Na Vivo Imagens de espécies reativas de oxigênio em um Murine ferida modelo
Summary
Descrevemos um não-invasivo na vivo de imagem protocolo que é simplificada e custo-benefício, utilizando o L-012, um analógico-luminol quimioluminescente, para visualizar e quantificar as espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas em um modelo do rato excisional ferido.
Abstract
A geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) é uma característica dos processos inflamatórios, mas em excesso, estresse oxidativo é amplamente envolvido em várias patologias como câncer, aterosclerose e diabetes. Mostramos anteriormente que a disfunção do fator Nuclear (eritroide-derivado 2)-tipo 2 (Nrf2) / eritroide Kelch-como derivado de células proteína 1 (Keap1) sinalização percurso leva ao extremo desequilíbrio ROS durante cutânea cicatrização em diabetes. Desde que os níveis ROS são um importante indicador da progressão da cicatrização, técnicas de quantificação específica e precisos são valiosas. Têm sido descritos vários ensaios em vitro para medir ROS em células e tecidos; no entanto, eles apenas fornecem uma única medida cumulativa por amostra. Mais recentemente, o desenvolvimento de indicadores baseados em proteína e as modalidades de imagem permitiram análises spatiotemporal exclusivas. L-012 (C13H8ClN4NaO2) é um derivado de luminol que pode ser usado tanto em vivo e em vitro quimioluminescente deteção de ROS gerado pelo oxidase NAPDH. L-012 emite um sinal mais forte do que outras sondas fluorescentes e tem se mostrado sensível e confiável para a detecção de ROS. A aplicabilidade de lapso de tempo de L-012-facilitou a imagem fornece informações valiosas sobre processos inflamatórios, reduzindo a necessidade de sacrifício e globalmente, reduzindo o número de animais de estudo. Aqui, descrevemos um protocolo utilizando L-012-facilitado na vivo por imagens para quantificar o estresse oxidativo em um modelo de cicatrização de feridas excisional usando ratos diabéticos com localmente disfuncional Nrf2/Keap1.
Introduction
Metabólitos de oxigênio gerados através de processos inflamatórios contribuam para diversas cascatas de sinalização, bem como alteração destrutiva de componentes celulares1. Utilizando técnicas sensíveis e específicas para medir ROS é crítico para estudar processos inflamatórios e caracterizar os efeitos do estresse oxidativo. Imagem latente na vivo é valioso devido à sua capacidade para fornecer dados de dinâmicos espaciais e temporais em tecido vivo. L-012 é uma sonda quimioluminescente sintética que é altamente sensível para ânions superóxido e produz uma intensidade de luz mais elevada do que outras sondas fluorescentes em células, tecidos e sangue total1,2,3, 4. tem sido empregado com sucesso para a imagem latente na vivo em modelos murino para estudar várias doenças inflamatórias, incluindo artrite e colite5,6. Ainda tem que ser empregado numa ferida cutânea estabelecida modelo de cura. Medição de ROS gerado é igualmente relevante para avaliar a progressão da cicatrização de feridas em condições diferentes. A sensibilidade e a natureza não-invasiva deste método torna uma técnica promissora para estudar a cicatrização de feridas em modelos murino.
Nrf2 é um grande condutor da resposta antioxidante e um fator transcricional com especificidade para o elemento de resposta antioxidante (são) comum às regiões promotor de várias enzimas de antioxidante8. Na ausência de estresse oxidativo, Nrf2 é sequestrado no citoplasma por Keap1, que posteriormente provoca sua ubiquitination e degradação. Desequilíbrio da via Nrf2/Keap1 tem sido implicado na homeostase redox inapropriado e posterior cicatrização no cenário de maior estresse oxidativo9. Anteriormente mostramos que a supressão de Keap1 estimula o aumento da atividade Nrf2 e promove resgate da cicatrização de feridas cutâneas patológica no diabético feridas9.
Aqui descrevemos um protocolo que utiliza bioluminescência L-012-assistida de imagem para medir os níveis ROS em um modelo de cura ferida cutânea excisional, que é fundamental para destacar a associação entre ROS e cicatrização de feridas. Esta técnica demonstra alterações em tempo real em carga oxidativa dentro feridas e periferia imediata. Além disso, este método permite rápida avaliação de intervenções e mecanismos de manipulação de redox que afetam. Aqui usamos um modelo de Keap1 nocaute para a restauração da homeostase redox para avaliar a aplicabilidade da nossa estratégia. Porque nossa técnica é não-invasivo e feridas são imperturbadas, o mesmo animal pode ser usado para mais confirmação análises com base em lysates histologia ou célula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Técnicas comuns de medição ROS tem sido limitadas pela protocolos complexos que requerem a extração do tecido ou da mesma forma técnicas invasivas. Nos últimos anos, as medidas de estresse oxidativo têm sido relatadas com base nas modalidades de imagem inovadoras, permitindo assim que para avaliações spatiotemporal9,10,11. L-012 tem várias vantagens, como uma sonda quimioluminescente relativo MCLA1</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos gratos ao núcleo pré-clínicos Imaging a NYU School of Medicine, com agradecimento especial a Orlando Aristizabal e Youssef Zaim Wadghiri. O núcleo é um recurso compartilhado, parcialmente apoiado pela Laura e Isaac Perlmutter Cancer Center suporte Grant NIH/NCI 5P30CA016087 e NIBIB biomédica Technology Resource Center Grant NIH P41 EB017183. Este trabalho foi apoiado pela Associação Americana de Diabetes “Caminho para parar de Diabetes” D.C. [número de concessão 1-16-ACE-08] e NYU aplicado apoio fundo de investigação para relações públicas.
Materials
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
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