Summary
Méthodes simples sont décrits pour démontrer la production des cytotoxiques amyloïdes suite à une infection de l’endothélium pulmonaire par Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Les patients qui survivent à une pneumonie ont élevé le taux de mortalité dans les mois qui suivent la sortie de l’hôpital. Il a émis l’hypothèse qu’infection du tissu pulmonaire au cours de la pneumonie entraîne la production de cytotoxines longue durée de vie qui peuvent conduire à la défaillance d’organes fin subséquente. Nous avons développé in vitro tests pour vérifier l’hypothèse que les cytotoxines sont produites au cours d’une infection pulmonaire. Les cellules endothéliales pulmonaires isolés de rats et la bactérie Pseudomonas aeruginosa sont utilisées comme systèmes modèles et la production de cytoxins suite à une infection des cellules endothéliales par les bactéries est démontrée à l’aide de culture cellulaire, suivie dosage direct à l’aide de tests de lactate déshydrogénase et une nouvelle méthode microscopique utilisant la technologie ImageJ. La nature amyloïde de ces cytotoxines a été démontrée par des essais de liaison thioflavine T et par immunotransfert et protocole à l’aide d’anticorps anti-amyloïdes A11. Des analyses plus poussées à l’aide d’immunotransfert ont démontré qu’oligomérique tau et bêta-amyloïdes produit et diffusé par les cellules endothéliales après infection par P. aeruginosa. Ces méthodes doivent demeurer aisément adaptables aux analyses des échantillons cliniques humains.
Introduction
Les patients qui survivent à une pneumonie ont élevé le taux de mortalité dans les mois qui suivent l’hôpital décharge1,2,3,4,5,6. Dans la plupart des cas, la mort survient par certains type de défaillance terminale d’organes y compris rénale, pulmonaire, cardiaque, ou des événements hépatiques, mais aussi des AVC5,6. La raison pour le taux de mortalité élevé chez cette population de patients n’a jamais été établie.
La pneumonie est classée comme étant soit extra-hospitalière ou nosocomiales (infections nosocomiales) et les agents qui causent la pneumonie incluent des bactéries, virus, champignons et produits chimiques. Une des principales causes de la pneumonie nosocomiale est la bactérie Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa est un organisme Gram négatif qui utilise un système de sécrétion de type III pour transférer les diverses molécules effectrices, appelés exoenzymes, directement dans le cytoplasme des cellules de cible7,8. Au cours de l’infection des cellules endothéliales pulmonaires, les exoenzymes ciblent diverses protéines intracellulaires, y compris une forme endothéliale de la protéine associée aux microtubules tau9,10,11,12 , conduisant à la rupture de la barrière endothéliale aboutissant à un oedème pulmonaire sévère, une diminution de la fonction pulmonaire et, souvent, la mort.
Comme indiqué précédemment, les patients qui survivent à la pneumonie initiale ont élevé les taux de mortalité dans les 12 premiers mois suivant la sortie de l’hôpital. Un mécanisme potentiel pour expliquer ce phénomène, c’est que certains type de toxine de longue durée de vie est dégagée au cours de l’infection initiale qui mène à mauvais pronostic à long terme. Deux observations confirment cette possibilité. Tout d’abord, cultivés pulmonaire les cellules endothéliales qui sont traités initialement par la P. aeruginosa ne parviennent pas à proliférer pour jusqu'à une semaine après que les bactéries sont tuées par les antibiotiques,13. Deuxièmement, longue durée de vie des prions et agents ayant des caractéristiques de prion ont été démontrées dans diverses maladies humaines et animales, notamment les maladies associées au système nerveux14,15.
Méthodes pour l’examen de la production potentielle d’agents cytotoxiques longue durée de vie au cours de l’infection pulmonaire n’ont jamais été décrites. Ici figurent une série de simples in vitro tests qui peut être utilisé pour étudier la production de cytotoxine et l’activité suite à une infection à l’aide d’un agent causant la pneumonie habituellement, P. aeruginosa. Ces tests devraient demeurer aisément adaptables pour étudier l’induction de cytotoxine possible suite à une infection à l’aide d’autres agents qui causent la pneumonie, et les fractions surnageantes générées doivent aussi être utiles pour étudier les effets des cytotoxines dans son ensemble organes ou des animaux. Enfin, les dosages qui sont décrites ici très probablement sera adaptables pour tester les liquides biologiques humains et animaux pour la production de cytotoxines au cours de la pneumonie.
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Protocol
Toutes les procédures d’animaux ont été examinés et approuvés par les institutionnels et le Comité de protection des animaux de l’Université d’Alabama du Sud et ont été effectuées conformément aux règlements fédéraux, étatiques et locales. Les cultures primaires de rat pulmonaire les cellules endothéliales microvasculaires (PMVECs) proviennent de la cellule Culture Core Facility au centre de l’Université d’Alabama du Sud pour la biologie de poumon. Les cellules ont été préparés à l’aide des procédures décrites précédemment,16.
1. génération des surnageants cytotoxiques
Remarque : Ici, nous utilisons deux différentes souches de P. aeruginosa: PA103, qui possède un système de sécrétion de III type intact capable de transférer les exoenzymes ExoU et ExoT pour cibler les cellules au cours de l’infection et ∆PcrV, qui ne dispose pas d’un type de système de sécrétion III et est incapable de transférer des exoenzymes pour cibler les cellules après l’inoculation.
- Ensemencer des bactéries sur Vogel-Bonner (VB) agar plaques17 et croître une nuit à 37 ° C.
- Pour préparer les plaques, faire la solution suivante (sels de Vogel-Bonner ; stock de x 10) : mesurer 2 g MgSO4, 20 g d’acide citrique (acide libre), 100 g K2PO4et 35 g NaH2PO4. Ajouter ddH2O à 1 L et stériliser pendant 15 min avec échappement lent.
- Placer 7,5 g de gélose dans 450 mL FD2O et stériliser comme ci-dessus.
- Après autoclavage, placez les deux solutions dans un bain d’eau de 50 ° C pour refroidir.
- Ajouter 50 mL de la solution saline stock de 10 x VB à la gélose.
- Ajouter carbénicilline à 400 µg/mL (pour les souches P. aeruginosa utilisé) et bien mélanger en agitant le flacon.
- Déposer 5 mL de la solution d’agar VB en Pétri stériles individuelles, permettent l’agar pour solidifier et ensuite stocker à 4 ° C jusqu’au jour de l’ensemencement bactérien.
- Le jour de l’ensemencement bactérien, préchauffer un plat à 37 ° C et puis strier les bactéries sur la plaque à l’aide d’une anse stérile. Place la plaque dans un incubateur à 37 ° C durant la nuit.
- Vérifier la pureté PMVEC de coloration positive avec fluorescent Griffonia simplicifolia lectine et une coloration négative avec fluorescentes Helix pomatia lectine (un marqueur de l’endothélium artériel). Les cellules aliquotes et congélation dans l’azote liquide.
- Pour les expériences, maintenir les cellules en de l’aigle de la modification de Dulbecco Medium (DMEM) additionné de sérum de veau fœtal 10 % et la croissance de cellules dans un incubateur à 37 ° C contenant 5 % de CO2. Utiliser des cellules à passages 5-15.
- Pour la génération des surnageants cytotoxiques, plaque 2 x 106 cellules dans des plats individuels 150 cm et pousse pendant 3-4 jours jusqu’au confluent est atteint. Utiliser deux plaques par expérience (voir ci-dessous).
- Pour l’analyse des surnageants cytotoxiques, cellules5 plaque 1 x 10 dans des puits individuels d’un puits 6 plat et poussent pendant quatre jours jusqu'à confluence est atteint.
- Pour produire le surnageant, laver un des plats deux 150 cm de PMVECs de l’étape 1.3.1 avec une solution saline tamponnée au phosphate, trypsinize et puis compter les cellules (nous utiliser un compteur cellulaire automatisée et suivre le protocole du fabricant ; voir Table des matières). Laver l’autre plat de PMVECs avec Hank Balanced Salt Solution (HBSS) et ensuite infecter avec deux souches P. aeruginosa à une multiplicité d’infection (MOI) de 20:1. Ce résultat est obtenu comme suit :
- Pour P. aeruginosa, OD540 0,25 = 2 x 108 UFC/mL. Pour préparer cette dilution, ajouter 1 mL HBSS dans une cuvette jetable 1 mL. Grattez suffisamment les bactéries de la plaque qui a été préparé à l’étape 1.1 jusqu'à l’obtention d’une OD540 de 0,25 lorsqu’elle est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre. La prochaine étape permettra un calcul de combien il faudra des bactéries.
- Une fois déterminé le nombre de PMVECs dans la boîte de Petri (étape 1.4 ci-dessus), déterminer le nombre de bactéries à ajouter à la seconde, non-trypsinisées boîte de Petri contenant les PMVECs. Par exemple, s’il est établi que la boîte de Petri de PMVECs contient 1,3 x 107 cellules, puis préparer 1,3 x 107 cellules x 20 bactéries/cellules x 1 mL/2 x 108 UFC = bactéries 1,3 mL.
- Diluer le 1,3 mL de bactéries en HBSS pour un volume final de 20 mL, afin que la totalité de la surface d’un plat de 150 cm peut être recouvert de liquide, puis ajouter les bactéries dilués à la plaque de PMVECs.
- Incuber les PMVECs inoculées avec les bactéries à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % pendant 4-5 h, jusqu'à ce que les lacunes sont visibles en formant de la monocouche cellulaire lorsque la plaque est observée au microscope (voir Figure 1 pour un niveau approprié de formation lacunaires).
- Recueillir le liquide surnageant, puis centrifuger pendant 10 min à 2 000 x g dans une centrifugeuse de table pour supprimer les débris cellulaires.
Remarque : Aucune centrifugeuse de dessus de table capable de produire suffisamment g force pour granuler entassée de cellules et de grandes cellules fragments peuvent être utilisés pour cette étape. - Versez le liquide surnageant dans une seringue qui possède un filtre de 0,2 µm, attaché à son extrémité, puis passer le liquide surnageant à travers le filtre pour éliminer les bactéries.
- Utilisez une partie aliquote du liquide surnageant stérile pour test de cytotoxicité (voir 2.1) et congelez le reste du liquide surnageant à-80 ° C pour une utilisation future.
2. analyse des surnageants cytotoxiques
- Test de cytotoxicité
- Pousser PMVECs dans les plats de 6 puits jusqu’au confluent. Puits de lavage une fois avec HBSS, puis ajouter 1,5 mL du surnageant stérilisée par filtration (recueillie auprès de deux cellules PA103 - ou ∆PcrV-inoculés) à puits individuels. Ajouter HBSS stérile dans un autre puits comme témoin négatif.
- Placer la plaque dans l’incubateur à CO2 pendant 21 à 24 heures, puis l’observer pour meurtre/la cytotoxicité des cellules (voir étape suivante). Utiliser les surnageants qui présentent une cytotoxicité d’expérimentation plus et jeter celles qui ne présentent pas de mort cellulaire.
- Quantification de la mort cellulaire
- Procédures recommandées mesure communiqué de lactate déshydrogénase (LDH) des cellules mortes à l’aide de Kits de dosage LDH commercialement disponibles et du fabricant.
- Vous pouvez également chiffrer mort cellulaire au microscope à l’aide de logiciels ImageJ. Pour ce faire, enregistrez les images microscopiques et zones de la boîte de Petri contenant des cellules intactes, puis quantifier les régions manquent de cellules (indicatifs de la mort cellulaire dans une monocouche) à l’aide d’une macro personnalisée d’ImageJ (National Institutes of Health) (voir fichier de codage supplémentaire ). Si vous le souhaitez, effectuer les opérations de macro manuellement comme suit :
- Entrer images (au format RVB ou Tiff) dans la macro et d’ajuster le contraste à 15 % saturés pixels. Dupliquer les images à contraste réglable et exécuter la commande « soustraire le fond » pour obtenir une image de contraste élevé de cellules et gap zone dans le champ de vision.
- Soustraire cette image de l’image originale et combiner l’image obtenue avec l’image d’origine à l’aide de la calculatrice d’image « Et » fonction. Convertir l’image résultante en noir (lacunes) et masque blanc (cellules) avec la fonction de seuil (0 minimum, maximum 5) et utiliser la fonction « binaire éroder » pour éliminer le bruit de l’image.
- Mesurer le rapport du noir au blancs pixels dans l’image résultante à l’aide de la mesure de la « fraction de l’espace ». Tracer et exprimer des zones fractionnaires pour chaque point de temps de traitement sous forme de pourcentage de la zone écart maximal.
- Moyens de calculer et de comparer avec ANOVA à test post-hoc de Tukey, avec les valeurs de p inférieure à 0,05 considérés comme significatifs.
- Analyse par immunotransfert permet d’établir la présence d’amyloïde, oligomère tau et bêta-amyloïdes dans les surnageants de culture. Effectuer une analyse par immunotransfert utilisant11,10,procédures normalisées12, à l’exception de concentrer les surnageants de culture au moins 10 fois avant l’électrophorèse.
- Pour concentrer le liquide surnageant, placez 1 à 2 mL de liquide surnageant dans une unité de filtration de centrifugation dont la membrane a un seuil de poids moléculaire de 10 kDa. Ensuite, placez le filtre dans une centrifugeuse de dessus de table et centrifuger à 2 000 x g jusqu'à ce que le degré de concentration requis soit atteint (habituellement 45-60 min).
- Déterminer la quantité de protéine dans le surnageant concentré11 et charger des quantités égales d’échantillons dans les puits du gel.
- Exécuter les gels, les protéines de transfert sur nitrocellulose, puis sonde taches avec anticorps anti-amyloïdes A11, anticorps anti-oligomères tau T22 ou anticorps d’anti-Aß MOAB2 suivie d’anticorps secondaires appropriés. Développer les taches à l’aide de procédures standard de chimiluminescence.
- Pour faire un thioflavine T test, utilisez thioflavine T fluorescence (ThT) pour quantifier les amyloïdes dans les surnageants. Pour ces mesures, utiliser les surnageants stérilisée par filtration.
- Préparer une solution (x 50) de thioflavine T en suspendant 8 mg thioflavine T (ThT) dans une solution saline tamponnée au phosphate de 10 mL (PBS). Après mélange, filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 µm pour éliminer les particules.
- Pour les mesures, ajouter 20 µL de stock ThT à 1 mL de PBS dans une cuvette de spectrophotomètre de 1 mL. Placer l’échantillon dilué dans un spectrofluorimeter.
- Mesurer l’émission de fluorescence de base à l’aide d’une excitation 425 nm et l’émission de fluorescence de 450-575 nm incréments de 2 nm de numérisation.
- Effectuer un balayage de Time-lapse utilisant une excitation 425 nm et 482 émission nm, avec les données acquises chaque 0,2 s pour 60 s.
- Les premiers 20 s du scan Time-lapse mesures de fluorescence dans la cuvette vide. À 20 s, mettre en pause le scan et ajouter 10 µL de surnageant stérilisée par filtration dans la cuvette. Mélanger la cuvette par inversion et puis remettre dans la spectrofluorimeter.
- Reprendre l’analyse temporelle, acquérant le final 40 s de données.
- À la fin du scan Time-lapse, effectuer un balayage de spectre d’émission de fluorescence final à l’aide des paramètres identiques, comme détaillé dans 2.1.5.3.
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Representative Results
Un test simple in vitro a été développé pour doser la présence de cytotoxines dans les surnageants de cellules infectées par la bactérie P. aeruginosa. Fondamentalement, milieu de culture de cellules infectées est recueilli 4 h après l’addition de bactéries, les bactéries sont éliminées par stérilisation de filtre de surnageant de la culture, et puis le surnageant stérile est ajouté à une nouvelle population de cellules. Les cellules sont ensuite observés 21 à 24 h après l’ajout de liquide surnageant et mort cellulaire est quantifiée.
Ajout de P. aeruginosa aux couches confluentes de PMVECs induit la formation des lacunes entre les cellules. In vivo, formation lacunaires conduit à un oedème pulmonaire et une diminution de la fonction pulmonaire. Dans l’essai décrit, formation lacunaires est utilisée comme le temps-point pour le dépistage de cytotoxine rejet dans les surnageants de culture cellulaire et une durée suffisamment longue d’incubation avec PA103 est indiqué par la présence de lacunes qui commencent à se former dans la monocouche cellulaire, comme le montre La figure 1. ΔPcrV bactéries n’induisent pas les lacunes de la cellule dans ces conditions d’incubation. Une fois que les lacunes sont détectés, le surnageant est collecté, filtre stérilisé et ensuite ajouté à naïf PMVECs pour évaluer l’activité cytotoxique. Les PMVECs dans les surnageants de leurs respectifs puis sont placés dans un incubateur pendant 21 à 24 h, observés et photographiés. Comme illustré à la Figure 2, surnageant prélevées par PMVECs qui avaient été infectés par une souche P. aeruginosa PA103 contient des cytotoxines qui induit la mort des cellules cultivées par 21 h après l’addition du liquide surnageant. En revanche, aucune mort cellulaire a été observée chez les cellules témoins traités avec soit médium HBSS ou des surnageant recueilli de la souche ΔPcrV de Pseudomonas. Analyse par immunotransfert ont démontré que les molécules amyloïdes, y compris les oligomère tau et bêta-amyloïdes, sont générés pendant l’infection avec la souche PA103, tandis que non amyloïdes sont générés par la souche de ΔPcrV suite à l’inoculation de la PMVECs (Figure 2). Le rôle des amyloïdes comme les cytotoxines dans cet essai a été confirmé par le protocole d’amyloïdes du surnageant avant l’addition de cellules cultivées12. Bien que non illustrée ici, protocole de cytotoxique surnageant à l’aide des anticorps anti-amyloïdes A11 et anticorps anti-tau oligomère T22 complètement épuise l’activité cytotoxique de surnageants produites suite à une infection de PA103 (Balczon et coll. 2017 12 et Balczon et al., en préparation).
Une méthode nouvelle, peu coûteux et simple de quantification de la mort cellulaire a été développée. Pour ce test, ImageJ logiciel a été adapté pour permettre la mesure directe des zones dans un champ microscopique qui manquent de cellules (indicatifs de mort cellulaire). La fiabilité de cette méthode a été vérifiée par comparaison directe avec la méthode bien établie de la cellule mise à mort, qui est communiqué de la LDH de cellules de mesure. Comme illustré à la Figure 3, ImageJ logiciel peut servir à convertir les régions d’un champ microscopique qui contiennent des cellules en blanc et les régions qui manquent de cellules au noir. Ensuite, un rapport simple des zones blanches au noir peut être utilisé pour mesurer la mort cellulaire. Lorsque vous démarrez avec une monocouche confluente de cellules, toutes les régions du champ microscopique sont blanches. Cependant, de 18 h après l’ajout des surnageants contenant des cytotoxines, lacunes dans la monocouche peuvent être détectées. Le montant de la zone de la boîte de Petri dépourvu de cellules puis augmenté de façon linéaire jusqu'à l’addition après 36 h de surnageant cytotoxique. Lorsque vous mesurez la libération de LDH, identiques obtenus, avec libération de LDH tout d’abord détectée à 18 h après l’addition du surnageant cytotoxique. Communiqué de la LDH a ensuite augmenté de façon linéaire jusqu'à ce que la mort cellulaire maximale a été mesurée à 36 h après l’addition du surnageant. Petite mort cellulaire a été mesurée dans les cellules traitées avec le surnageant recueilli de ΔPcrV inoculé des cellules (Figure 3) ou dans les cultures traitées avec HBSS pendant 36 h.
La quantité de la substance amyloïde libéré par les cellules traitées avec des bactéries peut être quantifiée par la mesure de fluorescence de la ThT. Liaison d’amyloïdes à ThT provoque un changement conformationnel dans la molécule et une augmentation dans l’intensité de la fluorescence. Pour ce test, thioflavine T est ajouté à une cuvette et base fluorescence est mesurée. L’enregistrement de la fluorescence est ensuite arrêté alors qu’il est ajoutée une petite aliquote d’échantillon. La cuve puis revient chez le fluorimètre et le changement est émission de fluorescence est enregistrée. Comme illustré à la Figure 4, surnageant recueilli des cellules ont été incubées avec PA103 souche P. aeruginosa contenues amyloïde comme en témoigne l’augmentation de l’émission de fluorescence. En revanche, surnageant de PMVECs inoculés avec la souche ΔPcrV manquait amyloïdes, comme en témoigne l’absence d’augmentation de la fluorescence.
La figure 1. Effets de P. aeruginosa inolculation sur la morphologie PMVEC. Une monocouche confluente de PMVECs avant (A) et quatre heures après l’addition (B) de la souche PA103 de P. aeruginosa. Les lacunes peuvent être visible dans la monocouche cellulaire dans les cellules infectées. Echelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Analyses des surnageants cytotoxiques. Partie [I]. Images représentatives de contrôle et les cellules traitées. PMVECs ont été traités pendant 21 h avec le liquide surnageant obtenu à partir de cellules inoculées avec soit PA103 bactéries (B) ou la souche ΔPcrV (C). Contrôle des cellules ont été incubées également 21 h avec HBSS tampon (A). Echelle = 100 µm. partie [II]. Représentant l’immuno-blot des surnageants recueillis de PA103 ou ΔPcrV (A) (B) infectés PMVECs. Buvardages ont été hybridés avec des anticorps contre amyloïdes (A11) ou oligomérique tau (T22). Mr en kDa. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Quantification de la mort cellulaire. (A) les champs de microscopiques représentatif de temps différents points (en h après addition de surnageante dans quelles régions du champ contenant et dépourvues de cellules ont été convertis soit en blanc ou noir, respectivement, à l’aide de logiciels ImageJ). La même phase contrast image avant conversion s’affiche également. Bar = 100 µm. B Comparaison de quantification des cellules tuant à l’aide de standard test de libération LDH et le dosage de ImageJ. N = 4, **p < 0,05, ***p < 0,01. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4. Données de test de fluorescence Représentant ThT. Cuvettes vides contenant ThT ont été excités à 425 nm et émission de fluorescence a été mesurée à 482 nm. Fluorescence de fond ont été recueillie pendant 20 s, puis ensuite le surnageant de chaque PA103 - ou ΔPcrV-inoculés PMVECs a été ajouté pour les cuvettes. Émission de fluorescence a été enregistrée puis pendant 40 secondes.
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Discussion
Méthodes simples en vitro figurent ici, qui permettent la démonstration de la génération des cytotoxiques amyloïdes lors de l’infection avec une pneumonie causant l’organisme. Ces méthodes incluent un test de cytotoxicité de culture cellulaire, l’immunoblotting, la quantification des cellules tuer en utilisant une nouvelle méthode microscopique et liaison ThT. Des agents cytotoxiques, les analyses ont démontré qu’ils sont amyloïdes dans la nature (Figure 2 et Figure 4) et présentent des caractéristiques d’un prion12. La génération de molécules cytotoxiques prion au cours de la pneumonie fournit une explication possible pour les taux de mortalité élevés observés chez les survivants d’une pneumonie suite à leur sortie de l’hôpital. Expériences en cours sont de tester cette possibilité.
L’événement clé pour toutes les études décrites est la génération de surnageant cytotoxique, et deux variables importantes doivent être prises en considération. Tout d’abord, chez le rat expériences décrites PMVECs ont été utilisés pour les deux l’étape de l’infection et le test de cytotoxicité. Si les autres types de cellules pourraient être utilisés pour la production de cytotoxines n’a pas été étudié en détail, et il est possible que les autres cellules soient en mesure de générer des surnageants cytotoxiques après traitement avec diverses souches de P. aeruginosa. Comme indiqué, les cytotoxines sont amyloïde dans la nature et incluent des oligomère tau et bêta-amyloïdes. Il pourrait être raisonnable de s’attendre que les autres types de cellules qui expriment la protéine amyloïde tau ou bêta pourraient être induits pour générer des cytotoxines suite à l’inoculation bactérienne, même si cette possibilité reste à être testé. Les procédures décrites pourraient servir pour examiner si les autres types de cellules peuvent être induites pour produire des cytotoxiques amyloïdes suivant différentes insultes.
La deuxième variable importante dans la génération des surnageants cytotoxiques est la durée du traitement avec des bactéries. Il est essentiel que l’incubation des PMVECs pouvoir progresser jusqu'à ce que les lacunes peuvent être vus dans la monocouche. L’identification des lacunes dans la monocouche cellulaire est un exoenzymes indication ont été injectés par les bactéries Pseudomonas dans le cytoplasme de la cellule hôte et que les exoenzymes sont actifs, entraînant rétraction des bordures des cellules (Figure 1). Notre expérience est que le moment de la rétraction des bordures de cellule est un indicateur fiable de la cytotoxine disséminés dans le surnageant. Il est tentant de supposer que les deux événements sont liés comme d'entre les amyloïdes cytotoxiques libérés est tau oligomère et perturbation de l’activité de tau se traduit par dépolymérisation des microtubules qui contribue à des changements de forme cellulaire. Dans les expériences où les traitements ont été inférieure à la quantité de temps nécessaire pour induire la formation de gap, peu mature amyloïde cytotoxique a été détecté.
Le test de cytotoxicité décrit dans ce manuscrit est simple et fiable. La mort des cellules peut être observée facilement par un examen microscopique et quantifiée directement à partir des images microscopiques enregistrées. Les méthodes décrites ici ont été utilisées exclusivement pour évaluer la production de cytotoxine suite à une infection des cellules endothéliales pulmonaires de rat par la P. aeruginosa. Il semble probable que les procédures peuvent être facilement adaptés pour évaluer si les cytotoxiques amyloïdes sont produites suite à une infection avec autre pneumonie causant des agents, y compris les deux infections nosocomiales associées aux bactéries et les bactéries et les virus responsables de extra-hospitalière types de pneumonie. En outre, les procédures déclarées ont seulement servis à examiner cytotoxique génération amyloïde lors de l’infection de cellules cultivées. Culture cellulaire est un système artificiel, et les procédures décrites ici très probablement pourraient être adaptés à l’évaluation de la production de cytotoxines pendant l’infection pulmonaire de modèles animaux et des patients humains. Prélever des liquides biologiques, tels que lavage broncho-alvéolaire, provenant des animaux infectés ou malades pourrait être utilisé dans les mêmes types de tests rapportés ici afin de déterminer si les cytotoxiques amyloïdes sont générés au cours du processus d’infection in vivo. Évidemment, les durées d’incubation avec des bactéries peuvent être tout à fait différentes lors de l’inoculation en animaux et lavage broncho-alvéolaire devront être prélevés à plusieurs point de temps pour déterminer la durée finale du traitement.
Les analyses immunoblot ont démontré que les amyloïdes sont présents dans les surnageants, y compris les oligomère tau et bêta-amyloïdes (Figure 3). Bien que les procédures de transfert sont standards, il est une étape clé qui doit être effectuée avant d’entreprendre des analyses immunoblot. Plus précisément, il est crucial que les surnageants soit concentré au moins dix fois avant immunoblotting comme la quantité de la substance amyloïde dans le surnageant non concentré est inférieure à la limite de détection par analyse par immunotransfert. Comme indiqué ici, à l’aide de tubes, équipés d’un filtre de centrifugation est la méthode couramment utilisée pour cette étape de concentration, mais il semble raisonnable que les autres méthodes, tels que les précipitations de TCA, serait tout aussi utile pour cette étape.
La quantification des cellules tuer en utilisant des images constitue une avancée importante. Actuellement les procédures disponibles pour quantifier la mort cellulaire s’appuient sur l’achat de kits assez chers qui permettent de mesurer la libération de LDH des cellules mortes. Le test décrit ici implique sans frais comme ImageJ programmes sont gratuits à télécharger sur le site de NIH. L’adaptation simple des programmes de ImageJ permet une mesure assez précise de la mort cellulaire. Toutefois, il est intéressant de souligner que quelques artefacts mineurs sont rencontrées pendant l’exécution du protocole décrit. Le problème majeur est que les fragments de cellules, telles que les zones de contact focal, peuvent rester associés à la boîte de Pétri comme cellules meurent. Ces fragments de cellules résiduelles peuvent être détectées par la caméra et donnent une indication artificielle que les cellules restent sur le plat. Par conséquent, il est rare qu’une valeur de mort cellulaire 100 % est obtenue à l’aide de cette procédure.
Une faiblesse du système de dosage rapporté est que les amyloïdes de cytotoxine dans la préparation n’ont jamais été complètement définis. Par conséquent, la quantification est difficile. Tests ELISA peuvent être utilisés pour fournir les niveaux totaux de différents amyloïdes, sans fournir aucune explication détaillée sur les différentes espèces dans chaque préparation. Jusqu'à ce que des analyses plus précises, telles que masse-spec ou in vitro synthétisé oligomères amyloïdes, peuvent être développés, le mieux que l'on peut faire à l’heure actuelle consiste à lancer chaque expérience avec le même nombre de cellules, incuber pendant la même durée et vérifiez que cytotoxicité se produit aux mêmes taux que les préparations précédentes qui ont été utilisées. Variation de n’importe lequel des normes bien établies introduit une incertitude supplémentaire.
En résumé, méthodes simples in vitro sont présentés pour démontrer la production de molécules amyloïdes toxiques par les cellules endothéliales pulmonaires suite à une infection par un agent qui causent la pneumonie. Les tests sont fiables et sans doute peuvent être adaptés pour d’autres organismes et destinés à l’aide de fluides biologiques provenant d’animaux infectés et des patients humains. Ces méthodes seront utiles pour les études portant sur les conséquences à long terme de pneumonie et d’établir les mécanismes conduisant à la défaillance terminale d’organes chez les patients après la sortie de l’hôpital.
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Disclosures
Aucun rapport.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée en partie grâce à des subventions de NIH HL66299 TS, RB et SL, HL60024 à TS et HL136869 MF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit anti beta amyloid | Thermo | 71-5800 | |
| A11 amyloid oligomer antibody | StressMarq | SPC-506D | |
| T22 anti-tau oligomer antibody | EMD Millipore | ABN454 | |
| Thioflavin T | Sigma Aldrich | T3516 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 0.22 micron syringe filters | Millipore | SLGP033RS | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| HRP Goat antirabbit IgG | Abcam | ab6721-1 | |
| Strains PA103 and ΔPcrV | These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI | ||
| FITC Griffonia lectin | Sigma Aldrich | L9381 | |
| TRITC Helix pomatia lectin | Sigma Aldrich | L1261 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| 0.22 micron nitrocellulose | BioRad | 162-0112 | |
| Type 2 collagenase | Worthington | LS004176 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30898.03IH | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| Carbenicillin Disodium salt | Sigma | C1389 | |
| Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off | Millipore | UFC801008 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496-500G | |
| Magnesium phosphate heptahydrate | MP Biomedicals | MP021914221 | |
| Citric Acid | G Biosciences | 50-103-5801 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9506-500G | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10277 |
References
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