Summary
وترد أساليب بسيطة لما أبدته من إنتاج أميلويدس السامة للخلايا بعد إصابة بطانة الرئوية الزائفة الزّنجاريّة.
Abstract
المرضى الذين ينجون من الالتهاب الرئوي يكون ارتفاع معدلات الوفاة في الأشهر التي أعقبت التخريج من المستشفى. قد تم الافتراض بأن العدوى للأنسجة الرئوية أثناء الالتهاب الرئوي يؤدي إلى إنتاج cytotoxins المعمرة التي يمكن أن تؤدي إلى فشل اللاحقة نهاية الجهاز. وقد وضعنا في المختبر فحوصات لاختبار الفرضية القائلة بأن تنتج cytotoxins أثناء الإصابة الرئوية. تستخدم الخلايا غشائي الرئة الفئران المعزولة وبكتيريا الزائفة الزّنجاريّة كنظم نموذجية، وإنتاج سيتوكسينس بعد الإصابة بالخلايا البطانية من البكتيريا هو أثبت استخدام زراعة الخلايا التي تليها كوانتيتيشن المباشر باستخدام فحوصات نازعة لاكتات وطريقة مجهرية جديدة استخدام تكنولوجيا إيماجيج. كان تبين طبيعة هذه cytotoxins اميلويد فحوصات ملزمة تي ثيوفلافين وإيمونوبلوتينج وإيمونوديبليشن باستخدام الأجسام المضادة اميلويد A11. أظهرت تحليلات أخرى باستخدام إيمونوبلوتينج أن تاو oligomeric و Aβ أنتجت وصدر عن خلايا بطانية بعد الإصابة من P. الزّنجاريّة. يجب أن تكون هذه الطرق القابلة للتكييف وفقا لتحليلات للعينات السريرية البشرية.
Introduction
المرضى الذين ينجون من الالتهاب الرئوي يكون ارتفاع معدلات الوفاة في الأشهر التي تلت المستشفى تصريف1،2،،من34،،من56. وفي معظم الحالات، تحدث الوفاة بنوع من الفشل نهاية الجهاز بما في ذلك الكلي، الرئة، القلب، أو أحداث الكبد، فضلا عن السكتة الدماغية5،6. والسبب في ارتفاع معدل الوفيات في هذا المريض السكان أنشأ ابدأ.
ويصنف الالتهاب الرئوي أما يجري اكتسب المجتمع أو المكتسبة في المستشفى (المستشفيات)، والعوامل التي يمكن أن تسبب الالتهاب الرئوي وتشمل البكتيريا والفيروسات والفطريات والمواد الكيميائية. واحد من الأسباب الرئيسية لالتهاب رئوي المستشفوي هو بكتيريا الزائفة الزّنجاريّة. P. الزّنجاريّة هو كائن الغرام الذي يستخدم نظام إفراز نوع الثالث لنقل مختلف الجزيئات المستجيب، يسمى اكسونزيميس، مباشرة إلى السيتوبلازم للخلايا الهدف7،8. خلال عدوى خلايا غشائي الرئة، اكسونزيميس استهداف مختلف البروتينات داخل الخلايا، بما في ذلك شكل من أشكال بطانية من البروتينات المرتبطة microtubule تاو9،10،11،12 ، مما أدى إلى انهيار حاجز غشائي الناتجة في ذمة رئوية حادة، انخفضت وظائف الرئتين، وفي كثير من الأحيان، الموت.
وكما ذكر سابقا، المرضى الذين ينجون من الالتهاب الرئوي الأولى يكون ارتفاع معدلات الوفاة في الأشهر ال 12 الأولى بعد التخريج من المستشفى. إليه ممكنة لتفسير هذه الظاهرة هو أن يتم إنشاء نوع من السمية طويلة الأمد خلال العدوى الأولية التي تؤدي إلى سوء نتائج طويلة الأجل. ملاحظتان تدعم هذه الإمكانية. تفشل خلايا غشائي الرئة أولاً، مثقف التي تعامل في البداية مع P. الزّنجاريّة تنتشر لتصل إلى أسبوع بعد قتل البكتيريا بالمضادات الحيوية من13. ثبت البريونات ثانيا، المعمرة والوكلاء مع الخصائص بريون في مختلف الأمراض البشرية والحيوانية، لا سيما الأمراض المرتبطة بال14،العصبي15.
وقد وصف أساليب لدراسة إمكانية إنتاج العوامل السامة للخلايا المعمرة خلال العدوى الرئوية ابدأ. ويرد هنا سلسلة من فحوصات بسيطة في المختبر التي يمكن استخدامها للتحقيق في إنتاج سيتوتوكسين والنشاط بعد الإصابة باستخدام مشتركة الالتهاب رئوي تسبب عامل, P. الزّنجاريّة. ينبغي أن تكون هذه الاختبارات القابلة للتكييف وفقا للتحقيق التعريفي سيتوتوكسين ممكن بعد الإصابة باستخدام العوامل الأخرى التي تسبب الالتهاب الرئوي، وسوبيرناتانتس التي يتم إنشاؤها أيضا ينبغي أن تكون مفيدة للتحقيق في آثار سيتوتوكسينس في الجامعة الأجهزة أو الحيوانات. أخيرا، سوف تكون الاختبارات التي ترد هنا على الأرجح قابلة للتكيف لاختبار السوائل البيولوجية الحيوانية والبشرية لإنتاج cytotoxins أثناء الالتهاب الرئوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
واستعرضت جميع الإجراءات الحيوان ووافق المؤسسية ولجنة العناية بالحيوان من جامعة ألاباما جنوب وأجريت وفقا لجميع اللوائح الاتحادية والولائية والمحلية. تم الحصول على الثقافات الأولية من الفئران خلايا بطانية ميكروفاسكولار الرئوية (بمفيكس) من "مرفق خلية الثقافة الأساسية" في مركز جامعة ألاباما جنوب "البيولوجيا الرئة". وتم إعداد الخلايا استخدام الإجراءات الموصوفة سابقا16.
1-جيل سوبيرناتانتس السامة للخلايا
ملاحظة: هنا، يمكننا استخدام اثنين من سلالات مختلفة من P. الزّنجاريّة: PA103، الذي يحتوي على نوع سليمة الثالث إفراز نظام قادر على نقل اكسونزيميس أكسو، وعزة إلى الخلايا المستهدفة خلال العدوى، و ∆PcrV، الذي يفتقر إلى نوع نظام إفراز الثالث وهو غير قادر على نقل اكسونزيميس إلى خلايا الهدف بعد التطعيم.
- متتالية البكتيريا على لوحات أجار بونر فوغل (VB)17 وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- لإعداد لوحات، جعل حل الأسهم التالية (أملاح بونر فوجل؛ الأسهم x 10): قياس ز 2 MgSO4، ز 20 حمض الستريك (حمض الحرة)، 100 غ ك2بو4و 35 ز نة2بو4. إضافة ddH2س 1 لتر والاوتوكلاف لمدة 15 دقيقة مع العادم بطيئة.
- ضع أجار ز 7.5 في 450 مل ddH2س والاوتوكلاف المذكورة أعلاه.
- بعد التعقيم، ضع كل الحلول في حمام مائي 50 درجة مئوية لتبرد.
- إضافة 50 مل من محلول الملح الأسهم 10 في x VB لاجار.
- إضافة كاربينيسيلين إلى 400 ميكروغرام/مل (للسلالات من P. الزّنجاريّة المستخدمة)، ومزيج جيد من قبل يحوم في قارورة.
- مل 5 مكان الحل أجار VB في الأطباق الفردية الثقافة العقيمة، والسماح لاجار لترسيخ وتخزينها ثم في 4 درجات مئوية حتى اليوم من البذر البكتيرية.
- في يوم البذر البكتيرية، قبل الحارة صفيحة إلى 37 درجة مئوية ومتتالية ثم البكتيريا على لوح استخدام حلقة عقيمة. مكان اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- التحقق من النقاء بمفيك تلطيخ إيجابية مع نيون سيمبليسيفوليا جريفونيا يكتين وتلطيخ السلبية مع نيون بوماتيا اللولب يكتين (علامة لخلايا بطانية الشرياني). خلايا الكوة والتجميد في النيتروجين السائل.
- للتجارب، والحفاظ على الخلايا في المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين، وتنمو خلايا في حاضنة 37 درجة مئوية التي تحتوي على 5% CO2. استخدام الخلايا في الفقرات 5-15.
- لجيل سوبيرناتانتس السامة للخلايا، لوحة 2 × 106 خلايا في الأطباق الفردية 150 سم وتنمو لمدة 3-4 أيام حتى يتم تحقيق التقاء. استخدام لوحات اثنين كل تجربة (انظر أدناه).
- لتحليل سوبيرناتانتس السامة للخلايا، طبق بلايت 1 × 105 خلايا في الآبار الفردية من 6-بئر وتنمو لمدة أربعة أيام حتى يتم تحقيق التقاء.
- لإنتاج المادة طافية، يغسل واحدة من أطباق سم 150 اثنين من بمفيكس من الخطوة 1.3.1 مع الفوسفات مخزنة المالحة، تريبسينيزي، وثم عد الخلايا (نحن استخدام عداد الآلي خلية واتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة؛ انظر الجدول للمواد). أغسل الطبق الأخرى من بمفيكس مع موازنة الملح الحل (حبس هانك) وتصيب ثم مع أما سلالة من P. الزّنجاريّة في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 20:1. ويتحقق ذلك على النحو التالي:
- P. الزّنجاريّة، التطوير التنظيمي540 0.25 = 2 × 108 كفوس مليلتر. لإعداد هذا التخفيف، إضافة 1 مل حبس إلى 1 مل ومبومو المتاح. تتخلص من البكتيريا كافية الخروج من اللوحة التي أعدت في الخطوة 1، 1 حتى يتم تحقيق التطوير التنظيمي540 من 0.25 عندما تقاس باستخدام جهاز المطياف الضوئي. الخطوة التالية سوف توفر حساب كم ستكون هناك حاجة البكتيريا.
- حالما يتم تحديد العدد بمفيكس في الطبق الثقافة (الخطوة 1، 4 أعلاه)، تحديد العدد المناسب من البكتيريا المراد إضافتها إلى الطبق الثاني، غير تريبسينيزيد والثقافة التي تحتوي على بمفيكس. على سبيل المثال، إذا ما تقرر أن طبق الثقافة بمفيكس تحتوي على 1.3 × 107 الخلايا، ثم إعداد 1.3 × 107 خلايا x 20 البكتيريا/خلية x 1 مل/2 × 108 كفوس = 1.3 مل البكتيريا.
- تمييع مل 1.3 من البكتيريا إلى حبس لوحدة تخزين نهائي من 20 مل، حيث أن كامل سطح صحن 150 سم يمكن تغطيتها بسائل، ثم إضافة البكتيريا المخفف اللوحة بمفيكس.
- احتضان بمفيكس تلقيح مع البكتيريا في 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة ح 4-5، حتى يمكن رؤية الثغرات تشكيل في أحادي الطبقة الخلية عندما يلاحظ اللوحة مجهريا (انظر الشكل 1 للمستوى المناسب لتكوين الفجوة).
- جمع المادة طافية، ثم الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 2,000 ز العاشر في أجهزة الطرد مركزي منضدية لإزالة الحطام الخلوية.
ملاحظة: أي قادرة على توليد ز كافية للطرد المركزي الجدول أعلى قوة لبيليه أونليسيد الخلايا والخلايا الكبيرة الشظايا التي يمكن استخدامها لهذه الخطوة. - من أجل المادة طافية في محقن يحتوي على فلتر 0.2 ميكرون يعلق على نهايته، ثم تمرير المادة طافية من خلال عامل التصفية لإزالة البكتيريا.
- استخدام قاسمة من المادة طافية العقيمة لاختبار سيتوتوكسيسيتي (انظر 2.1) وتجميد بقية المادة طافية في-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
2-تحليل سوبيرناتانتس السامة للخلايا
- تحليل سيتوتوكسيسيتي
- النمو بمفيكس في أطباق 6-جيدا حتى التقاء. آبار المياه والصرف الصحي مرة واحدة مع حبس، ثم إضافة 1.5 مل من المادة طافية تعقيم التصفية (التي تم جمعها من الخلايا أما طعمت PA103 أو ∆PcrV) إلى الآبار الفردية. إضافة حبس العقيمة إلى بئر أخرى كعنصر سلبي.
- ضع اللوحة في حاضنة2 CO ح 21-24، ثم مراقبة للخلية قتل/سيتوتوكسيسيتي (انظر الخطوة التالية). استخدام سوبيرناتانتس الذي يحمل سيتوتوكسيسيتي لمزيد من التجريب، وتجاهل تلك التي لا تظهر قتل الخلية.
- كوانتيتيشن لقتل الخلايا
- وأوصى قياس لاكتات نازعة (رابطة حقوق الإنسان) الإصدار من الخلايا الميتة باستخدام "مجموعات المقايسة رابطة حقوق الإنسان" متاحة تجارياً والشركة المصنعة للإجراءات.
- وبدلاً من ذلك، التحديد الكمي لقتل الخلايا مجهريا باستخدام البرمجيات إيماجيج. لذلك، سجل الصور المجهرية ومجالات الثقافة الطبق الذي يحتوي على خلايا سليمة، ثم تحديد حجم المناطق التي تفتقر إلى الخلايا (يدل على موت الخلايا في أحادي الطبقة) باستخدام ماكرو إيماجيج (المعاهد الوطنية للصحة) مخصص (انظر "ملف الترميز التكميلية" ). إذا رغبت في ذلك، القيام بالخطوات الماكرو يدوياً كما يلي:
- إدخال الصور (تنسيق RGB أو Tiff) في الماكرو وضبط التباين إلى 15 ٪ المشبعة بكسل. تكرار الصور ضبط التباين وقم بتنفيذ الأمر "طرح الخلفية" للحصول على صورة عالية التباين للمنطقة كل من الخلية والفجوة داخل مجال الرؤية.
- طرح هذه الصورة من الصورة الأصلية، والجمع بين الصورة الناتجة مع الصورة الأصلية باستخدام الحاسبة الصورة الدالة "AND". تحويل الصورة الناتجة إلى الأسود (الثغرات) وقناع أبيض (الخلايا) باستخدام الدالة عتبة (الحد الأدنى 0, 5 كحد أقصى)، واستخدام الدالة "تآكل ثنائي" لإزالة الضجيج من الصورة.
- قياس النسبة الأسود إلى الأبيض بكسل داخل الصورة الناتجة باستخدام قياس "منطقة الكسر". الأرض والتعبير عن المجالات كسرى لكل نقطة وقت المعالجة في المئة من مساحة الفجوة القصوى.
- حساب الوسائل ومقارنة استخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار توكي للمخصص بعد، مع قيم p أقل من 0.05 تعتبر هامة.
- استخدام تحليل إيمونوبلوت لإثبات وجود اميلويد وتأو oligomeric Aβ في supernatants ثقافة. إجراء تحليل إيمونوبلوت باستخدام إجراءات معيارية10،11،12، باستثناء التركيز supernatants ثقافة الوقت على الأقل قبل التفريد.
- تركيز المادة طافية، ضع 1-2 مل من المادة طافية في وحدة الطرد المركزي تصفية الأغشية التي قد وقف وزن الجزيئي كاتشين 10. ثم، ضع وحدة التصفية إلى الجدول أعلى أجهزة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في العاشر 2,000 حقق ز حتى الدرجة المطلوبة من التركيز (عادة ما تكون 45-60 دقيقة).
- تحديد كمية البروتين في طافية تتركز11 وتحميل كميات متساوية من العينات في الآبار الفردية من الجل.
- تشغيل المواد الهلامية، ونقل البروتينات إلى النيتروسليلوز، ثم التحقيق البقع مع A11 اميلويد المضادة الأجسام المضادة، T22 تاو oligomeric المضادة الأجسام المضادة، أو جسم Aβ مكافحة MOAB2 تليها الأجسام المضادة الثانوية المناسبة. وضع البقع استخدام الإجراءات القياسية تشيميلومينيسسينسي.
- القيام به ثيوفلافين "ر المقايسة"، استخدام الفلورية ثيوفلافين تي (تي إتش تي) لقياس أميلويدس في سوبيرناتانتس. لهذه القياسات، استخدام تصفية تعقيم سوبيرناتانتس.
- إعداد حل أسهم (50 س) ثيوفلافين ر تعليق 8 ملغ ثيوفلافين تي (تي إتش تي) إلى 10 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). بعد خلط، تصفية الحل من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرون لإزالة الجسيمات.
- للقياسات، إضافة 20 ميليلتر من مخزون تي إتش تي إلى 1 مل من برنامج تلفزيوني في ومبومو جهاز المطياف الضوئي 1 مل. ضع العينة المخففة في سبيكتروفلوريميتير.
- قياس انبعاثات خط الأساس fluorescence استخدام 425 نانومتر الإثارة ومسح انبعاث الأسفار من شمال البحر الأبيض المتوسط 450-575 2 نانومتر زيادات.
- إجراء فحص الوقت الفاصل بين استخدام 425 نانومتر الإثارة واكتسب 482 نانومتر الانبعاثات، مع بيانات كل 0.2 s ل 60 ثانية.
- 20 الأولى s للمسح الضوئي الوقت الفاصل بين التدابير fluorescence في ومبومو فارغة. في 20 s، إيقاف المسح الضوئي، وإضافة 10 ميليلتر من المادة طافية تعقيم عامل التصفية إلى ومبومو. مزيج ومبومو واسطة انعكاس ومن ثم ضع مرة أخرى إلى سبيكتروفلوريميتير.
- استئناف المسح الضوئي المستندة إلى الوقت، الحصول على 40 نهائي دا بيانات.
- عند الانتهاء من المسح الضوئي الوقت الفاصل، إجراء فحص طيف انبعاث fluorescence نهائي باستخدام إعدادات متطابقة، كما هو مفصل في 2.1.5.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد وضعت مقايسة بسيطة في المختبر الاعتداء على وجود سيتوتوكسينس في supernatants الخلايا المصابة ببكتيريا P. الزّنجاريّة. أساسا، تجمع الثقافة المتوسطة من الخلايا المصابة ح 4 بعد إضافة البكتيرية، تتم إزالة البكتيريا بالتعقيم تصفية الثقافة طافية، وثم يتم إضافة المادة طافية العقيمة لعدد جديد من الخلايا. ثم يلاحظ الخلايا ح 21-24 بعد إضافة المادة طافية وقتل الخلية هو كمياً.
من P. الزّنجاريّة ، بالإضافة إلى طبقات متموجة من بمفيكس الحث على تكوين الفجوات بين الخلايا. و في فيفو، تشكيل فجوة يؤدي إلى وذمة الرئة وانخفاض وظائف الرئة. في وصف المقايسة، يستخدم تكوين الفجوة كما هو مشار إليه الوقت النقطة للفحص لإطلاق سيتوتوكسين في supernatants ثقافة الخلية ومدة تكفي للحضانة مع PA103 بوجود الثغرات التي تبدأ بشكل أحادي الطبقة خلية كما هو موضح في الشكل 1. حمل البكتيريا ΔPcrV لا فجوات الخلية في ظل هذه الظروف الحضانة. وبمجرد اكتشاف الثغرات، المادة طافية من جمعها وتعقيمها والتصفية وثم تضاف إلى السذاجة بمفيكس لتقييم نشاط السامة للخلايا. بمفيكس في سوبيرناتانتس كل منها على ثم يتم وضعها في حاضنة ح 21-24، ثم لاحظ وتصويرها. كما هو مبين في الشكل 2، الواردة المادة طافية المجمعة من بمفيكس التي قد أصيبوا بالعدوى بسلالة P. الزّنجاريّة PA103 سيتوتوكسينس التي تحدثها موت الخلايا المستزرعة ح 21 بعد إضافة المادة طافية. على النقيض من ذلك، لم يلاحظ أي موت الخلية في مراقبة الخلايا تعامل مع أما المتوسطة حبس أو مع المادة طافية جمعت من سلالة ΔPcrV من Pseudomonas. تحليل Immunoblot أثبت أن جزيئات اميلويد، بما في ذلك أوليجوميريك تاو و Aβ، يتم إنشاؤها أثناء الإصابة بسلالة PA103، بينما لا أميلويدس يتم إنشاؤها بواسطة سلالة ΔPcrV عقب تطعيم بمفيكس (الشكل 2). أكدت إيمونوديبليشن أميلويدس من المادة طافية قبل إضافة إلى الخلايا المستزرعة12دور أميلويدس بوصفها سيتوتوكسينس في هذا التحليل. على الرغم من أن لا يظهر هنا، إيمونوديبليشن من المادة السامة للخلايا طافية استخدام A11 اميلويد المضادة الأجسام المضادة وجسم أوليجومير تاو المضادة T22 تماما يستنزف نشاط السامة للخلايا من سوبيرناتانتس المنتجة في أعقاب الإصابة PA103 (بالكزون et al. عام 2017 12 وبالكزون et al.، في إعداد).
وقد وضعت طريقة مبتكرة وغير مكلفة وبسيطة للتحديد الكمي لقتل الخلية. لهذا التحليل، تم تكييف للسماح للقياس المباشر للمناطق في حقل مجهرية التي تفتقر إلى الخلايا (يدل على قتل الخلية) البرمجيات إيماجيج. تم التحقق من موثوقية هذا الأسلوب من المقارنة المباشرة بطريقة راسخة لقياس الخلية قتل، والإفراج عن رابطة حقوق الإنسان من الخلايا. كما هو موضح في الشكل 3، يمكن استخدام البرمجيات إيماجيج لتحويل مناطق حقل المجهرية التي تحتوي على خلايا للأبيض والمناطق التي تفتقر إلى الخلايا إلى الأسود. بعد ذلك، يمكن استخدام نسبة بسيطة من المساحات البيضاء إلى اللون الأسود لقياس قتل الخلية. عندما بدءاً أحادي الطبقة المتلاقية للخلايا، جميع المناطق في الحقل المجهري هم من البيض. ومع ذلك، قبل 18 ساعة بعد إضافة سوبيرناتانتس التي تحتوي على سيتوتوكسينس، يمكن اكتشاف الثغرات في أحادي الطبقة. مقدار المساحة للطبق ثقافة خالية من الخلايا ثم زادت بطريقة خطية حتى بعد إضافة المادة السامة للخلايا طافية ح 36. عند قياس الإفراج عن رابطة حقوق الإنسان، وقد تحققت نتائج متطابقة، مع رابطة حقوق الإنسان الإفراج يتم اكتشافه لأول مرة في ح 18 بعد إضافة المادة السامة للخلايا طافية. ثم زادت الإفراج عن رابطة حقوق الإنسان بطريقة خطية حتى تم قياس قتل الخلية القصوى في 36 ساعة بعد إضافة المادة طافية. وتم قياس القليل من موت الخلية في الخلايا تعامل مع المادة طافية جمعت من ΔPcrV تلقيح الخلايا (الشكل 3)، أو في الثقافات التي تعامل مع حبس ح 36.
يمكن قياس مقدار اميلويد أطلق سراحهم من الخلايا تعامل مع البكتيريا بقياس الأسفار تي إتش تي. الأسباب ملزمة أميلويدس تي إتش تي تحولاً كونفورماشونال في الجزيء وزيادة كثافة الأسفار. لهذا التحليل، يضاف إلى ومبومو ثيوفلافين ر والأسفار الأساس يقاس. ثم تم إيقاف تسجيل الأسفار بينما يتم إضافة قاسمة صغيرة من العينة. ومبومو ثم يتم إرجاعها إلى فلوريميتير والتغيير يتم تسجيل الانبعاثات الأسفار. كما هو موضح في الشكل 4، جمعت المادة طافية من الخلايا التي تم المحتضنة مع سلالة PA103 من اميلويد P. الزّنجاريّة الواردة كما يتضح من الزيادة في الانبعاثات الأسفار. على النقيض من ذلك، تفتقر المادة طافية من تلقيح مع سلالة ΔPcrV بمفيكس أميلويدس، كما يتبين من عدم وجود زيادة الأسفار.
الشكل 1. آثار إينولكوليشن P. الزّنجاريّة على مورفولوجيا بمفيك. أحادي الطبقة المتلاقية من بمفيكس قبل (أ) وبعد الإضافة (ب) من سلالة PA103 من P. الزّنجاريّةأربع ساعات. ثغرات يمكن أن يمكن رؤيتها بوضوح في المونولاير الخلية في الخلايا المصابة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. تحليل سوبيرناتانتس السامة للخلايا- الجزء [I]. صور الممثل للتحكم والخلايا المعالجة. تم علاج بمفيكس ح 21 مع المادة طافية التي تم الحصول عليها من خلايا تلقيح مع أما PA103 البكتيريا (ب) أو سلالة ΔPcrV (ج). كما كانت المحتضنة خلايا المراقبة ح 21 مع حبس المخزن المؤقت (A). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. جزء [II]. إيمونوبلوتس الممثل من supernatants جمعها من ΔPcrV (A) أو PA103 (ب) إصابة بمفيكس. وقد سبر البقع مع الأجسام المضادة ضد اميلويد (A11) أو تاو oligomeric (T22). Mr في كاتشين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. كوانتيتيشن لقتل الخلية. (أ) حقول مجهر الممثل من نقاط زمنية مختلفة (في ح بعد إضافة طافية) في المناطق التي للحقل الذي يحتوي على تفتقر خلايا تم تحويل وأما أبيض أو أسود، على التوالي، استخدام البرمجيات إيماجيج. نفس المرحلة تباين الصورة قبل التحويل يرد أيضا. بار = 100 ميكرومتر- (ب) مقارنة كوانتيتيشن خلية القتل باستخدام القياسية رابطة حقوق الإنسان الإفراج عن الفحص والتحليل إيماجيج. N = 4، * *ف < 0.05، * * *ف < 0.01. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. البيانات المقايسة fluorescence الممثل تي إتش تي- كانت متحمس الترعة الفارغة التي تحتوي على تي إتش تي في 425 نانومتر والانبعاثات ثم تم قياس fluorescence في 482 شمال البحر الأبيض المتوسط. جمعت fluorescence الخلفية عن 20 ثانية، ومن ثم المادة طافية من أما PA103-أو ΔPcrV-تلقيح بمفيكس أضيفت إلى الترعة. ثم سجلت الانبعاثات الأسفار لمدة 40 ثانية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وترد أساليب بسيطة في المختبر هنا، التي تسمح بالمظاهرات لتوليد أميلويدس السامة للخلايا أثناء الإصابة بالالتهاب رئوي التسبب في الكائن الحي. وتشمل هذه الأساليب خلية ثقافة الإنزيم سيتوتوكسيسيتي، إيمونوبلوتينج، كوانتيتيشن خلية القتل باستخدام الأسلوب المجهري الرواية، وربط تي إتش تي. أظهرت تحليلات العوامل السامة للخلايا أنهم اميلويد في الطبيعة(الشكل 2 و الشكل 4) ويحمل خصائص بريون12. جيل الجزيئات بريون السامة للخلايا أثناء الالتهاب الرئوي يقدم تفسيراً محتملة لمعدلات الوفيات المرتفعة لوحظت في الالتهاب الرئوي الباقين على قيد الحياة بعد التخريج من المستشفى. تجارب في التقدم باختبار هذه الإمكانية.
الحدث الرئيسي لجميع الدراسات وصف هو الجيل من المادة طافية السامة للخلايا، ويلزم النظر في اثنين من المتغيرات الهامة. أولاً، استخدمت بمفيكس في الفئران التجارب المحددة لكل خطوة الإصابة والفحص سيتوتوكسيسيتي. لم يجر التحقيق ما إذا كانت أنواع الخلايا الأخرى يمكن أن تستخدم لإنتاج سيتوتوكسينس بالتفصيل، ومن الممكن أن خلايا أخرى قد تكون قادرة على توليد supernatants السامة للخلايا بعد العلاج مع سلالات مختلفة من P. الزّنجاريّة. كما هو موضح، سيتوتوكسينس اميلويد في طبيعتها وتشمل تاو oligomeric و Aβ. قد يكون من المعقول أن نتوقع أن قد فعل أنواع الخلايا الأخرى التي تعبر عن البروتين اميلويد تاو و/أو بيتا لتوليد cytotoxins عقب التلقيح البكتيري، على الرغم من أن هذا الاحتمال يظل لفحصها. الإجراءات المحددة التي يمكن استخدامها لفحص ما إذا كان يمكن أن يتسبب أنواع الخلايا الأخرى لإنتاج أميلويدس السامة للخلايا بعد الإهانات المختلفة.
المتغير الثاني الهام في توليد سوبيرناتانتس السامة للخلايا من مدة العلاج بالبكتريا. فمن الضروري أن يسمح في الحضانة بمفيكس بالتقدم حتى يمكن رؤية الفجوات في أحادي الطبقة. تحديد الثغرات في أحادي الطبقة خلية هو اكسونزيميس إشارة قد تم حقنه بالبكتيريا Pseudomonas في السيتوبلازم الخلية المضيفة وأن اكسونزيميس تنشط، أسفر عن تراجع حدود الخلية (الشكل 1). أن تجربتنا أن نقطة وقت سحب حدود الخلية مؤشرا موثوقاً لإطلاق سيتوتوكسين في المادة طافية. ومن المغري للتكهن بأن هذين الحدثين مرتبطان كواحدة من أميلويدس السامة للخلايا التي يتم إصدارها تاو أوليجوميريك، وتعطل النشاط تاو النتائج في ديبوليميريزيشن ميكروتوبولي الذي يسهم في يتغير شكل الخلية. في التجارب حيث تم علاج أقل من مقدار الوقت المطلوب للحث على تشكيل الفجوة، تم الكشف عن القليل من اميلويد السامة للخلايا الناضجة.
الفحص سيتوتوكسيسيتي الموصوفة في هذه المخطوطة بسيط ويمكن الاعتماد عليها. يمكن أن يلاحظ بسهولة عن طريق الفحص المجهري موت الخلية وكمياً مباشرة من الصور المجهرية المسجلة. وقد استخدمت الأساليب الموضحة هنا حصرا لتقييم إنتاج سيتوتوكسين عقب العدوى من الفئران خلايا بطانية الرئوية مع P. الزّنجاريّة. يبدو من المرجح أن الإجراءات يمكن سهولة تكييفها وفقا لتقييم ما إذا كانت تنتج أميلويدس السامة للخلايا بعد الإصابة بالالتهاب الرئوي الأخرى تسبب العوامل، بما في ذلك على حد سواء المرتبطة بالمستشفيات البكتيريا والبكتيريا والفيروسات المسؤولة أنواع المكتسبة في المجتمع من الالتهاب الرئوي. وعلاوة على ذلك، استخدمت فقط الإجراءات التي تم الإبلاغ عنها لدراسة الجيل اميلويد السامة للخلايا خلال عدوى خلايا المستزرعة. خلية ثقافة نظام مصطنع، والإجراءات المذكورة هنا على الأرجح يمكن تكييفها وفقا لتقييم توليد cytotoxins أثناء الإصابة الرئوية من النماذج الحيوانية والبشرية المرضى. يمكن استخدام مجموعة من السوائل البيولوجية، مثل الغسل للفيسيولوجيا، من الحيوانات المصابة بالعدوى أو المرضى في نفس أنواع الاختبارات التي ذكرت هنا لتقييم ما إذا كان يتم إنشاء أميلويدس السامة للخلايا أثناء الإصابة بالعمليات المجراة. ومن الواضح أن مدد الحضانة مع البكتيريا قد تكون مختلفة تماما عندما تطعيم في الحيوانات، والغسل للفيسيولوجيا يجب أن يكون جمعها في نقطة الزمن متعددة لتحديد مدة العلاج في نهاية المطاف.
وقد أثبتت التحليلات Immunoblot أن أميلويدس موجودة في سوبيرناتانتس، بما في ذلك أوليجوميريك تاو و Aβ (الشكل 3). على الرغم من الإجراءات immunoblot القياسية، هناك خطوة أساسية يجب أن يتم قبل الشروع في تحليل إيمونوبلوت. على وجه التحديد، من الأهمية بمكان أن سوبيرناتانتس أن تتركز على الأقل عشرة إضعاف قبل إيمونوبلوتينج كما تبلغ اميلويد في المادة طافية الأمم المتحدة تتركز الحد الأدنى للكشف عن طريق تحليل إيمونوبلوت. كما ذكرت هنا، الطرد المركزي باستخدام أنابيب مجهزة بمرشح هو الطريقة المستخدمة بصورة روتينية لهذه الخطوة التركيز، ولكن يبدو من المعقول أن الأساليب الأخرى، مثل TCA هطول الأمطار، ستكون أيضا مفيدة لهذه الخطوة.
كوانتيتيشن خلية القتل باستخدام الصور تمثل تقدما هاما. حاليا الإجراءات المتاحة للتحديد الكمي لموت الخلية تعتمد على شراء مجموعات مكلفة إلى حد ما التي تسمح بقياس للإفراج عن رابطة حقوق الإنسان من الخلايا الميتة. والرزن الموصوفة هنا ينطوي على أي تكاليف كما ImageJ البرامج أحرار في تحميل من موقع المعاهد الوطنية للصحة. تكييف البرامج ImageJ بسيط يسمح قياس دقيق إلى حد ما لقتل الخلية. بيد أنه من الجدير بالذكر أن اثنين من التحف طفيفة تمت مصادفة أثناء أداء البروتوكول المحدد. المسألة الرئيسية أن أجزاء الخلية، مثل مجالات الاتصال المحورية، قد تبقى مرتبطة مع الطبق الثقافة كما تموت الخلايا. هذه الشظايا الخلية المتبقية يمكن الكشف عنها بواسطة الكاميرا، وتعطي مؤشرا مصطنعة التي تظل الخلايا في الطبق. على هذا النحو، فمن النادر أن قيمة 100% خلية القتل يتم الحصول عليها باستخدام هذا الإجراء.
نقطة ضعف في نظام مقايسة المبلغ عنها أن أميلويدس سيتوتوكسين في الإعداد لم يعرف تماما. على هذا النحو، من الصعب كوانتيتيشن. أليسا فحوصات يمكن استخدامها لتوفير مستويات مجموع من أميلويدس مختلفة، دون تقديم أي معلومات مفصلة عن الأنواع الفردية في كل إعداد. حتى فحوصات أكثر دقة، مثل الكتلة-المواصفات أو المختبر في توليف ليغومرات اميلويد، ويمكن تطويرها، أفضل ما يمكن للمرء القيام به في الوقت الحاضر هو أن تبدأ كل تجربة مع نفس العدد من الخلايا، واحتضان لنفس المدة، والتحقق من أن سيتوتوكسيسيتي يحدث في نفس المعدلات السابقة من الأعمال التحضيرية التي تم استخدامها. ويدخل الاختلاف من أي من قواعد راسخة إضافية من عدم اليقين.
ويرد في موجز، أساليب بسيطة في المختبر لإثبات إنتاج جزيئات اميلويد السامة بخلايا بطانية الرئة بعد الإصابة بعامل المسببة للالتهاب الرئوي. فحوصات موثوقة والمرجح أن يمكن تكييفها للكائنات الحية الأخرى واستخدام استخدام السوائل البيولوجية التي تم الحصول عليها من الحيوانات المصابة والمرضى البشرية. هذه الأساليب ستكون مفيدة لدراسات التحقيق في الآثار الطويلة الأجل للالتهاب الرئوي ووضع الآليات التي تؤدي إلى فشل الجهاز نهاية في المرضى بعد التخريج من المستشفى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا شيء للتقرير.
Acknowledgments
كان تمويل هذه البحوث في أجزاء من منح المعاهد الوطنية للصحة HL66299 للملخص والممولة من الميزانية العادية و SL، HL60024 للملخص، و HL136869 بوسط.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit anti beta amyloid | Thermo | 71-5800 | |
| A11 amyloid oligomer antibody | StressMarq | SPC-506D | |
| T22 anti-tau oligomer antibody | EMD Millipore | ABN454 | |
| Thioflavin T | Sigma Aldrich | T3516 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 0.22 micron syringe filters | Millipore | SLGP033RS | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| HRP Goat antirabbit IgG | Abcam | ab6721-1 | |
| Strains PA103 and ΔPcrV | These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI | ||
| FITC Griffonia lectin | Sigma Aldrich | L9381 | |
| TRITC Helix pomatia lectin | Sigma Aldrich | L1261 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| 0.22 micron nitrocellulose | BioRad | 162-0112 | |
| Type 2 collagenase | Worthington | LS004176 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30898.03IH | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| Carbenicillin Disodium salt | Sigma | C1389 | |
| Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off | Millipore | UFC801008 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496-500G | |
| Magnesium phosphate heptahydrate | MP Biomedicals | MP021914221 | |
| Citric Acid | G Biosciences | 50-103-5801 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9506-500G | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10277 |
References
- Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia. Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).
- Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia. Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).
- Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction. Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).
- Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia. Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).
- Yende, S., et al. Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis. Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease. J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).
- Frank, D. W. The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).
- Engel, J., Balachandran, P. Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).
- Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability. J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells. PLoS One. 8, e74343 (2013).
- Morrow, K. A., et al. Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids. FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).
- Stevens, T. C., et al. The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).
- Prusiner, S. B. Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions. Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).
- Hunter, N. Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches. Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).
- Marmont, L. S., et al. Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).
