Summary
Se describen métodos sencillos para la demostración de la producción de amiloides citotóxicos después de la infección del endotelio pulmonar por Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Los pacientes que sobreviven la neumonía han elevado las tasas de mortalidad en los meses después del alta hospitalaria. Se ha presumido que la infección del tejido pulmonar durante la neumonía los resultados en la producción de citotoxinas larga vida que puede llevar a insuficiencia del órgano de extremo posterior. Hemos desarrollado en vitro ensayos para probar la hipótesis que citotoxinas son producidos durante la infección pulmonar. Las células endoteliales pulmonares aislado de rata y la bacteria Pseudomonas aeruginosa se utilizan como sistemas modelo, y la producción de cytoxins después de la infección de las células endoteliales por la bacteria se demuestra mediante cultivo celular seguido por cuantificación directa mediante los análisis de lactato deshidrogenasa y un novedoso método microscópico utilizando tecnología de ImageJ. La naturaleza amiloide de estas citotoxinas fue demostrada por thioflavin T enlace ensayos y por immunoblotting y immunodepletion usando anticuerpo anti-amiloide de A11. Posteriores análisis mediante immunoblotting demostraron que los tau y Aβ se producida y liberada por las células endoteliales después de la infección por p. aeruginosa. Estos métodos deben ser fácilmente adaptables a los análisis de muestras clínicas humanas.
Introduction
Los pacientes que sobreviven la neumonía han elevado las tasas de mortalidad en los meses siguientes hospital descarga1,2,3,4,5,6. En la mayoría de los casos, la muerte se produce por algún tipo de insuficiencia de órgano, incluyendo renal, pulmonar, cardiaca, o hígados eventos como la carrera5,6. Nunca se ha establecido la razón de la elevada tasa de mortalidad en esta población de pacientes.
La neumonía se clasifica como siendo ya sea adquirida en la comunidad o adquirida en el hospital (nosocomial) y los agentes causantes de neumonía incluyen bacterias, virus, hongos y productos químicos. Una de las principales causas de neumonía nosocomial es la bacteria Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa es un organismo Gram-negativo que utiliza un sistema de secreción tipo III para transferir varias moléculas efectoras, como exoenzimas, directamente en el citoplasma de las células de destino7,8. Durante la infección de células endoteliales pulmonares, las exoenzimas objetivo diversas proteínas intracelulares, incluyendo una forma endotelial de la proteína asociada a microtúbulos tau9,10,11,12 , conduce a la ruptura de la barrera endotelial dando lugar a edema pulmonar severo, disminución de la función pulmonar y, a menudo, la muerte.
Como se indicó anteriormente, los pacientes que sobreviven la neumonía inicial han elevado las tasas de mortalidad en los primeros 12 meses después del alta hospitalaria. Un mecanismo potencial para explicar este fenómeno es que se genera algún tipo de toxina duradera durante la infección inicial que conduce a pobres resultados a largo plazo. Dos observaciones apoyan esta posibilidad. En primer lugar, cultivadas pulmonar las células endoteliales que son tratadas inicialmente con p. aeruginosa no proliferan por hasta una semana después de que las bacterias se destruyen con antibióticos13. Priones en segundo lugar, larga vida y agentes con las características del prión se han demostrado en varias enfermedades humanas y animales, particularmente las enfermedades asociadas con el sistema nervioso14,15.
Nunca se han descrito métodos para examinar el potencial de producción de agentes citotóxicos duraderos durante la infección pulmonar. Aquí se describen una serie de ensayos simples en vitro que puede utilizarse para investigar producción de citotoxina y actividad después de la infección con un agente que causa común de neumonía, p. aeruginosa. Estos ensayos deben ser fácilmente adaptables para investigar la inducción de la citotoxina posible después de la infección con otros agentes causantes de neumonía, y los sobrenadantes que se generan también deberían ser útiles para investigar efectos de citotoxinas en todo órganos o animales. Por último, los ensayos que se describen aquí es muy probable que será adaptables a prueba de fluidos biológicos humanos y animales para la producción de citotoxinas en neumonía.
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Protocol
Todos los procedimientos animales fueron revisados y aprobados por el Comité de cuidado del Animal de la Universidad de Alabama del sur e institucional y se realizaron conforme a las regulaciones federales, estatales y locales. Cultivos primarios de células endoteliales microvasculares pulmonar rata (PMVECs) se obtuvieron del fondo para el núcleo de la célula cultura en el centro de la Universidad de Alabama del sur para la biología del pulmón. Las células fueron preparadas usando procedimientos previamente descritos16.
1. generación de sobrenadantes citotóxicos
Nota: Aquí, utilizamos dos cepas diferentes de p. aeruginosa: PA103, que cuenta con un sistema de secreción de tipo intacto III capaces de transferir las exoenzimas ExoU y ExoT a células diana durante la infección y ∆PcrV, que carece de un tipo de sistema de secreción III y es incapaz de transferir exoenzimas a células de destino después de la inoculación.
- Bacterias en de placas de agar de Vogel-Bonner (VB)17 la raya y crecer durante la noche a 37 ° C.
- Para preparar platos, hacer la siguiente solución (sales de Vogel-Bonner, stock de x 10): medir 2 g de MgSO4, 20 g ácido cítrico (ácido libre), 100 g de K2PO4y 35 g NaH2PO4. Añadir ddH2O a 1 L y autoclave durante 15 min con escape lento.
- Coloque el agar 7,5 g en 450 mL ddH2O y autoclave como el anterior.
- Después de autoclavar, coloque ambas soluciones en un baño de agua de 50 ° C para enfriar.
- Añadir 50 mL de la solución de sal común de 10 x VB en el agar.
- Añadir carbenicilina a 400 μg/mL (para las cepas de p. aeruginosa se utiliza) y mezclar bien agitando el frasco.
- Lugar 5 mL de la solución de agar VB en platos de cultivo estériles individuales, permitir que el agar solidifique y luego almacenar a 4 ° C hasta el día de la siembra bacteriana.
- En el día de la siembra bacteriana, caliente previamente las placas a 37 ° C y luego la raya las bacterias en la placa con un asa estéril. Coloque el plato en una incubadora de 37 ° C durante la noche.
- Verificar la pureza PMVEC por la coloración positiva con fluorescente Griffonia simplicifolia lectinas y tinción negativa con fluorescentes lectina de Helix pomatia (un marcador de células endoteliales arteriales). Células de alícuotas y congelación en nitrógeno líquido.
- Para los experimentos, mantener las células en el medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal 10% y crecen las células en una incubadora de 37 ° C con 5% CO2. Utilizar células en pasajes 5-15.
- Para la generación de sobrenadantes citotóxicos, placa de 2 x 106 células en platos individuales de 150 cm y crecer durante 3-4 días hasta alcanza la confluencia. Utilice dos placas por experimento (véase abajo).
- Para el análisis de sobrenadantes citotóxicos, placa de 1 x 105 células en pocillos individuales de un pozo de 6 plato y creciendo durante cuatro días hasta alcanza la confluencia.
- Para producir el sobrenadante, lavar uno de los platos de dos de 150 cm de PMVECs de paso 1.3.1 con solución salina con tampón fosfato, trypsinize y luego contar las células (utiliza un contador de células automatizado y seguir el protocolo del fabricante; véase Tabla de materiales). Lavar el otro plato de PMVECs con de Hank equilibrada solución de sal (HBSS) y luego infectar con cualquier cepa de p. aeruginosa en una multiplicidad de infección (MOI) de 20:1. Esto se logra como sigue:
- Para p. aeruginosa, OD540 0.25 = 2 x 108 UFC/mL. Para preparar esta disolución, añadir 1 mL HBSS a una cubeta desechable de 1 mL. Raspar las suficientes bacterias de la placa que se preparó en el paso 1.1 hasta un OD540 de 0,25 se obtiene cuando se mide con un espectrofotómetro. El siguiente paso le proporcionará un cálculo de cuánto se necesitará las bacterias.
- Una vez que se determina el número de PMVECs en la placa de cultivo (paso 1.4 anterior), determinar el número apropiado de bacterias en el plato de segunda, no tripsinizaron cultura que contiene las PMVECs. Por ejemplo, si se determina que el plato de cultura de PMVECs contiene 1.3 x 107 células, entonces preparar 1.3 x 107 células x 20 bacterias/celular x 1 mL/de 2 x 108 UFC = bacterias 1,3 mL.
- Diluir el 1,3 mL de bacterias en HBSS hasta un volumen final de 20 mL, para que toda la superficie de un plato de 150 cm puede ser cubierto con el líquido, luego añadir las bacterias diluidas a la placa de PMVECs.
- Incubar los PMVECs inoculados con la bacteria a 37 ° C en un incubador 5% CO2 para 4-5 h, hasta que las lagunas se observan formando en la monocapa de células cuando la placa se observa microscópicamente (ver figura 1 para el nivel adecuado de formación del boquete).
- Recoger el sobrenadante y luego centrifugar por 10 min a 2.000 x g en una centrífuga de mesa para eliminar los desechos celulares.
Nota: Cualquier centrífuga de mesa capaz de generar g suficiente fuerza para que sedimenten las células unlysed y células grandes fragmentos se pueden utilizar para este paso. - Vierta el sobrenadante en una jeringa que tiene un filtro de 0.2 μm unido a su extremo, entonces pasar el sobrenadante a través del filtro para eliminar las bacterias.
- Utilizar una alícuota del sobrenadante estéril a prueba de citotoxicidad (ver 2.1) y congelar el resto del sobrenadante a-80 ° C para su uso futuro.
2. Análisis de sobrenadantes citotóxicos
- Ensayo de citotoxicidad
- Crecer PMVECs en pozo 6 platos hasta confluencia. Pozos de lavado una vez con HBSS, luego añadir 1,5 mL de sobrenadante esterilizado por filtro (recogido de cualquier células inoculadas PA103 o ∆PcrV) a pocillos individuales. Añadir HBSS estéril a otro así como control negativo.
- Coloque la placa en la incubadora de CO2 por 21-24 h, y luego observar para matar/citotoxicidad celular (ver siguiente paso). Utilice sobrenadantes que exhiben citotoxicidad para más experimentación y descartar aquellos que no muestran la muerte de la célula.
- Cuantificación de la matanza de la célula
- Liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) medida de las células muertas utilizando comercialmente disponibles Kits de análisis de LDH y de fabricante procedimientos recomendados.
- Por otra parte, cuantificar muerte celular microscópico utilizando el software ImageJ. Para esto, grabar imágenes microscópicas y las áreas de la placa de cultivo que contiene las células intactas, luego cuantificar las regiones que carecen de células (indicativas de muerte celular en una monocapa) utilizando una macro personalizada de ImageJ (institutos nacionales de salud) (véase archivos de codificación complementarios ). Si lo desea, realizar los pasos de la macro manualmente como sigue:
- Entrada de imágenes (en formato RGB o Tiff) en la macro y ajustar el contraste de los píxeles 15% saturado. Duplicar imágenes ajustar contraste y realizar el comando "quitar fondo" para obtener una imagen de alto contraste de célula y espacio dentro del campo de visión.
- Reste esta imagen de la imagen original y la imagen resultante con la imagen original utilizando la calculadora de imagen "Y" la función se combinan. Convertir la imagen resultante a negro (gaps) y máscara blanca (células) con la función de umbral (mínimo 0, máximo 5) y utilizar la función "binario erosionar" para eliminar el ruido de la imagen.
- Medir la relación del negro al blanco píxeles de la imagen resultante utilizando la medida de "fracción de área". Parcela y expresar áreas fraccionarias para cada punto de tiempo de tratamiento como por ciento del área de separación máxima.
- Medios de calcular y comparar utilizando unidireccional ANOVA con prueba post-hoc de Tukey, con valores de p menor de 0,05 considerado significativo.
- Utilice el análisis de immunoblot para establecer la presencia de amiloide, tau oligomérica y Aß en sobrenadantes de cultivo. Realizar el análisis de immunoblot usando procedimientos estándar10,11,12, excepto para concentración de sobrenadantes de cultivo por lo menos 10 veces antes de la electroforesis.
- Para concentrar el sobrenadante, coloque 1-2 mL de sobrenadante en una unidad de filtro de centrifugación cuya membrana tiene un corte de peso molecular de 10 kDa. Luego, coloque la unidad de filtro en una centrífuga de mesa y centrifugar a 2.000 x g hasta el grado necesario de concentración es logra (normalmente 45-60 min).
- Determinar la cantidad de proteína en el sobrenadante concentrado11 y cargar cantidades iguales de muestras en los pocillos del gel.
- Correr los geles, las proteínas de transferencia a nitrocelulosa, luego probe borrones con A11 del anticuerpo anti-amiloide, anticuerpos de anti-oligomeric tau T22 o anticuerpo de anti-Aß MOAB2 seguida de anticuerpos secundarios apropiados. Desarrollar el Blot usando procedimientos estándar de la quimioluminescencia.
- Para hacer un thioflavin T ensayo, usar fluorescencia de tioflavina T (ThT) para cuantificar amiloides en sobrenadantes. Para estas mediciones, utilizar sobrenadante esterilizado por filtro.
- Prepare una solución (x 50) de tioflavina T suspendiendo tioflavina T (ThT) de 8 mg en solución salina 10 mL tamponada fosfato (PBS). Después de mezclar, filtrar la solución a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar partículas.
- Para las medidas, añadir 20 μl del stock de ThT a 1 mL de PBS en una cubeta del espectrofotómetro 1 mL. Coloque la muestra diluida en un espectrofluorímetro.
- Medir la emisión de fluorescencia basal utilizando excitación nm 425 y exploración de la emisión de fluorescencia de 450-575 nm en 2 incrementos de nm.
- Realizar un time-lapse análisis mediante excitación nm 425 y 482 emisión nm, con los datos adquiridos cada 0.2 s 60 s.
- La inicial 20 s del time-lapse análisis medidas de fluorescencia en la cubeta en blanco. A los 20 s, pausar el análisis y añadir 10 μl del sobrenadante esterilizado por filtro a la cubeta. La cubeta la mezcla por inversión y luego vuelva a colocar el espectrofluorímetro.
- Reanudar el análisis basado en el tiempo, adquirir el final 40 s de datos.
- Al finalizar el scan Time-lapse, realizar un análisis de espectro de emisión de fluorescencia final con ajustes idénticos, como se detalla en 2.1.5.3.
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Representative Results
Un análisis simple en vitro ha sido desarrollado para analizar la presencia de citotoxinas en sobrenadantes de células infectadas con la bacteria p. aeruginosa. Básicamente, medio de cultivo de las células infectadas se recogen 4 h después de la adición de bacteria, las bacterias se eliminan por la esterilización del filtro de la cultura sobrenadante y luego se añade el sobrenadante estéril a una nueva población de células. Las células luego se observan 21-24 h después de la adición del sobrenadante y se cuantifica la muerte de la célula.
Además de p. aeruginosa a capas confluentes de PMVECs inducen la formación de espacios entre las células. In vivo, formación del boquete conduce a edema pulmonar y disminución de la función pulmonar. En el análisis descrito, formación del boquete se utiliza como el punto de tiempo para la detección de citotoxina lanzamiento en sobrenadantes de cultivo celular y suficiente duración de la incubación con PA103 se indica por la presencia de las lagunas que comienzan a formarse en la monocapa celular como se muestra en Figura 1. ΔPcrV bacterias no inducen boquetes de la célula en estas condiciones de incubación. Una vez que se detectan deficiencias, el sobrenadante es recogido, filtro esterilizado y agregan a la ingenua PMVECs para evaluar la actividad citotóxica. El PMVECs en sus respectivos sobrenadantes luego son colocados en una incubadora durante 21-24 h, observados y fotografiados. Como se muestra en la figura 2, sobrenadante de PMVECs que habían sido infectados con p. aeruginosa cepa PA103 contiene citotoxinas que induce muerte de células cultivadas por 21 h después de la adición del sobrenadante. En cambio, no hay muerte celular fue observada en células control tratadas con cualquier medio HBSS o con sobrenadante de la cepa ΔPcrV de Pseudomonas. El análisis de Immunoblot demostró que las moléculas, incluyendo los tau y Aβ, se generan durante la infección con la cepa PA103, mientras no amiloides son generados por la cepa de ΔPcrV después de la inoculación de PMVECs (figura 2). El papel de amiloides como citotoxinas en este ensayo ha sido confirmado por immunodepletion de amiloides de sobrenadante antes de la adición a las células cultivadas12. Aunque no se muestra aquí, immunodepletion de citotóxico sobrenadante utilizando anticuerpo anti-amiloide de A11 y anticuerpos anti-tau oligómero de T22 totalmente consume la actividad citotóxica de sobrenadantes producidos después de la infección PA103 (Balczon et al. 2017 12 y Balczon et al., en preparación).
Se ha desarrollado un método novedoso, barato y sencillo de cuantificación de la matanza de la célula. Para este análisis, software ImageJ ha sido adaptado para permitir la medición directa de áreas en un campo microscópico que carecen de células (indicativas de muerte celular). La fiabilidad de este método ha sido verificada por comparación directa con el método bien establecido de célula matando, que es la liberación LDH de células de medición. Como se muestra en la figura 3, puede utilizarse software ImageJ para convertir de un campo microscópico que contienen las células blanco y regiones que carecen de células al negro. Entonces, una simple relación de áreas blancas con negro puede utilizarse para medir la muerte celular. Cuando a partir de una monocapa confluente de células, todas las regiones del campo microscópico son de color blancas. Sin embargo, por 18 h después de la adición de sobrenadantes que contienen citotoxinas, se pudieran detectar brechas en la monocapa. La cantidad de área de la placa de cultivo carente de células luego aumentado de forma lineal hasta además después de 36 h del sobrenadante citotóxico. Al medir la liberación LDH, se obtuvieron resultados idénticos, con liberación LDH, detectándose en primer lugar a las 18 h después de la adición del sobrenadante citotóxico. Liberación LDH luego aumentó de forma lineal hasta que la muerte celular máxima se midió a 36 h después de la adición del sobrenadante. Pequeña muerte celular se midió en células tratadas con sobrenadante de células ΔPcrV inoculada (figura 3) o en cultivos tratados con HBSS para 36 h.
La cantidad de amiloide de las células tratadas con bacterias puede cuantificarse midiendo la fluorescencia ThT. Unión de amiloides para ThT provoca un cambio conformacional en la molécula y un aumento en la intensidad de la fluorescencia. Para este ensayo, thioflavin T se agrega a una cubeta y se mide la fluorescencia basal. La grabación de la fluorescencia entonces se detiene mientras se agrega una pequeña alícuota de muestra. La cubeta se volvió a la Fluorímetro y el cambio es la emisión de fluorescencia se registra. Como se muestra en la figura 4, recogimos el sobrenadante de células que se incubaron con PA103 cepa de p. aeruginosa contenida amiloide como se indica por el aumento en la emisión de fluorescencia. Por el contrario, sobrenadante de PMVECs inoculadas con la cepa ΔPcrV carecía de amiloides, tal como se indica por la ausencia de aumento de la fluorescencia.
Figura 1. Efectos de la inolculation de p. aeruginosa en la morfología de la PMVEC. Una monocapa confluente de PMVECs antes (A) y cuatro horas después de la adición (B) de PA103 cepa de p. aeruginosa. Brechas pueden verse claramente en la monocapa de células en las células infectadas. Barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Análisis de sobrenadantes citotóxicos. Parte [I]. Imágenes representativas del control y células tratadas. PMVECs fueron tratados para 21 h con sobrenadante de células inoculadas con ambos PA103 bacterias (B) o cepa ΔPcrV (C). Las células del control también se incubaron durante 21 h con HBSS tampón (A). Barra de escala = 100 μm. parte [II]. Immunoblots de representante de sobrenadantes recogidos de las ΔPcrV (A) o PA103 (B) infección PMVECs. Manchas blancas se sondeaba con anticuerpos contra el amiloide (A11) o los tau (T22). Mr en kDa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Cuantificación de la matanza celular. (A) campos de microscopio representativas de diferentes momentos (en h después de la adición sobrenadante) en las regiones del campo que contiene y que carece de células fueron convertidos a blanco o negro, respectivamente, utilizando el software ImageJ. La misma fase de contraste de imagen antes de conversión también. Bar = 100 μm. (B) comparación de la cuantificación de células matar usando análisis de liberación LDH estándar y el ensayo de ImageJ. N = 4, **p < 0.05, ***p < 0.01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Datos de análisis de fluorescencia de ThT representante. Cubetas en blanco que contiene ThT se excitaron a 425 nm y emisión de fluorescencia se midió a 482 nm. Fluorescencia del fondo fue recogida por 20 s y entonces sobrenadante de cualquiera PA103 - o ΔPcrV-inoculados PMVECs fue agregado a las cubetas. Emisión de fluorescencia se registró luego de 40 segundos.
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Discussion
Aquí, simple en vitro métodos están descritos que permiten la demostración de la generación de amiloides citotóxicos durante la infección con una pulmonía que organismo. Estos métodos incluyen ensayos de citotoxicidad en cultivo celular, immunoblotting, cuantificación de célula matar utilizando un novedoso método microscópico y enlace de ThT. Análisis de los agentes citotóxicos han demostrado que son amiloide en la naturaleza (figura 2 y figura 4) y exhiben características de un prión12. La generación de moléculas citotóxicas del prión en neumonía proporciona una explicación potencial para las elevadas tasas de mortalidad observada en sobrevivientes de neumonía tras su alta hospitalaria. Experimentos en curso están probando esta posibilidad.
El evento más importante de todos los estudios descritos es la generación del sobrenadante citotóxica, y dos importantes variables necesitan ser considerados. En primer lugar, en la rata de experimentos se PMVECs fueron utilizados para ambos el paso de la infección y para el ensayo de citotoxicidad. Si otros tipos de células podrían utilizarse para la producción de citotoxinas no ha sido investigada en detalle, y es posible que otras células pueden ser capaces de generar citotóxicos sobrenadantes tras el tratamiento con varias cepas de p. aeruginosa. Como muestra, las citotoxinas son amiloide en naturaleza e incluyen los tau y Aß. Sería razonable esperar que otros tipos de células que expresan la proteína tau y beta amiloide podrían ser inducidas para generar citotoxinas tras inoculación bacteriana, aunque esta posibilidad está por probarse. Los procedimientos se podrían utilizarse para examinar si otros tipos de células pueden ser inducidas a producir amiloides citotóxicos siguiendo diferentes insultos.
La segunda variable importante en la generación de los sobrenadantes citotóxicos es la duración del tratamiento con bacterias. Es esencial que la incubación de las PMVECs pueden progresar hasta las lagunas se observan en la monocapa. La identificación de brechas en la monocapa de células es un exoenzimas de indicación han sido inyectado por la bacteria Pseudomonas en el citoplasma de la célula huésped y que las exoenzimas son activos, dando por resultado la retracción de los bordes de la celda (figura 1). Nuestra experiencia es que el momento de la retracción de los bordes de celda es un indicador confiable de la liberación de la citotoxina en el sobrenadante. Es tentador especular que los dos eventos están relacionados como uno de los amiloides citotóxicos ser liberados es tau los, resultados de interrupción de la actividad de tau en la despolimerización de microtúbulos que contribuye a cambios en la forma de la célula. En experimentos donde los tratamientos han sido menos de la cantidad de tiempo necesaria para inducir formación de brecha, se detectó poco amiloide citotóxico maduro.
El ensayo de citotoxicidad se describe en este manuscrito es simple y confiable. Muerte celular puede ser observada fácilmente por la examinación microscópica y cuantificada directamente imágenes microscópicas grabadas. Los métodos que se describen aquí se han utilizado exclusivamente para evaluar la producción de citotoxina después de la infección de las células endoteliales pulmonares rata con p. aeruginosa. Parece probable que los procedimientos podrían ser fácilmente adaptados para evaluar si citotóxicos amiloides se producen tras la infección con otros neumonía causando agentes, incluyendo tanto nosocomiales asociadas las bacterias y las bacterias y virus responsables de adquirida en la comunidad tipos de neumonía. Por otra parte, los procedimientos reportados sólo se han utilizado para examinar la generación de amiloide citotóxico durante la infección de las células cultivadas. Cultura de célula es un sistema artificial, y los procedimientos aquí descritos probablemente podrían ser adaptados para evaluar la generación de citotoxinas durante la infección pulmonar de modelos animales y pacientes humanos. Colección de fluidos biológicos, como el lavado broncoalveolar de pacientes o animales infectados podría utilizarse en los mismos tipos de ensayos registrados aquí evaluar si citotóxicos amiloides se generan durante los procesos de infección in vivo. Obviamente, la duración de la incubación con bacterias puede ser muy diferente al inocular en los animales, y el lavado broncoalveolar tendría que recogerse en el punto de tiempo múltiples para determinar la duración máxima del tratamiento.
Análisis de Immunoblot han demostrado que los amiloides están presentes en los sobrenadantes, los tau como Aβ (figura 3). Aunque los procedimientos de immunoblot estándar, hay un paso clave que se debe realizar antes de iniciar el análisis de immunoblot. En concreto, es fundamental los sobrenadantes que concentra por lo menos diez veces antes de immunoblotting como la cantidad de amiloide en el sobrenadante concentrado no es por debajo del límite de detección por análisis de immunoblot. Como se informó aquí, usando tubos equipados con un filtro de centrifugación es el método habitualmente utilizado para este paso de concentración, pero parece razonable que otros métodos como la precipitación de TCA, sería igualmente útil para este paso.
La cuantificación de la célula matando a través de imágenes representa un importante avance. En la actualidad procedimientos disponibles para cuantificar la muerte de la célula dependen de la compra de kits bastante caros que permiten la medición de la liberación LDH de células muertas. El ensayo descrito aquí no supone ninguna carga como ImageJ programas son gratis descargar de la página web del NIH. La simple adaptación de los programas de ImageJ permite una medición bastante precisa de muerte celular. Sin embargo, merece la pena señalar que un par de artefactos menores son encontrados durante la ejecución del protocolo delineado. El principal problema es que los fragmentos celulares, tales como áreas de contacto focal, pueden permanecer asociados con la placa de cultivo como las células mueren. Estos fragmentos de célula residual pueden ser detectados por la cámara y dan una idea artificial que las células quedan en el plato. Como tal, es raro que se obtuvo un valor de 100% matanza de la célula utilizando este procedimiento.
Una debilidad del sistema de análisis divulgado es que nunca se han definido completamente los amiloides de citotoxina en la preparación. Por lo tanto, la cuantificación es difícil. Ensayos de ELISA pueden utilizarse para proporcionar total niveles de amiloides diferentes, sin proporcionarnos ninguna información detallada acerca de las especies individuales en cada preparación. Hasta los análisis más precisos, tales como masa-spec o in vitro sintetizan los oligómeros de amiloide, se pueden desarrollar, lo mejor que uno puede hacer en la actualidad es iniciar cada experimento con el mismo número de células, incubar la misma duración y verificar que la citotoxicidad se produce con las mismas tarifas como preparaciones previas que se han utilizado. Variación de cualquiera de las normas bien establecidas introduce incertidumbre adicional.
En Resumen, se describen métodos sencillos en vitro para demostrar la producción de moléculas amiloides tóxicos por las células endoteliales pulmonares después de la infección con un agente causante de neumonía. Las pruebas son confiables y probablemente pueden ser adaptadas para otros organismos y para uso con fluidos biológicos de pacientes humanos y animales infectados. Estos métodos será útiles para estudios que investigaron las consecuencias a largo plazo de la neumonía y para establecer los mecanismos que conducen a la falta de órganos en pacientes después del alta hospitalaria.
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Disclosures
Ninguno para el informe.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada en parte por subvenciones de NIH HL66299 y TS, RB, SL, HL60024 a TS y HL136869 a MF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit anti beta amyloid | Thermo | 71-5800 | |
| A11 amyloid oligomer antibody | StressMarq | SPC-506D | |
| T22 anti-tau oligomer antibody | EMD Millipore | ABN454 | |
| Thioflavin T | Sigma Aldrich | T3516 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 0.22 micron syringe filters | Millipore | SLGP033RS | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| HRP Goat antirabbit IgG | Abcam | ab6721-1 | |
| Strains PA103 and ΔPcrV | These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI | ||
| FITC Griffonia lectin | Sigma Aldrich | L9381 | |
| TRITC Helix pomatia lectin | Sigma Aldrich | L1261 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| 0.22 micron nitrocellulose | BioRad | 162-0112 | |
| Type 2 collagenase | Worthington | LS004176 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30898.03IH | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| Carbenicillin Disodium salt | Sigma | C1389 | |
| Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off | Millipore | UFC801008 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496-500G | |
| Magnesium phosphate heptahydrate | MP Biomedicals | MP021914221 | |
| Citric Acid | G Biosciences | 50-103-5801 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9506-500G | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10277 |
References
- Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia. Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).
- Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia. Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).
- Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction. Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).
- Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia. Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).
- Yende, S., et al. Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis. Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease. J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).
- Frank, D. W. The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).
- Engel, J., Balachandran, P. Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).
- Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability. J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells. PLoS One. 8, e74343 (2013).
- Morrow, K. A., et al. Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids. FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).
- Stevens, T. C., et al. The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).
- Prusiner, S. B. Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions. Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).
- Hunter, N. Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches. Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).
- Marmont, L. S., et al. Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).
