在 vivo小鼠创面模型中活性氧的成像
Summary
我们描述了一种非侵入性的体内成像协议, 该协议具有简化且具有成本效益的特性, 它利用 l-012 (一种化学发光发光-模拟) 来可视化和量化小鼠切除伤口模型中产生的活性氧物种 (ros)。
Abstract
活性氧 (ros) 的产生是炎症过程的标志, 但过度, 氧化应激广泛涉及各种疾病, 如癌症, 动脉粥样硬化和糖尿病。我们以前已经证明, 核因子 (红血球衍生 2) 类似 2 (Nrf2)/开克样红血球细胞衍生蛋白 1 (keap1) 信号通路导致在糖尿病皮肤伤口愈合过程中的极端 ros 不平衡。由于 ros 水平是伤口愈合进展的重要指标, 具体和准确的定量技术是有价值的。介绍了几种用于测量细胞和组织中 ros 的体外检测方法;但是, 它们只为每个样本提供一个累积测量。最近, 基于蛋白质的指标和成像方式的发展使得能够进行独特的时空分析。l-012 (c13h8 cln4nao2) 是一种发光醇衍生物, 可用于在体内和体外化学发光检测 napdh 氧化酶产生的 ros.l-012 发出的信号比其他荧光探针更强, 并且已被证明对检测 ros 既敏感又可靠。l-012 辅助成像的延时适用性提供了有关炎症过程的宝贵信息, 同时减少了牺牲的需要, 并全面减少了研究动物的数量。在这里, 我们描述了一个协议, 利用 l-012 促进的体内成像量化氧化应激模型的切除伤口愈合使用糖尿病小鼠与局部功能失调 nrf2/keap1。
Introduction
通过炎症过程产生的氧代谢物有助于各种信号级联以及细胞成分的破坏性改变1。利用敏感和特定的技术来测量 ros 是研究炎症过程和描述氧化应激的影响的关键。体内成像是有价值的, 因为它能够提供动态的空间和时间数据在活组织。l-012 是一种合成化学发光探针, 对超氧化物阴离子高度敏感, 在细胞、组织和全血1、2、3、4. 已成功地用于小鼠模型的体内成像, 以研究几种炎症性疾病, 包括关节炎和结肠炎5,6。它尚未被应用于已建立的皮肤伤口愈合模型。测量产生的 ros 对于评估不同条件下伤口愈合的进展同样重要。这种方法的敏感性和非侵入性使其成为研究小鼠模型伤口愈合的一种有前途的技术。
nrf2 是抗氧化反应的主要驱动因素, 也是一种特殊的抗氧化反应元素 (are) 的转录因子, 这些元素是几种抗氧化酶8的启动子区域所共有的。在没有氧化应激的情况下, nrf2 被 keap1 隔离在细胞质中, 从而导致其普遍化和降解。nrf和解1途径的不平衡与不适当的氧化还原稳态和延迟伤口愈合有关, 在氧化应激增加的背景下 9.我们以前已经证明, 抑制 keap1 刺激增加 nrf2 活性, 并促进挽救治疗病理皮肤伤口愈合在糖尿病伤口9。
在这里, 我们描述了一个协议, 利用 l-012 辅助生物发光成像测量 ros 水平在一个切除皮肤伤口愈合模型, 这是至关重要的突出 ros 和伤口愈合之间的联系。这项技术显示了伤口和周围氧化负荷的实时变化。此外, 这种方法可以对影响氧化还原处理的干预措施和机制进行快速评估。在这里, 我们使用keap1 敲除模型来恢复氧化还原稳态, 以评估我们的策略的适用性。因为我们的技术是无创的, 伤口不受干扰, 同一动物可以用于进一步的确认分析的基础上, 组织学或细胞裂解物。
Protocol
Representative Results
Discussion
测量 ros 的常用技术受到需要组织提取或类似侵入性技术的复杂协议的限制。近年来, 氧化应激的测量是在创新成像方式的基础上报告的, 从而允许对 9、10、11进行时空评估。l-012 作为相对于发光醇、露西根宁和 mcla1,4 的化学发光探针, 具有多种优点。该化合物无毒, 易于吸收, 与发光?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢纽约大学医学院的临床前成像核心, 并特别感谢奥兰多阿里斯蒂萨瓦尔和优素福扎姆·瓦德吉里。核心是由 laura 和 isaac perlmutter 癌症中心支持赠款 nihci nhci 5p30ca016087 和 nibib 生物医学技术资源中心 grant nih p41 eb017183 部分支持的共享资源。这项工作得到了美国糖尿病协会 “阻止糖尿病之路” (原案 1-16-ace-08) 和纽约大学应用研究支助基金对 p. r. 的支持。
Materials
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
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