP1, una proteína asociada a la cromatina que controla la elección de vía de reparación DSB, se localiza junto con la γ-H2A.X señal13. Por el contrario, PRP19, una ligasa de ubiquitina E3 que funciones en RPA-ssDNA para promover la activación de ATR y reparación del ADN es reclutado como focos punteados que asemejen la RPA32 distribución14,15,16,17 (Figura 1). De la nota, algunos factores también pueden ser reclutados en la cromatina adyacente a las lesiones iniciales pero no extendido a dominios grandes que rodean los distritales como 53BP1 γ-H2A.X. En tales casos, estos factores aparecerían como focos punteados pero no perfectamente co localizar con ssDNA-enlazado a proteínas.

Para células vivas imágenes, las células que expresan un POI con la etiqueta con un marcador fluorescente pueden ser irradiado en micro y reflejada en tiempo real obtener altamente detallada cinética de captación (figura 2A–C). Múltiples proteínas diferentes pueden observarse simultáneamente siempre que sus etiquetas fluorescentes pueden ser espectralmente separados entre sí. Para facilitar el análisis de series de tiempo, hemos creado dos scripts de Fiji que permiten al usuario producir archivos de película que contiene información de series de tiempo (Movie Maker, ver películas de la figura 2 como Material complementario en línea) y cuantificar proteínas reclutamiento en irradiado en micro sitios (daño Analyzer)10. En lugar del comisariado de imagen manual desperdiciador de tiempo normalmente requerido para describir el comportamiento de una proteína, la secuencia de comandos de analizador de daño guía al usuario por pasos racionalizados que vigilar enriquecimiento de señal en sitios de micro-irradiado, mientras que automáticamente corregir movimiento celular, deriva de la imagen, señal de fondo y blanqueo en todo momento puntos del experimento. Los datos generados se pueden fácilmente compilados en una aplicación de hoja de cálculo y graficados como sea necesario (Figura 2D).

Figure 1
Figura 1: Factores de localización de mantenimiento del genoma a las plataformas de RPA-ssDNA en lesiones inducidas por la radiación de micro y cromatina. (A) micro-la irradiación del Laser de células sensibilizadas previamente conduce a la producción de roturas de doble hebra de DNA, que se resecan por endo - y exo-nucleasas para generar ssDNA. El compartimento secundario de ssDNA se puede visualizar como focos punteados usando anticuerpos contra la proteína A replicación u otros factores localizados de ssDNA. En contraste, las proteínas o modificaciones que se extendido a dominios de cromatina grande aparecen como grandes rayas en el sitio irradiado micro similar al patrón observado con anticuerpos contra la variante fosforilada de la histona H2A. X (Γ-H2A.X). (B) células sensibilizadas previamente con BBET o BrdU fueron irradiadas por micro, previamente extraído, fijo y manchada por las proteínas indicadas. imágenes de 12 bits a 1 X de zoom y procesaron usando el script de Fiji Outliner. (C) Z-apilamiento de células sensibilizadas previamente BBET o BrdU permite la resolución de los factores asociados de ssDNA y cromatina (máxima intensidad de proyección Z se muestra). (D) usando que este método, 53BP1 y PRP19 pueden clasificarse como factores de mantenimiento de genoma cromatina y ssDNA asociados, respectivamente. Barras de la escala = 10 μm; imágenes de D son todos en la misma escala. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Imágenes en vivo de reclutamiento complejo EPR a sitios de daño del ADN. (A) estable o transitoria de transfección de plásmidos que codifican las proteínas candidatos etiquetadas con reporteros fluorescentes seguidos por micro-irradiación de células transfected permite el monitoreo de reclutamiento de la proteína a las lesiones del DNA en tiempo real. (B) las células fueron transfectadas con un plásmido pDEST47-RPA32-GFP y lisis 24 h más tarde. Expresión de la proteína fue confirmada por immunoblotting. (C) las células transfected con EGFP pDEST SFB o pDEST47 RPA32-GFP plásmidos previamente sensibilizados con BrdU se micro-irradiado y reflejadas en 12-bit a 1 X de zoom una vez por minuto post-irradiation. Es en post-irradiation minutos. La imagen de punto de tiempo de 00:00 fue tomada antes de la irradiación de micro. Archivos de película fueron creados usando el script de Movie Maker Fiji y se muestran los fotogramas clave. Barras de la escala = 10 μm. (D) contratación de RPA32-GFP a irradiación de micro rayas cuantitativamente fue supervisada usando el script de daño analizador Fiji. Datos de salida se trazaron utilizando Microsoft Excel. La línea negra es el doblez de enriquecimiento medio de RPA32-GFP en sitios irradiados micro en relación con la señal de la irradiación y las barras de error representan el error estándar de la media de 15 células independientemente micro-irradiado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Movie 1
Película 1: Micro-irradiación Time-lapse de células expresa GFP SFB. Las células transfectadas transitoriamente con un plásmido GFP pDEST SFB fueron previamente sensibilizada 24 h con BrdU, irradiado por el micro y reflejada una vez por minuto durante 29 minutos haga clic aquí para descargar esta peli.

Movie 2
Película 2: Micro-irradiación Time-lapse de células expresa GFP RPA32. Las células transfectadas transitoriamente con un plásmido de pDEST47 RPA32-GFP eran 24 h pre-sensibilizada con BrdU, irradiado por el micro y reflejada una vez por minuto durante 29 minutos haga clic aquí para descargar esta peli.

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Discussion

Utilizando los métodos mencionados anteriormente, 405 nm láser micro-irradiación de células sensibilizadas previamente con BBET o BrdU permite la generación localizada de las lesiones del ADN incluyendo distritales dentro de los núcleos de las células humanas adherentes. Cinética de DDR en estos distritales son similares a los generados con otros métodos en las células eucariotas9,18,19. Resección de DSB en sitios irradiados micro conduce a ssDNA-generación que se puede seguir usando un anticuerpo dirigido a RPA32 o una fusión de RPA32-GFP. Factores asociados de cromatina, por otra parte, pueden ser situados usando γ-H2A.X como referencia. Algunos factores de la cromatina asociados no pueden extenderse del OSD inicial tanto como γ-H2A.X y aparecerán como focos punteados que pueden ser distintos de focos de ssDNA-proteínas.

Una vez que se generan distritales, reclutamiento de la proteína y la separación de los sitios de daño pueden ser monitoreados por IF en las células fijas. Realización de estos experimentos requiere solamente un anticuerpo adecuado de IF contra el POI. Si IF compatible con anticuerpos están disponibles, pueden diseñarse plásmidos portadores de genes de interés en marco con epitopos específicos (por ejemplo: la bandera, su etiqueta) o proteínas fluorescentes. Transfección transitoria o estable/transducción de estos plásmidos a las células adherentes puede entonces utilizarse para determinar si un factor específico es reclutado activamente dañado DNA. Sobreexpresión de proteínas puede conducir a errores de localización y puede aumentar artificialmente su contratación a rayas micro-irradiado. Para obtener resultados más representativos de proteínas endógenas, CRISPR Cas9 tecnología puede ahora ser utilizada rutinariamente para etiquetar cualquier gen de interés con epitopos adecuado20,21.

Los scripts de Python en el análisis micro-irradiación Fiji Plugin facilitan la visualización, presentación, publicación y análisis de la cinética de las proteínas DDR. Este paquete de análisis es código abierto y funciona independientemente de la plataforma de microscopio utilizado para realizar experimentos de micro-irradiación y adquisición de la imagen. Todo lo que se requiere es que las imágenes tomadas en la plataforma de microscopía salvo como Bio-formatos compatibles con archivos22. Desde el fondo, a la deriva y blanquear las correcciones se realizan automáticamente, análisis de niveles de proteína en sitios de daño del ADN con las secuencias de comandos siempre es sencillo y muy rápido en comparación con la cuantificación típica señal manual realizada con software de adquisición de imágenes de microscopio.

Como se describe en el protocolo, los usuarios deben configurar cuidadosamente su respectivo escaneo de láser sistemas de microscopio confocal para alcanzar la cantidad apropiada de daños e inducir distritales que siguen la cinética normal de la DDR. De hecho, la cantidad y tipo de lesiones de ADN generado por la micro-irradiación dependerá de láser longitud de onda y dosis, así como en los métodos de sensibilización previa. Los usuarios deben tener en cuenta que aunque distritales son generados por las condiciones descritas aquí, 405 nm láser micro-irradiación de células Fotoinducidas también generará una mezcla de otras lesiones del ADN, como dímeros de cyclopyrimidine (CPDs), SSBs y oxidado bases, que variarán entre los sistemas del microscopio y ajustes23,24,25. Así, un monitoreo cuidadoso de las lesiones en sitios de micro-irradiado debe realizarse para obtener una imagen completa de los daños generados y la respuesta provocada. Importante, para estudiar la respuesta a los consejos escolares distritales, cada sistema del microscopio debe optimizarse mediante el control de la cinética de la canónicas proteínas de daño de DNA y modificaciones postraduccionales en sitios de micro-irradiado. Por ejemplo, γ-H2A.X y las subunidades complejo de RPA (RPA70, RPA32 o RPA14) pueden ser utilizadas convenientemente ya que son bastante fáciles de detectar y rápidamente se acumulan en los consejos escolares distritales. Como regla general, γ-H2A.X señal se deberá visualizar como rayas en temprano (5 min) y tarde (hasta 3-4 h) tiempo puntos daños posteriores mientras que RPA debe comenzar acumulando como focos punteados aproximadamente 10-15 min post-anti-micro-irradiación. Si se observa una señal nuclear pan γ-H2A.X, la cantidad de energía recibida por las células es no fisiológico y resultará en la muerte celular rápida.

Existen algunas limitaciones que deben considerarse cuando se usa un 405 nm láser para el estudio de vías de reparación de ADN específicas. Por ejemplo, aunque la combinación de BBET-405 nm produce fácilmente una combinación de SSBs y distritales, no genera photoproducts de 6 – 4 (6-4 PPs) y consecuentemente, la cinética de captación de proteínas de reparación de escisión de nucleótidos son distintos a los observa con UV-C micro-irradiación. La cinética y el grado de reclutamiento de diversas proteínas implicadas en la respuesta a los consejos escolares distritales también pueden variar según el ADN dañando el método que se utiliza23. Debido a estas variaciones, se recomienda que los usuarios adapten sus sistemas para maximizar el tipo de lesiones que potencialmente son reconocidos por sus POIs. Aunque estos sistemas son menos ampliamente disponibles, con otros tipos de láseres como UV-A (337-355 nm) o femtosecond infrarrojo cercano (800 nm) junto con reactivos de sensibilización diferentes (por ejemplo: psoralen tri-metil) puede permitir a los usuarios generar más lesiones específicas de la DNA según el ADN reparación de vías en el estudio24,26.

Siempre se están probando nuevas condiciones, es conveniente utilizar proteínas de reparación de ADN marcada con fluorescencia bien establecidas para probar dosis, longitudes de onda y las combinaciones de sensibilizador previo y para asegurar que la lesión de interés se genera eficientemente. Por ejemplo, PARP1 y XRCC1 pueden funcionar como marcadores para SSB y reparación de la supresión de la base, XPA es un buen indicador de la reparación de la supresión del nucleótido y 53BP1 se reclutarán a distritales y función en no homólogas extremo-(referencias23,25 ,27,28). Anticuerpos que reconocen modificaciones asociados con tipos específicos de daño en el ADN también pueden usarse para cuantificar los niveles de ADN aductos o se rompe. Así es posible vigilar bases oxidadas, cyclopyrimidine dímeros, 6-4 PPs, SSBs (utilizando anticuerpos de poli-ADP-ribosa) y distritales (γ-H2A.X y 53BP1) por IF y determinar los parámetros que logren el más alto nivel de las lesiones deseado23, 27 , 29. con supervisión cuidadosa, los usuarios deben ser capaces de estudiar la vía de reparación de interés utilizando micro-irradiación.

En conjunto, el uso de la extensa microscopios confocales de escaneo láser equipada con líneas de láser de 405 nm para generar distritales localizadas, combinada con marcadores de daño de DNA específicas de la plataforma para clasificar los factores de mantenimiento del genoma y datos optimizados procesar con la ayuda del plugin de Fiji de análisis micro-irradiación, debe hacer el estudio de la dinámica de factores DDR más accesible que nunca antes tanto experimentado y los investigadores noveles del campo de mantenimiento del genoma.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por las ciencias naturales y Consejo de investigación de ingeniería de Canadá [descubrimiento subsidio 5026 h] y por una nueva generación de científicos de la sociedad de investigación del cáncer [21531 a A.M]. Agradecemos a Jean-François Lucier para proporcionar control de calidad excelente de los scripts de Python de Fiji y asesoramiento en análisis estadístico. Damos las gracias por la receta de solución de fijación IF Dr. Stephanie A. Yazinski. Agradecemos a Paul Ludovic Karsenti ayuda con medidas de potencia láser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope Olympus
FluoView FV3000 software (version 2.1) Olympus
405 nm laser Coherent Radiation source
Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 Okolab OKO-UNO-1
60X /1.4 Objective Olympus Oil immersion objective
8-well culture slides on coverglass (X-well) Sarstedt 94.6190.802
U2OS osteosarcoma human cell line ATCC HTB-96 Stable cell lines 
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) ThermoFisher D1306 Caution toxic
5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)  Sigma-Aldrich 59-14-3
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4 Caution toxic
Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) ThermoFisher 62249
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher BP1600-100
Trypsin EDTA 0.1%  ThermoFisher 15400-054
Triton X-100  BioShop TRX777.100
Tween-20  ThermoFisher BP337-500
Sucrose  BioShop SUC507
JetPRIME transfection reagent  Polyplus 114-07
ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI  ThermoFisher P36962
DMEM 1X, + phenol red Wisent  319-005-CL
DMEM 1X, - phenol red Wisent 319-051-CL
Fetal bovine serum (FBS) Wisent  080-150
Mouse anti-RPA32 antibody Abcam ab2175 1:500 for IF
Rabbit anti-γ-H2A.X antibody Cell Signaling  9718S 1:500 for IF
Rabbit Anti-53BP1 antibody Cell Signaling  4937S 1:500 for IF
Rabbit Anti-PRP19 antibody Abcam ab27692 1:500 for IF
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 Cell Signaling  4414S 1:250 for IF
Goat anti-mouse  IgG Alexa Fluor 488  Cell Signaling  4408S 1:250 for IF
Fiji image analysis open-source software  https://fiji.sc
1918-K Power meter  with a 918D-SL-0D3 sensor Newport

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References

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Gaudreau-Lapierre, A., Garneau, D., Djerir, B., Coulombe, F., Morin, T., Marechal, A. Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation. J. Vis. Exp. (133), e57410, doi:10.3791/57410 (2018).

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