Summary
Enkla metoder beskrivs för att demonstrera produktion av cytotoxiska amyloid efter infektion av pulmonell endotel av Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Patienter som överlever lunginflammation har förhöjda dödstalen under månaderna efter utskrivning från sjukhus. Det har varit hypotes om att infektion av pulmonell vävnad under pneumoni resulterar i produktion av långlivade cellgifter som kan leda till efterföljande slutet organsvikt. Vi har utvecklat in vitro- analyser för att testa hypotesen att cellgifter är producerade under pulmonell infektion. Isolerade råtta pulmonell endotelceller och bakterien Pseudomonas aeruginosa används som modellsystem, och produktionen av cytoxins efter infektion av endotelceller av bakterier kan påvisas med hjälp av cellodling följt av direkt kvantifiering med laktatdehydrogenas analyser och en roman mikroskopiska metoden ImageJ teknik. Amyloid arten av dessa cellgifter demonstrerades genom Tioflavin T bindande analyser, immunoblotting och immunodepletion med A11 anti amyloid antikroppen. Ytterligare analyser med hjälp av immunoblotting visat att Oligomera tau och Aβ producerades och släpptes av endothelial celler efter infektion av P. aeruginosa. Dessa metoder bör vara lätt att anpassa till analyser av mänskliga kliniska prover.
Introduction
Patienter som överlever lunginflammation har förhöjda dödstalen under månaderna efter sjukhus ansvarsfrihet1,2,3,4,5,6. I de flesta fall inträffar döden av någon typ av slut-organsvikt inklusive njur-, lung-, hjärt-, eller lever händelser, samt stroke5,6. Orsaken till den förhöjda dödligheten i denna patientgrupp har aldrig fastställts.
Lunginflammation är klassificeras som antingen vara samhällsförvärvade eller vårdrelaterade (nosokomial) och agenter som kan orsaka lunginflammation omfattar bakterier, virus, svampar och kemikalier. En av de viktigaste orsakerna till nosokomial pneumoni är bakterien Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa är en gramnegativ organism som använder en typ III-sekretionssystemet för att överföra olika effektor molekyler, kallas exoenzymes, direkt till cytoplasman i målet celler7,8. Under infektion av pulmonell endotelceller rikta exoenzymes olika intracellulära proteiner, inklusive en endothelial form av mikrotubuli-associerade proteinet tau9,10,11,12 , leder till endotel barriär uppdelning resulterar i svår lungödem, minskad lungfunktion och, ofta, döden.
Som nämnts tidigare, har patienter som överlever de första lunginflammation förhöjda dödstalen i de första 12 månaderna efter utskrivning från sjukhus. En potentiell mekanism för att förklara detta fenomen är att någon typ av långlivade toxin genereras under den första infektionen som leder till dålig långsiktiga resultat. Två observationer stödjer denna möjlighet. Första, odlade pulmonell endothelial celler som behandlas initialt med P. aeruginosa misslyckas att föröka för upp till en vecka efter bakterierna dödas av antibiotika13. Andra, långlivat prioner och agenter med prion egenskaper har visats i olika människors och djurs sjukdomar, särskilt sjukdomar associerade med nervsystemet14,15.
Metoder för att undersöka potentiell produktion av långlivade cytotoxiska medel under pulmonell infektion har aldrig beskrivits. Här beskrivs en rad enkla in vitro- analyser som kan användas för att utreda cellgift produktion och verksamhet efter infektion med en vanlig lunginflammation orsakar agent, P. aeruginosa. Dessa analyser bör vara lätt att anpassa till undersöka möjliga cellgift induktion efter infektion med andra ämnen som orsakar lunginflammation och supernatanterna som genereras bör också vara användbar för att undersöka effekterna av cellgifter i hela organ eller djur. Slutligen kommer de analyser som beskrivs här troligen vara anpassningsbar att testa djurs och människors biologiska vätskor för produktionen av cellgifter under lunginflammation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur förfaranden har granskats och godkänts av institutionella och djur eftervård kommittén av University of South Alabama och utfördes i enlighet med alla federala, delstatliga och lokala föreskrifter. Primära kulturer av råtta pulmonell mikrovaskulära endotelceller (PMVECs) erhölls från Cell kultur Core Facility vid University of South Alabama's Center för Lung biologi. Cellerna var förberedda med tidigare beskrivna förfaranden16.
1. generering av cytotoxiska supernatanterna
Obs: Här, använder vi två olika stammar av P. aeruginosa: PA103, som har en intakt typ III-sekretionssystemet kan överföra exoenzymes ExoU och ExoT till målceller under infektion och ∆PcrV, som saknar en typ III-sekretionssystemet och är oförmögna att överföra exoenzymes till målceller efter ympning.
- Strimma bakterier på Vogel-Bonner (VB) agar plattor17 och växa över natten vid 37 ° C.
- För att förbereda plattor, gör följande stamlösning (Vogel-Bonner salter; 10 x lager): mäta 2 g MgSO4, 20 g citronsyra (fri syra), 100 g K2PO4och 35 g NaH2PO4. Lägga till ddH2O 1 L och autoklav för 15 min med långsam avgassystem.
- Placera 7,5 g agar i 450 mL ddH2O och Autoklavera enligt ovan.
- Efter autoklavering, placera båda lösningarna i 50 ° C vattenbad svalna.
- Tillsätt 50 mL 10 x VB salt stamlösning till ägarn.
- Lägg till carbenicillin till 400 µg/mL (för stammar av P. aeruginosa som används) och blanda väl genom virvlande kolven.
- Placera 5 mL av VB agar lösningen enskilda sterila kultur rätter, tillåta ägarn att stelna och sedan lagra vid 4 ° C fram till dagen för bakterie sådd.
- På dagen för bakterie sådd, pre värma en tallrik till 37 ° C och sedan strimma bakterier på plattan med hjälp av en steril ögla. Plats plattan i en inkubator i 37 ° C över natten.
- Verifiera PMVEC renhet genom positiv färgning med fluorescerande Griffonia simplicifolia lektin och negativ färgning med fluorescerande Helix pomatia lektin (en markör för arteriell endotelceller). Alikvotens celler och frysa i flytande kväve.
- För experiment, att underhålla celler i Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) kompletteras med 10% fetalt bovint serum och odla cellerna i en 37 ° C inkubator som innehåller 5% CO2. Använda celler på passager 5-15.
- För generationen av cytotoxiska supernatanterna, tallrik 2 x 106 celler i enskilda 150 cm rätter och växa för 3-4 dagar tills sammanflödet uppnås. Använd två plattor per experiment (se nedan).
- För analys av cytotoxiska supernatanterna, tallrik 1 x 105 celler i enskilda brunnar i en 6-väl skålen och växa i fyra dagar tills sammanflödet uppnås.
- För att producera supernatanten, tvätta en av de två 150 cm rätterna av PMVECs från steg 1.3.1 med fosfatbuffrad saltlösning, trypsinize, och sedan räkna cellerna (vi använda en automatiserad cell räknare och följa tillverkarens protokollet, se Tabell för material). Tvätta den andra skålen av PMVECs med Hank's Balanced Salt lösning (HBSS) och sedan infektera med antingen stam av P. aeruginosa vid en multiplicity av infektion (MOI) 20:1. Detta uppnås enligt följande:
- För P. aeruginosa, OD540 0,25 = 2 x 108 CFUs/mL. För att förbereda denna utspädning, tillsätt 1 mL HBSS till en 1 mL disponibla kyvetten. Skrapa tillräckligt bakterier bort av plattan som förbereddes i steg 1.1 tills en OD540 0,25 uppnås när den mäts med en spektrofotometer. Nästa steg kommer att ge en beräkning av hur mycket bakterier kommer att behövas.
- När antalet PMVECs i kultur skålen bestäms (steg 1.4 ovan), bestämma lämpligt antal bakterier som ska läggas till den andra, icke-trypsinized kultur maträtt som innehåller PMVECs. Till exempel om det bestäms att kultur skålen av PMVECs innehåller 1,3 x 107 celler, då förbereda 1,3 x 107 celler x 20 bakterier per cell x 1 mL 2 x 108 CFUs = 1,3 mL bakterier.
- Späd den 1,3 mL av bakterier i HBSS till en slutlig volym på 20 mL, så att hela ytan av en 150 cm skålen kan vara täckt med vätska, sedan lägga de utspädda bakterierna till plätera av PMVECs.
- Inkubera i PMVECs som inokuleras med bakterier vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator för 4-5 h, tills luckor kan ses bildas i den cellen enskiktslager när plattan observeras microscopically (se figur 1 för rätt nivå av gap formation).
- Samla supernatanten, sedan Centrifugera i 10 minuter vid 2000 x g i en bordsskiva centrifug ta bort cellulära skräp.
Tvinga någon bordsskiva centrifug generera tillräcklig g till pellet unlysed celler och stora cellen fragment kan användas för det här steget. - Häll supernatanten i en spruta som har ett 0,2 µm filter kopplad till dess slut, sedan passera supernatanten genom filtret för att ta bort bakterier.
- Använda en alikvot av sterila supernatanten för att testa cytotoxicitet (se 2.1) och frysa resten av supernatanten vid-80 ° C för framtida bruk.
2. analys av cytotoxiska supernatanterna
- Cytotoxicitet analys
- Odla PMVECs i 6-väl rätter fram till sammanflödet. Tvätta brunnarna Tillsätt en gång HBSS, med 1,5 mL filter-steriliseras supernatanten (samlade från antingen PA103 - eller ∆PcrV-inokulerade celler) till enskilda brunnar. Lägg till sterila HBSS till en annan brunn som en negativ kontroll.
- Placera plattan i CO2 inkubatorn för 21-24 h och sedan iaktta cell dödande/cytotoxicitet (se nästa steg). Använd supernatanterna som uppvisar cytotoxicitet för ytterligare experimenterande och släng dem som inte visar cellen dödande.
- Kvantitering av cell dödande
- Åtgärd laktatdehydrogenas (LDH) release från döda celler med hjälp av kommersiellt tillgängliga LDH Assay kit och tillverkarens rekommenderade förfaranden.
- Alternativt kan kvantifiera cell dödande mikroskopiskt använder ImageJ programvara. För detta, spela in mikroskopiska bilder och områden av kultur maträtt som innehåller intakta celler, sedan kvantifiera regioner saknar celler (vägledande av celldöd i en enskiktslager) använder en anpassad ImageJ (National Institutes of Health) makro (se kompletterande Coding File ). Om du vill utföra stegen makro manuellt enligt följande:
- Mata in bilder (RGB- eller Tiff-format) i makrot och justera kontrast till 15% mättade pixlar. Duplicera kontrast-justerade bilder och utföra kommandot ”subtrahera bakgrunden” att uppnå en hög kontrast bild av både cellen och gap område inom synfältet.
- Subtrahera den här bilden från den ursprungliga bilden och kombinera den resulterande bilden med den ursprungliga bilden med bilden räknaren ”och”-funktion. Konvertera den resulterande bilden till svart (luckor) och vita (celler) masken med funktionen tröskel (minsta 0, max 5) och Använd funktionen ”binära urholka” att ta bort brus från bilden.
- Mäta förhållandet mellan svarta till vita pixlar inom den resulterande bilden med ”området bråk” mätningen. Rita och uttrycka fraktionerad områden för varje behandling tidpunkt som procent av maximal gap område.
- Beräkna medel och jämföra med envägs ANOVA med Tukey's post hoc-test, med p -värden mindre än 0,05 anses vara betydande.
- Använda immunoblot analys för att fastställa förekomsten av amyloid, Oligomera tau och Aβ i cellkulturer. Utföra immunoblot analys med hjälp av standardprocedurer10,11,12, förutom att koncentrera cellkulturer som minst 10 gånger före elektrofores.
- För att koncentrera supernatanten, placera 1-2 mL av supernatanten till en centrifugering filterenhet vars membranet har en molekylvikt cut-off av 10 kDa. Sedan placera filterenheten till en bordsskiva centrifug och centrifugera vid 2000 x g tills den nödvändiga graden av koncentration uppnåtts (vanligtvis 45-60 min).
- Bestämma mängden protein i koncentrerad supernatant11 och laddar lika mängder prover i enskilda brunnar i gelen.
- Kör geler, överföra proteinerna till nitrocellulosa, sedan sond blotting med antingen A11 anti amyloid antikropp, T22 anti Oligomera tau antikropp eller MOAB2 anti-Aβ antikropp följt av lämpliga sekundära antikroppar. Utveckla blopparna använder standard chemiluminescence förfaranden.
- Gör en Tioflavin T Assay, använda Tioflavin T fluorescens (ThT) för att kvantifiera amyloid i supernatanterna. För dessa mätningar skall använda filter-steriliseras supernatanterna.
- Förbereda en stamlösning (50 x) av Tioflavin T genom att avbryta 8 mg Tioflavin T (ThT) till 10 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Efter blandning, filtrera lösningen genom ett 0,22 µm filter för att ta bort partiklar.
- För mätningar, tillsätt 20 µL av ThT lager 1 ml PBS i en 1 mL spektrofotometer kyvetten. Placera det utspädda provet i en Spektrofluorometer.
- Mäta baslinjen fluorescens utsläpp med 425 nm excitation och skanning fluorescens utsläpp från 450-575 nm i steg om 2 nm.
- Utföra en time-lapse scan med 425 nm excitation och 482 nm utsläpp, med data förvärvade varje 0,2 s för 60 s.
- De inledande 20 s av time-lapse scan mäter fluorescens i den tomma kyvetten. 20 s, pausa genomsökningen och Lägg till 10 µL av filter-steriliseras supernatanten i kyvetten. Blanda i kyvetten genom inversion och placera sedan tillbaka in i Spektrofluorometer.
- Återuppta tidsbaserade sökningen, förvärva de sista 40 s för data.
- Efter avslutad time-lapse genomsökningen, genomsökning av slutliga fluorescens emissionsspektrum använder identiska inställningar, som beskrivs i 2.1.5.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En enkel in vitro- test har utvecklats för att test för förekomst av cellgifter i supernatanterna celler infekterade med bakterien P. aeruginosa. I grund och botten odlingsmedium från infekterade celler samlas 4 h efter bakteriell tillägg, bakterier avlägsnas genom filtret sterilisering av kulturen supernatanten och sedan steril supernatanten läggs till en ny population av celler. Cellerna observeras sedan 21-24 h efter tillsats av supernatanten och cell dödande är kvantifierade.
Tillägg av P. aeruginosa till konfluenta lager av PMVECs inducerar bildandet av mellanrummen mellan cellerna. In vivo, gap formation leder till lungödem och nedsatt lungfunktion. I den beskrivs assay används gap formation som den tid-punkten för screening för cellgift övergång till cell cellkulturer och tillräckligt lång inkubation med PA103 indikeras av mellanrummen som börjar bildas i den cellen enskiktslager som visas i Figur 1. ΔPcrV bakterier framkalla inte cell luckor under dessa inkubationsförhållanden. När brister upptäcks, supernatanten är insamlade, filtrera steriliseras och läggs sedan till naiva PMVECs att bedöma cytotoxisk aktivitet. PMVECs i deras respektive supernatanterna sedan placeras i en inkubator för 21-24 h, och sedan observerade och fotograferade. Som visas i figur 2, innehöll supernatanten samlas in från PMVECs som hade smittats med P. aeruginosa stam PA103 cellgifter som induceras döden av odlade celler av 21 h efter tillsats av supernatanten. Däremot observerades ingen celldöd i kontroll celler behandlas med antingen HBSS medium eller supernatanten samlas in från den ΔPcrV stammen av Pseudomonas. Immunoblot analys visat att amyloid molekyler, inklusive Oligomera tau och Aβ, genereras under infektion med PA103 stam, medan ingen amyloid genereras av den ΔPcrV stammen efter ympning av PMVECs (figur 2). Amyloid roll som cellgifter i denna analys har bekräftats av immunodepletion av amyloid från supernatanten före tillägg till odlade celler12. Även om inte visas här, utarmar immunodepletion cytotoxisk supernatant använder A11 anti amyloid antikropp och T22 anti tau oligomer antikropp fullständigt cytotoxisk aktivitet från supernatanterna produceras efter PA103 infektion (Balczon et al. 2017 12 och Balczon et al., på gång sedan).
En roman, billig och enkel metod för kvantifiering av cell dödandet har utvecklats. För denna analys, har ImageJ programvara anpassats för att tillåta direkt mätning av områden i ett mikroskopiska fält som saknar celler (vägledande för cell avlivning). Tillförlitligheten i denna metod har verifierats genom direkt jämförelse till väletablerade metoden att mäta cell döda, som är LDH release från celler. I figur 3visas ImageJ programvara kan användas för att konvertera en mikroskopisk fältet som innehåller celler till vitt och regioner som saknar celler till svart. Sedan, ett enkelt förhållande av vita områden till svart kan användas att mäta cell dödande. När du startar med en konfluenta enskiktslager av celler, är alla regioner i fältet mikroskopiska vita. Dock av 18 h efter tillsats av supernatanterna innehållande cellgifter, kunde luckor i enskiktslager detekteras. Beloppet för området kultur skålen saknar celler som sedan ökade linjärt fram till 36 h efter tillägg av cytotoxiska supernatanten. Vid mätning av LDH release, erhölls identiska resultat, med LDH release upptäcks först vid 18 h efter tillsats av cytotoxiska supernatanten. LDH release därefter ökas linjärt tills maximal cell dödande mättes på 36 h efter tillsats av supernatanten. Lilla celldöd mättes i celler behandlas med supernatanten samlas in från ΔPcrV inokulerade celler (figur 3) eller i kulturer som behandlats med HBSS för 36 h.
Mängden amyloid släppt från celler som behandlas med bakterier kan kvantifieras genom mätning ThT fluorescens. Bindningen av amyloid till ThT orsakar en konfirmerande Skift i molekylen och en ökning i fluorescensintensiteten. För denna analys, Tioflavin T läggs till en kyvetten och baslinjen fluorescens mäts. Fluorescens inspelningen stoppas sedan medan en liten delmängd av provet läggs. Kyvetten sedan returneras till fluorimeter och förändringen är fluorescens utsläpp registreras. I figur 4visas insamlade supernatanten från celler som inkuberades med PA103 stam av P. aeruginosa innehöll amyloid som framgår av ökningen av fluorescens utsläpp. Däremot saknade supernatanten från PMVECs som med ΔPcrV stam amyloid, som anges av avsaknad av ökad fluorescens.
Figur 1. Inverkan på PMVEC morfologi av P. aeruginosa inolculation. En konfluenta enskiktslager av PMVECs före (A) och fyra timmar efter tillägg (B) av PA103 stam av P. aeruginosa. Luckor kan tydligt ses i den cellen enskiktslager i de infektera cellerna. Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2. Analyser av cytotoxiska supernatanterna. En del [I]. Representativa bilder av kontroll och behandlade cellerna. PMVECs behandlades för 21 h med supernatanten erhållits från celler som inokulerats med antingen PA103 bakterier (B) eller stam ΔPcrV (C). Kontroll celler inkuberades även för 21 h med HBSS buffert (A). Skalstapeln = 100 µm. del [II]. Representativ immunoblots av supernatanterna samlas in från antingen ΔPcrV (A) eller PA103 (B) infekterade PMVECs. Blotting var utforskad med antikroppar mot amyloid (A11) eller Oligomera tau (T22). Mr i kDa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Kvantitering av cell dödande. (A) representativa mikroskopfält från olika tidpunkter (i h efter supernatant tillägg) i vilka regioner i fältet som innehåller och saknar celler konverterades antingen vit eller svart, respektive med ImageJ programvara. Samma fas kontrast bild innan konvertering visas också. Bar = 100 µm. (B) jämförelse av kvantitering av cell dödande med hjälp av standard LDH release assay och ImageJ analysen. N = 4, **p < 0,05, ***p < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Representant ThT fluorescens assay data. Tom kyvetter innehållande ThT var glada vid 425 nm och sedan utsläpp fluorescens mättes på 482 nm. Bakgrunden fluorescens samlades 20 s, och sedan supernatanten från antingen PA103 - eller ΔPcrV-inokuleras PMVECs lades till kyvetter. Fluorescens utsläpp spelades sedan in för 40 SEK.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här, beskrivs enkel in vitro- metoder som att demonstration av generering av cytotoxiska amyloid under infektion med en lunginflammation som orsakar organism. Dessa metoder inkluderar en cell kultur cytotoxicitet analys, immunoblotting, kvantitering av cell dödande med hjälp av en roman mikroskopiska metoden och ThT bindande. Analyser av de cytotoxiska medel har visat att de amyloid i naturen (figur 2 och figur 4) och uppvisar egenskaper av en prion12. Generering av cytotoxiska prion molekyler under lunginflammation ger en potentiell förklaring till de förhöjda dödstalen som observerats i lunginflammation överlevande efter sin utskrivning från sjukhus. Experiment pågår testar denna möjlighet.
Den viktigaste händelsen för samtliga beskrivna studier är generation av cytotoxiska supernatanten och två viktiga variabler måste beaktas. Först hos disponerade experiment råtta användes PMVECs för både infektion steg och för cytotoxicitet analysen. Huruvida andra celltyper skulle kunna användas för produktion av cellgifter har inte undersökts i detalj, och det är möjligt att andra celler kan kunna generera cytotoxiska supernatanterna efter behandling med olika stammar av P. aeruginosa. Som visad, cellgifter är amyloid i naturen och inkluderar Oligomera tau och Aβ. Det kan vara rimligt att förvänta sig att andra celltyper som uttrycker tau eller beta amyloid protein kan förmås att generera cellgifter efter bakteriell ympning, även om denna möjlighet återstår testas. De beskrivna förfaranden skulle kunna användas för att pröva huruvida andra celltyper kan förmås att producera cytotoxiska amyloid efter olika förolämpningar.
Den andra viktiga variabeln i generation av cytotoxiska supernatanterna är behandlingstiden med bakterier. Det är viktigt att inkubering av PMVECs tillåtas att utvecklas tills luckor kan ses i enskiktslager. Identifiering av luckor i den cellen enskiktslager är en indikation exoenzymes har varit injiceras av Pseudomonas bakterier i värd cellens cytoplasma och att exoenzymes är aktiva, som leder till indragning av cellkantlinjer (figur 1). Vår erfarenhet är att tidpunkten av indragning av cellkantlinjer är en tillförlitlig indikator på cellgift utsättning i supernatanten. Det är frestande att spekulera i att de två händelserna är relaterade som en av de cytotoxiska amyloid som släpps är Oligomera tau, och störningar av tau aktivitet resulterar i mikrotubuli depolymerization vilket bidrar till cell formförändringar. I experiment där behandlingar har varit mindre än den tid som krävs för att framkalla gap bildas, har lite mogen cytotoxiska amyloid upptäckts.
Cytotoxicitet analysen beskrivs i detta manuskript är enkel och tillförlitlig. Celldöd kan observeras enkelt genom mikroskopisk undersökning och kvantifieras direkt från inspelade mikroskopiska bilder. De metoder som beskrivs här har använts uteslutande för att bedöma cellgift produktion efter infektion av råtta pulmonell endotelceller med P. aeruginosa. Det verkar troligt att förfaranden som kunde anpassas lätt att bedöma om cytotoxiska amyloid produceras efter infektion med andra lunginflammation som orsakar ombud, inklusive både nosokomiala-associerade bakterier och bakterier och virus som orsakar samhällsförvärvad typer av lunginflammation. De rapportera förfaranden har dessutom endast använts för att undersöka cytotoxiska amyloid generation under infektion av odlade celler. Cellkultur är en konstgjord system, och de förfaranden som beskrivs här troligen kunde anpassas till bedöma generering av cellgifter under pulmonell infektion i både djurmodeller och mänskliga patienter. Insamling av biologiska vätskor, såsom bronkoalveolär lavage, från smittade djur eller patienter kunde användas i samma typer av analyser som redovisas här att bedöma huruvida cytotoxiska amyloid genereras under infektion processer invivo. Uppenbarligen, varaktigheten för inkubation med bakterier kan vara helt annorlunda när ympning i djur och bronkoalveolär lavage skulle behöva samlas flera tidpunkt bestämma ultimata behandlingstidens.
Immunoblot analyser har visat att amyloid finns i supernatanterna, inklusive Oligomera tau och Aβ (figur 3). Även om förfaranden som immunoblot är standard, finns det ett viktigt steg som måste utföras innan behandling med immunoblot analyser. Specifikt är det kritiskt att supernatanterna vara koncentrerad minst tio gånger innan immunoblotting som beloppet av amyloid i un-koncentrerad supernatanten understiger detektionsgränsen av immunoblot analys. Som redovisas här, centrifugering använda rör utrustad med ett filter är metoden rutinmässigt används för denna koncentration steg, men det verkar rimligt att andra metoder, såsom TCA nederbörd, skulle vara lika användbar för detta steg.
Kvantitering av cell dödande med hjälp av bilder är ett viktigt framsteg. För närvarande lita tillgängliga förfaranden för att kvantifiera celldöd på inköp av ganska dyra kit som tillåter mätning av LDH release från döda celler. Analysen beskrivs här innebär ingen kostnad som ImageJ program är gratis att ladda ner från webbplatsen NIH. Enkel anpassning av ImageJ program tillåter ganska exakt mätning av cell dödande. Det är dock värt att påpeka att ett par mindre artefakter påträffas under prestanda av protokollet beskrivs. Den stora frågan är att cellen fragment, såsom områden av fokal kontakt, kan förbli associerade med kultur skålen som celler dör. Dessa kvarstående cellen fragment kan upptäckas av kameran och ge en konstgjord indikation som celler kvar på skålen. Som sådan, är det sällsynt att ett värde av 100% cell dödande erhålls med den här proceduren.
En svaghet i systemet rapporterade analys är att de cellgift amyloid i beredningen aldrig har definierats fullständigt. Som sådan, är kvantifiering svårt. ELISA-analyser kan användas för att ge totala nivåer av olika amyloid, utan att ge någon detaljerad information om de enskilda arterna i varje beredning. Tills mer precisa analyser, såsom massa-spec eller in vitro syntetiseras amyloid oligomerer, kan utvecklas, det bästa som man kan göra i dagsläget är att börja varje experiment med samma antal celler, inkubera i samma längd och verifiera att cytotoxicitet uppträder på samma priser som tidigare preparat som använts. Variation från någon av de väletablerade normerna införs ytterligare osäkerhet.
Sammanfattningsvis beskrivs enkelt in vitro- metoder för att demonstrera produktion av giftiga amyloid molekyler av pulmonell endothelial celler efter infektion med en lunginflammation som orsakar agent. Analyserna är tillförlitliga och sannolikt kan anpassas för andra organismer och använder biologiska vätskor som erhållits från smittade djur och mänskliga patienter. Dessa metoder kommer att vara användbar för studier som undersöker de långsiktiga konsekvenserna av lunginflammation och för att inrätta de mekanismer som leder till slutet-organsvikt hos patienter efter utskrivning från sjukhus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inget att rapportera.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades i delar av NIH grants HL66299 TS, RB och SL, HL60024 TS och HL136869 till MF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit anti beta amyloid | Thermo | 71-5800 | |
| A11 amyloid oligomer antibody | StressMarq | SPC-506D | |
| T22 anti-tau oligomer antibody | EMD Millipore | ABN454 | |
| Thioflavin T | Sigma Aldrich | T3516 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 0.22 micron syringe filters | Millipore | SLGP033RS | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| HRP Goat antirabbit IgG | Abcam | ab6721-1 | |
| Strains PA103 and ΔPcrV | These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI | ||
| FITC Griffonia lectin | Sigma Aldrich | L9381 | |
| TRITC Helix pomatia lectin | Sigma Aldrich | L1261 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| 0.22 micron nitrocellulose | BioRad | 162-0112 | |
| Type 2 collagenase | Worthington | LS004176 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30898.03IH | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| Carbenicillin Disodium salt | Sigma | C1389 | |
| Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off | Millipore | UFC801008 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496-500G | |
| Magnesium phosphate heptahydrate | MP Biomedicals | MP021914221 | |
| Citric Acid | G Biosciences | 50-103-5801 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9506-500G | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10277 |
References
- Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia. Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).
- Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia. Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).
- Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction. Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).
- Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia. Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).
- Yende, S., et al. Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis. Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease. J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).
- Frank, D. W. The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).
- Engel, J., Balachandran, P. Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).
- Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability. J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells. PLoS One. 8, e74343 (2013).
- Morrow, K. A., et al. Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids. FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).
- Stevens, T. C., et al. The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).
- Prusiner, S. B. Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions. Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).
- Hunter, N. Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches. Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).
- Marmont, L. S., et al. Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).
