Summary
Simple metoder er beskrevet for demonstrerer produktion af cytotoksiske amyloids efter infektion af pulmonal endotel af Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Patienter, der overlever lungebetændelse har forhøjet dødelighed i månederne efter hospitalet decharge. Det har været en hypotese at infektion af pulmonal væv under lungebetændelse resulterer i produktionen af langlivede cytotoksiner, der kan føre til efterfølgende ende organsvigt. Vi har udviklet in vitro- assays for at teste hypotesen at cytotoksiner produceres under pulmonal infektion. Isolerede rotte pulmonal endotelceller og bakterien Pseudomonas aeruginosa bruges som modelsystemer, og produktionen af cytoxins efter bakterier infektion i endothelial celler påvises ved hjælp af cellekultur efterfulgt af direkte kvantificering ved hjælp af laktat dehydrogenase assays og en roman mikroskopimetoden udnytte ImageJ teknologi. Den amyloid karakter af disse cytotoksiner blev påvist ved thioflavin T bindende assays, immunoblotting og immunodepletion ved hjælp af A11 anti-amyloid antistof. Yderligere analyser ved hjælp af immunoblotting viste at oligomere tau og Aβ blev produceret og udgivet af endothelceller efter P. aeruginosainfektion. Disse metoder bør være let at tilpasse til analyser af humane kliniske prøver.
Introduction
Patienter, der overlever lungebetændelse har forhøjet dødelighed i månederne efter hospitalet decharge1,2,3,4,5,6. I de fleste tilfælde opstår død af en form for ende-orgel bankerot herunder nyre, pulmonal, hjerte, eller lever events samt slagtilfælde5,6. Årsagen til den øgede dødelighed i denne patientgruppe er aldrig blevet etableret.
Lungebetændelse er klassificeret som enten EF-overtagne eller hospitalserhvervede (nosokomielle) og agenter, der kan forårsage lungebetændelse omfatter bakterier, vira, svampe og kemikalier. En af de største årsager til nosokomiel pneumoni er bakterien Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa er en gram-negative organisme, der bruger en type III sekretion system til at overføre forskellige effektor molekyler, betegnes exoenzymes, direkte til cytoplasma af target celler7,8. Under infektion af pulmonal endotelceller målrette exoenzymes forskellige intracellulære proteiner, herunder en endotel form for mikrotubulus-forbundet protein tau9,10,11,12 , fører til endotel barriere opdeling resulterer i alvorlige lungeødem, nedsat pulmonal funktion og oftentimes, død.
Som nævnt tidligere, har patienter, som overlever de første lungebetændelse forhøjet dødelighed i de første 12 måneder efter hospitalet decharge. En potentiel mekanisme til at forklare dette fænomen er, at nogle type af langlivede toksin genereres under den indledende infektion, der fører til dårlig langsigtede resultat. To bemærkninger støtte denne mulighed. Første, kulturperler pulmonal endotelceller, der er behandlet i første omgang med P. aeruginosa undlader at formere sig op til en uge efter bakterier er dræbt af antibiotika13. Andet, langlivede prioner og agenter med prioner egenskaber er blevet påvist i forskellige menneskers og dyrs sygdomme, navnlig sygdomme forbundet med nervesystemet14,15.
Metoder til at undersøge den potentielle produktion af langlivede cytotoksiske agenter under pulmonal infektion er aldrig blevet beskrevet. Her en række enkle in vitro- assays er skitseret, kan bruges til at undersøge cytotoxin produktion og aktivitet efter infektion ved hjælp af en fælles lungebetændelse forårsager agent, P. aeruginosa. Disse assays bør være let tilpasses til at undersøge mulige cytotoxin induktion efter infektion med andre agenser, der forårsager lungebetændelse, og de supernatanter, der er genereret også bør være nyttige for at undersøge virkningerne af cytotoksiner i hele organer eller dyr. Endelig, de assays, der er skitseret her sandsynligvis vil kunne tilpasses teste dyrs og menneskers biologiske væsker til produktion af cytotoksiner under lungebetændelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr procedurer blev gennemgået og godkendt af den institutionelle og animalsk omhu Udvalget af University of South Alabama og blev udført i overensstemmelse med alle føderale, statslige og lokale bestemmelser. Primære kulturer af rotte pulmonal mikrovaskulære endothelial celler (PMVECs) stammer fra celle kultur Core facilitet på University of South Alabama's Center for lunge biologi. Celler blev udarbejdet ved hjælp af tidligere beskrevne procedurer16.
1. generation af cytotoksiske analysere
Bemærk: Her bruger vi to forskellige stammer af P. aeruginosa: PA103, som har en intakt type III sekretion system i stand til at overføre exoenzymes ExoU og ExoT til target-cellerne under infektion og ∆PcrV, der mangler en type III sekretion system og er stand til at overføre exoenzymes til target-cellerne efter podning.
- Streak bakterier på Vogel-Bonner (VB) agar plader17 og vokse natten over ved 37 ° C.
- For at forberede plader, gøre følgende stamopløsningen (Vogel-Bonner salte; 10 x materiel): måle 2 g MgSO4, 20 g citronsyre (fri syre), 100 g K2PO4og 35 g NaH2PO4. Tilføje ddH2O til 1 L og autoklave i 15 min. med langsom udstødning.
- Placer 7,5 g agar i 450 mL ddH2O og autoklave som ovenfor.
- Efter autoklavering, placere begge løsninger i et 50 ° C vandbad til at afkøle.
- Der tilsættes 50 mL af 10 x VB salt stamopløsningen til agaren.
- Tilføj carbenicillin til 400 µg/mL (for stammer af P. aeruginosa anvendes) og bland godt af hvirvlende kolben.
- Sted 5 mL af VB agar til individuelle sterile kultur retter, tillade agar til at størkne, og derefter opbevares ved 4 ° C indtil dag i bakteriel såning.
- På dagen for bakteriel såning, pre varme en plade til 37 ° C og derefter streak bakterier på pladen ved hjælp af en steril løkke. Sted pladen i et 37 ° C inkubator natten over.
- Kontroller PMVEC renhed af positive farvning med fluorescerende Griffonia simplicifola lektin og negative farvning med fluorescerende Helix pomatia lektin (markør for arteriel endotelceller). Alikvot celler og fryse i flydende kvælstof.
- For eksperimenter, vedligeholde celler i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtal bovint serum og dyrke celler i et 37 ° C inkubator indeholdende 5% CO2. Bruge celler på passager 5-15.
- For generation af cytotoksiske supernatanter, plade 2 x 106 celler i individuelle 150 cm retter og vokse i 3-4 dage indtil sammenløbet er opnået. Bruge to plader pr. eksperiment (se nedenfor).
- For analyse af cytotoksiske supernatanter, plade 1 x 105 celler i individuelle brønde på en 6-godt parabol og vokse i fire dage, indtil sammenløbet er opnået.
- For at producere supernatanten, vask en af to 150 cm retterne af PMVECs fra trin 1.3.1 med fosfatbufferet saltopløsning, trypsinize, og derefter tælle cellerne (vi bruger en automatiseret celle counter og følg producentens protokol, se Tabel af materialer). Vaske anden skålen af PMVECs med Hank's Balanced Salt løsning (HBSS) og inficere med enten stamme af P. aeruginosa på en mangfoldighed af infektion (MOI) 20:1. Dette opnås som følger:
- Til P. aeruginosa, OD540 0,25 = 2 x 108 CFUs/mL. For at forberede denne fortynding, der tilsættes 1 mL HBSS til en 1 mL engangs kuvette. Skrabe nok bakterier ud af den plade, der blev udarbejdet i trin 1.1, indtil en OD540 på 0,25 opnås når målt ved hjælp af et spektrofotometer. Det næste skridt vil give en beregning af hvor meget bakterier vil være nødvendig.
- Når antallet af PMVECs i kultur parabol bestemmes (trin 1.4 ovenfor), bestemme det passende antal bakterier til at blive føjet til den anden, ikke-trypsinized kultur parabol indeholdende PMVECs. For eksempel, hvis det fastslås, at kultur fad af PMVECs indeholder 1,3 x 107 celler, så Forbered dig på 1,3 x 107 celler x 20 bakterier/celle x 1 mL/2 x 108 CFUs = 1,3 mL bakterier.
- Fortyndes 1,3 mL af bakterier i HBSS til en endelige mængden af 20 mL, således at hele overfladen af en 150 cm parabol kan være dækket med væske og derefter tilføje de fortyndede bakterier på pladen af PMVECs.
- Inkubér PMVECs podes med bakterier ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator for 4-5 h, indtil huller kan ses danner i celle éncellelag når pladen er observeret mikroskopisk (Se figur 1 til korrekt niveau af hul dannelsen).
- Indsamle supernatanten, derefter centrifugeres i 10 min på 2.000 x g i en bordplade centrifuge fjerne celleaffald.
Bemærk: Enhver bordplade der centrifugeres i stand til at generere tilstrækkelig g kraft hen til sammenpresse unlysed celler og store celle fragmenter kan anvendes til dette trin. - Hæld supernatanten i en sprøjte, der har en 0,2 µm filter knyttet til sin ende, derefter passere supernatanten gennem filteret til at fjerne bakterier.
- Bruge en alikvot af sterile supernatanten for at teste cytotoksicitet (Se 2.1) og fryse resten af supernatanten ved-80 ° C til fremtidig brug.
2. analyse af cytotoksiske analysere
- Cytotoksicitet Assay
- Vokse PMVECs i 6-godt retter indtil sammenløbet. Vask wells tilsættes engang med HBSS, derefter 1,5 mL filter-steriliseret supernatanten (indsamlet fra enten PA103 eller ∆PcrV podes celler) individuelle brønde. Tilføj sterile HBSS til en anden brønd som en negativ kontrol.
- Pladen anbringes i CO2 inkubator for 21-24 h, så observere for celle drab/cytotoksicitet (se næste trin). Brug supernatanter, der udviser cytotoksicitet for yderligere eksperimenter, og kassere dem, der ikke viser cellen drab.
- Kvantitering af celle drab
- Foranstaltning laktat dehydrogenase (LDH) frigivelse fra døde celler ved hjælp af kommercielt tilgængelige LDH Assay Kits og producentens anbefalede procedurer.
- Alternativt, kvantificere celle drab mikroskopisk bruger ImageJ software. For dette, registrere mikroskopiske billeder og områder af kultur fadet med intakt celler, så kvantificere regioner mangler celler (vejledende af celledød i en éncellelag) ved hjælp af en brugerdefineret ImageJ (National Institutes of Health) makro (Se supplerende kodning fil ). Hvis det ønskes, udføre makro trinene manuelt som følger:
- Input billeder (RGB- eller Tiff-format) i makroen og justere kontrast til 15% mættet pixel. Duplikere kontrast-justerede billeder og udføre kommandoen "fratræk baggrund" at opnå en høj kontrast billede af både celle og gap område inden for synsfeltet.
- Trække dette billede fra det originale billede og kombinere det resulterende billede med den oprindelige afbildning ved hjælp af billede regnemaskine "Og"-funktionen. Konvertere den deraf følgende billede til sort (huller) og hvid (celler) maske med funktionen tærskel (minimum 0, maksimalt 5), og brug funktionen "binær erodere" til at fjerne støj fra billedet.
- Måle forholdet mellem sort til hvid pixel inden for den resulterende billede ved hjælp af "område brøkdel" måling. Plot og express fraktioneret områder for hvert behandling tidspunkt som procent af maksimal gap område.
- Beregne midler og sammenligne ved hjælp af en-vejs ANOVA med Tukey's post hoc test med p -værdier mindre end 0,05 betragtes som væsentlige.
- Brug immunblot analyse for at fastslå tilstedeværelsen af amyloid, oligomere tau og Aβ i kultur analysere. Udføre immunblot analyse ved hjælp af standardprocedurer10,11,12, bortset fra koncentreret kultur analysere mindst 10-fold inden elektroforese.
- For at koncentrere supernatanten, læg 1-2 mL af supernatanten i en centrifugering filterenhed hvis membranen har en molekylvægt cut-off af 10 kDa. Anbring filterenhed i en bordplade centrifuge og centrifugeres på 2.000 x g indtil den krævede grad af koncentration er opnået (normalt 45-60 min).
- Bestemme mængden af protein i den koncentrerede supernatanten11 og indlæse lige store mængder af prøver i individuelle brønde af gelen.
- Køre geler, overføre proteiner til nitrocellulose, så sonden klatter med enten A11 anti-amyloid antistof, T22 anti-oligomere tau antistof eller MOAB2 anti-Aβ antistof efterfulgt af passende sekundære antistoffer. Udvikle blots ved hjælp af standard kemiluminescens procedurer.
- For at gøre en thioflavin T Assay, skal du bruge thioflavin T fluorescens (ThT) for at kvantificere amyloids i supernatanter. Til disse maalinger skal bruge filter-steriliseret analysere.
- Forberede en stamopløsning (50 x) af thioflavin T ved at suspendere 8 mg thioflavin T (ThT) i 10 mL fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Efter blandingen, opløsningen filtreres gennem et 0,22 µm filter til at fjerne partikler.
- Målinger, skal du tilføje 20 µL af ThT materiel til 1 mL PBS i en 1 mL Spektrofotometer kuvette. Fortyndes prøven anbringes i et spektrofluorimeter.
- Måle baseline fluorescens emission ved hjælp af 425 nm excitation og scanning fluorescens emission fra 450-575 nm i 2 nm intervaller.
- Udføre en time-lapse scanning ved hjælp af 425 nm excitation og 482 nm emission, med data erhvervet hver 0,2 s for 60 s.
- De første 20 s af time-lapse scanningen måler fluorescens i den tomme kuvette. På 20 s, standse scanningen midlertidigt og tilsæt 10 µL af filter-steriliseret supernatanten til kuvette. Bland kuvette ved inversion og Placer derefter tilbage i spektrofluorimeter.
- Genoptage tidsbaserede scanningen, erhverve de sidste 40 s data.
- Efter afslutningen af time-lapse scanningen, udføre en endelige fluorescens emission spektrum scanning med samme indstillinger, som beskrevet i 2.1.5.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En simpel i vitro assay er udviklet til at analyse for tilstedeværelse af cytotoksiner i supernatanter af celler inficeret med bakterien P. aeruginosa. Dybest set, næringssubstrat fra inficerede celler er indsamlet 4 h efter bakteriel tilsætning, bakterier er fjernet af filter Sterilisation af supernatanten kultur og derefter sterile supernatanten tilføjes en ny befolkning af celler. Cellerne er derefter observeret 21-24 timer efter tilsætning af supernatanten og celle drab er kvantificeret.
Tilsætning af P. aeruginosa sammenflydende lag af PMVECs inducerer dannelsen af huller mellem cellerne. In vivo, hul dannelsen fører til lungeødem og nedsat pulmonal funktion. I den beskrevne assay bruges hul dannelsen som tidspunkt for screening for cytotoxin overgang til celle kultur analysere og tilstrækkelig varighed af inkubationen med PA103 er indiceret ved tilstedeværelsen af huller, der begynder at danne i celle éncellelag som vist i Figur 1. ΔPcrV bakterier Fremkald ikke celle huller på disse betingelser, inkubation. Når huller er registreret, supernatanten er indsamlet, filter steriliseret, og derefter tilføjet til naiv PMVECs at vurdere cytotoksisk aktivitet. PMVECs i deres respektive analysere er derefter placeret i en inkubator i 21-24 timer, og derefter observeret og fotograferet. Som vist i figur 2, indeholdt supernatanten indsamlet fra PMVECs, der havde været inficeret med P. aeruginosa stamme PA103 cytotoksiner, som inducerede død kulturperler celler af 21 h efter tilsætning af supernatanten. Derimod blev ingen celledød observeret i kontrol celler behandlet med enten HBSS medium eller supernatanten indsamlet fra ΔPcrV stammen af Pseudomonas. Immunblot analyse viste, at amyloid molekyler, herunder oligomere tau og Aβ, der genereres under infektion med PA103 stammen, mens ingen amyloids er genereret af den ΔPcrV stamme efter podning af PMVECs (figur 2). Amyloids rolle som cytotoksiner i denne analyse er blevet bekræftet ved immunodepletion af amyloids fra supernatanten inden de tilsættes til kulturperler celler12. Selv om ikke vist her, udtømmer immunodepletion af cytotoksiske supernatanten ved hjælp af A11 anti-amyloid antistof og T22 anti-tau oligomer antistof helt cytotoksisk aktivitet fra supernatanter produceres efter PA103 infektion (Balczon et al. 2017 12 og Balczon et al., under forberedelse).
En roman, billig og enkel metode til kvantificering af celle drab er blevet udviklet. Til dette assay er ImageJ software blevet tilpasset til at tillade direkte måling af områder, der mangler celler (vejledende af celle drab) i et mikroskopisk felt. Pålideligheden af denne metode er blevet bekræftet ved direkte sammenligning til det veletablerede metode til måling af celle drab, som er LDH udgivelse fra celler. Som vist i figur 3, kan ImageJ software bruges til at konvertere regioner af et mikroskopisk felt, der indeholder celler til hvid og regioner, der mangler celler til sort. Derefter, en simple forhold af hvide områder til sorte kan bruges til at måle celle drab. Når du starter med en sammenflydende éncellelag af celler, er alle regioner mikroskopifeltets hvide. Dog af 18 h efter tilsætning af supernatanter indeholdende cytotoksiner, kunne huller i éncellelag påvises. Mængden af område af kultur parabol celler steg derefter i en lineær måde indtil 36 h efter tilsætning af cytotoksiske supernatanten. Ved måling af LDH frigivelse, blev identiske resultater opnået, med LDH frigivelse er først opdaget på 18 h efter tilsætning af cytotoksiske supernatanten. LDH release steg derefter i en lineær måde indtil maksimal celle drab blev målt til 36 h efter tilsætning af supernatanten. Lille celledød blev målt i celler behandles med supernatanten indsamlet fra ΔPcrV podes celler (figur 3) eller kulturer behandlet med HBSS for 36 h.
Mængden af amyloid frigives fra celler behandles med bakterier kan kvantificeres ved at måle ThT fluorescens. Bindingen af amyloids til ThT forårsager en konformationel ændring i molekylet og en stigning i fluorescens intensitet. Til denne analyse, thioflavin T er føjet til en kuvette og baseline Fluorescens er målt. Fluorescens målingen er derefter stoppede, mens en lille alikvot af prøven er tilføjet. Kuvette derefter returneres til fluorimeter og ændringen er fluorescens emission registreres. Som vist i figur 4, indsamlet supernatanten fra cellerne, der blev inkuberet med PA103 stamme af P. aeruginosa indeholdt amyloid som angivet af stigningen i fluorescens emission. Derimod manglede supernatanten fra PMVECs podes med ΔPcrV stamme amyloids, som angivet ved en mangel på øget fluorescens.
Figur 1. Virkningerne af P. aeruginosa inolculation på PMVEC morfologi. En sammenflydende éncellelag af PMVECs før (A) og fire timer efter tilsætning (B) af PA103 stamme af P. aeruginosa. Huller kan tydeligt ses i celle éncellelag i de inficerede celler. Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Analyser af cytotoksiske supernatanter. Del, [I]. Repræsentative billeder af kontrol og behandlede celler. PMVECs blev behandlet til 21 h med supernatanten fra cellerne podet med enten PA103 bakterier (B) eller stamme ΔPcrV (C). Kontrol celler blev også inkuberes i 21 h med HBSS buffer (A). Skalalinjen = 100 µm. del [II]. Repræsentant immunoblots af analysere indsamlet fra enten ΔPcrV (A) eller PA103 (B) inficeret PMVECs. Blotting var probed med antistoffer mod amyloid (A11) eller oligomere tau (T22). Mr i kDa. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Kvantitering af celle drab. (A) repræsentative mikroskopfelter fra forskellige tidspunkter (i h efter supernatanten tilsætning) i hvilke regioner på feltet, der indeholder og mangler celler blev omdannet enten hvid eller sort, henholdsvis bruger ImageJ software. Den samme fase kontrast billede før konvertering er også vist. Bar = 100 µm. (B) sammenligning af kvantitering af celle drab ved hjælp af standard LDH release assay og ImageJ assay. N = 4, **p < 0,05, ***p < 0,01. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Repræsentant ThT fluorescens assay data. Tom kuvetter indeholdende ThT var begejstrede ved 425 nm og derefter emission fluorescens blev målt til 482 nm. Baggrund fluorescens blev indsamlet til 20 s, og derefter supernatanten fra enten PA103 - eller ΔPcrV-podes PMVECs blev tilføjet til kuvetter. Fluorescens emission blev derefter optaget i 40 sek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her, er enkel in vitro- metoder beskrevet som give demonstration af generation af cytotoksiske amyloids under infektion med en lungebetændelse forårsager organisme. Disse metoder omfatter celle kultur cytotoksicitet assay, immunoblotting, kvantitering af celle drab ved hjælp af en roman mikroskopimetoden og ThT bindende. Analyser af de cytotoksiske agenter har vist at de amyloid i naturen (figur 2 og figur 4) og udstille Karakteristik af en prion12. Generation af cytotoksiske prion molekyler under lungebetændelse giver en potentiel forklaring for forhøjet dødelighed observeret i lungebetændelse overlevende efter deres hospital decharge. Eksperimenter i gang tester denne mulighed.
Den vigtigste begivenhed for alle de beskrevne undersøgelser er generation af cytotoksiske supernatanten, og to vigtige variabler skal overvejes. Først, i den skitserede eksperimenter rotte PMVECs blev brugt til både infektion skridt og for cytotoksicitet assay. Om andre celletyper kan anvendes til produktion af cytotoksiner er ikke blevet undersøgt i detaljer, og det er muligt, at andre celler kan være i stand til at generere cytotoksiske analysere efter behandling med forskellige stammer af P. aeruginosa. Som vist, cytotoksiner amyloid i naturen og omfatter oligomere tau og Aβ. Det kan være rimeligt at forvente, at andre celletyper, der udtrykker tau og/eller beta amyloid protein kan være tilskyndet til at generere cytotoksiner efter bakteriel podning, selv om denne mulighed er stadig at blive afprøvet. De skitserede procedurer kunne bruges til at undersøge, om andre celletyper kan være tilskyndet til at producere cytotoksiske amyloids efter forskellige fornærmelser.
Den anden vigtige variabel i generation af cytotoksiske analysere er varigheden af behandling med bakterier. Det er vigtigt, at inkubering af PMVECs må videre indtil huller kan ses i éncellelag. Identifikation af huller i celle éncellelag er en indikation-exoenzymes har været injiceres af Pseudomonas-bakterier i vært cellen cytoplasma og at exoenzymes er aktive, hvilket resulterer i tilbagetrækning af cellekanter (figur 1). Vores erfaring er, at tidspunkt af sammentrækning af celle grænser er en pålidelig indikator for cytotoxin overgang til supernatanten. Det er fristende at spekulere, at de to begivenheder hænger som en af de cytotoksiske amyloids frigives er oligomere tau, og afbrydelse af tau aktivitet resulterer i mikrotubulus depolymerization, som bidrager til figur celleforandringer. I eksperimenter hvor behandlinger har været mindre end mængden af tid, der kræves til at fremkalde hul dannelse, er lidt ældre cytotoksiske amyloid blevet opdaget.
Cytotoksicitet analysen beskrives i dette håndskrift er enkel og pålidelig. Celledød kan observeres let ved mikroskopisk undersøgelse og kvantificeret direkte fra optagne mikroskopiske billeder. De metoder, der er beskrevet her har været brugt udelukkende til vurdering af cytotoxin produktion efter infektion af rotte pulmonal endotelceller med P. aeruginosa. Det forekommer sandsynligt, at procedurerne, der kunne tilpasses let at vurdere, om cytotoksiske amyloids produceres efter infektion med andre lungebetændelse forårsager agenter, herunder både nosokomielle-associerede bakterier og bakterier og vira, der er ansvarlig for erhvervet typer af lungebetændelse. Derudover har de indberettede procedurer kun blevet brugt til at undersøge cytotoksiske amyloid generation under infektion af dyrkede celler. Cellekultur er et kunstigt system, og de procedurer, der er skitseret her sandsynligvis kunne tilpasses for at vurdere generation af cytotoksiner under pulmonal infektion af både dyremodeller og menneskelige patienter. Indsamling af biologiske væsker, såsom bronchoalveolar lavage, fra enten inficerede dyr eller patienter kunne anvendes i de samme typer af assays rapporteret her at vurdere, om cytotoksiske amyloids genereres under infektion processer in vivo. Naturligvis, varigheden af inkubationen med bakterier kan være helt anderledes, når vaccination i dyr, og bronchoalveolar lavage skulle indsamles for flere tidspunkt til at bestemme ultimative varighed af behandling.
Immunblot analyser viste, at amyloids er til stede i supernatanter, herunder oligomere tau og Aβ (figur 3). Selvom immunblot procedurer er standard, er der et afgørende skridt, der skal udføres før indlede immunblot analyser. Specifikt, er det vigtigt, at analysere angives koncentreret mindst ti gange før immunoblotting som mængden af amyloid i un-koncentreret supernatanten er under detektionsgrænsen ved immunblot analyse. Som rapporteret her, centrifugering ved hjælp af rør, udstyret med et filter er rutinemæssigt metoden for trinnet koncentration, men det synes rimeligt at andre metoder, såsom TCA nedbør, ville være lige så nyttige for dette trin.
Kvantitering af celle drab ved hjælp af billeder repræsenterer et vigtigt fremskridt. I øjeblikket stole tilgængelige procedurer til kvantificering af celledød på køb af temmelig dyrt kits, der tillader måling af LDH frigivelse fra døde celler. Analysen beskrives her indebærer ingen omkostninger som ImageJ programmer er gratis at downloade fra webstedet NIH. En simpel tilpasning af ImageJ programmer giver mulighed for forholdsvis nøjagtige måling af celle drab. Det er imidlertid værd at påpege, at et par mindre artefakter er stødt på under udførelsen af de skitserede protokol. Det store spørgsmål er, at celle fragmenter, som focal berøringsflader, kan forblive forbundet med kultur parabol som celler dør. Disse resterende celle fragmenter kan påvises ved kameraet og give en kunstig tyder på, at celler forbliver på fadet. Som sådan, er det sjældent, at en værdi på 100% celle drab er opnået ved hjælp af denne procedure.
En svaghed ved den rapporterede assay system er, at cytotoxin amyloids i forberedelsen aldrig har været helt defineret. Som sådan er kvantitering vanskeligt. ELISA assays kan bruges til at levere samlede niveauer af forskellige amyloids, uden at afgive detaljerede oplysninger om de enkelte arter i hvert præparat. Indtil mere præcise assays, såsom masse-spec eller in vitro syntetiseret amyloid oligomerer, kan udvikles, det bedste, man kan gøre på nuværende tidspunkt er at starte hvert eksperiment med det samme antal celler, der inkuberes i samme tidsrum, og kontroller, at cytotoksicitet opstår de samme satser som tidligere præparater, der er blevet brugt. Variation fra nogen af de veletablerede normer introducerer yderligere usikkerhed.
I Resumé, er simpel in vitro- metoder skitseret for demonstrerer produktion af giftige amyloid molekyler af pulmonal endotelceller efter infektion med en lungebetændelse-fremkaldende agent. Assays er pålidelige og sandsynligvis kan være tilpasset til andre organismer og til brug ved hjælp af biologiske væsker fra smittede dyr og menneskelige patienter. Disse metoder vil være nyttige for studier undersøger de langsigtede konsekvenser af lungebetændelse og tilvejebringe mekanismer fører til slutningen-organsvigt i patienterne efter hospitalet decharge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen betænkning.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret i dele af NIH tilskud HL66299 til TS, RB og SL, HL60024 til TS, og HL136869 til MF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit anti beta amyloid | Thermo | 71-5800 | |
| A11 amyloid oligomer antibody | StressMarq | SPC-506D | |
| T22 anti-tau oligomer antibody | EMD Millipore | ABN454 | |
| Thioflavin T | Sigma Aldrich | T3516 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 0.22 micron syringe filters | Millipore | SLGP033RS | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| HRP Goat antirabbit IgG | Abcam | ab6721-1 | |
| Strains PA103 and ΔPcrV | These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI | ||
| FITC Griffonia lectin | Sigma Aldrich | L9381 | |
| TRITC Helix pomatia lectin | Sigma Aldrich | L1261 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| 0.22 micron nitrocellulose | BioRad | 162-0112 | |
| Type 2 collagenase | Worthington | LS004176 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30898.03IH | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| Carbenicillin Disodium salt | Sigma | C1389 | |
| Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off | Millipore | UFC801008 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496-500G | |
| Magnesium phosphate heptahydrate | MP Biomedicals | MP021914221 | |
| Citric Acid | G Biosciences | 50-103-5801 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9506-500G | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10277 |
References
- Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia. Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).
- Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia. Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).
- Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction. Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).
- Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia. Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).
- Yende, S., et al. Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis. Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease. J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).
- Frank, D. W. The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).
- Engel, J., Balachandran, P. Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).
- Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability. J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells. PLoS One. 8, e74343 (2013).
- Morrow, K. A., et al. Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids. FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).
- Stevens, T. C., et al. The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).
- Prusiner, S. B. Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions. Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).
- Hunter, N. Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches. Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).
- Marmont, L. S., et al. Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).
