En Vivo Proyección de imagen de especies reactivas de oxígeno en un murino herida modelo
Summary
Describimos una invasiva en vivo imagen protocolo que es sencilla y económica, utilizando L-012, un análogo de quimioluminiscente luminol, para visualizar y cuantificar las especies de oxígeno reactivo (ROS) generadas en un modelo de ratón por escisión de la herida.
Abstract
La generación de especies reactivas del oxígeno (ROS) es un rasgo distintivo de los procesos inflamatorios, pero en exceso, el estrés oxidativo está ampliamente implicado en diversas patologías como cáncer, aterosclerosis y diabetes. Previamente hemos demostrado que la disfunción del factor Nuclear (derivados del eritroide 2)-como 2 (Nrf2) / eritroide Kelch-como célula proteína derivada Keap 11señalización vía conduce al desequilibrio extremo de ROS durante cutáneo cicatrización en la diabetes. Puesto que los niveles ROS son un importante indicador de la progresión de la cicatrización de heridas, técnicas de cuantificación específicas y precisas son valiosas. Diversos estudios en vitro para medir ROS en las células y los tejidos han sido descritas; sin embargo, sólo proporcionan una medición acumulativa individual por muestra. Más recientemente, han permitido el desarrollo de indicadores basados en la proteína y de modalidades de imágenes únicos análisis espaciotemporal. L-012 (C13H8ClN4NaO2) es un derivado luminol que puede utilizar para tanto en vivo como en vitro quimioluminiscente detección de ROS generados por la oxidasa NAPDH. L-012 emite una señal más fuerte que otras sondas fluorescentes y se ha demostrado para ser sensible y confiable para la detección de ROS. La aplicabilidad de lapso de tiempo de L-012-facilitó la proyección de imagen proporciona información valiosa sobre los procesos inflamatorios mientras reduce la necesidad de sacrificio y en general reduciendo el número de animales de estudio. Aquí, describimos un protocolo utilizando L-012-facilitado en vivo la proyección de imagen para cuantificar el estrés oxidativo en un modelo de cicatrización de la herida excisional con ratones diabéticos de Nrf2/Keap1 localmente disfuncional.
Introduction
Metabolitos de oxígeno generados por procesos inflamatorios contribuyen a varias cascadas de señales así como alteraciones destructivas de componentes celulares1. Utilización de técnicas sensibles y específicas para medir ROS es crítica para el estudio de procesos inflamatorios y caracterización de los efectos del estrés oxidativo. Proyección de imagen in vivo es valioso debido a su capacidad para proporcionar datos dinámicos espaciales y temporales en tejido vivo. L-012 es una sintético sonda quimioluminiscente que es altamente sensible para los aniones superóxido y produce una mayor intensidad de luz que otras sondas fluorescentes en las células, tejidos y sangre entera1,2,3, 4. se ha empleado con éxito para obtener imágenes en vivo en modelos murinos para estudiar varias enfermedades inflamatorias, como artritis y colitis5,6. Aún no se ha empleado en una herida cutánea establecida modelo de curación. Medición de ROS generados es igualmente pertinente para evaluar la progresión de la cicatrización en condiciones diferentes. La sensibilidad y el carácter no invasivo de este método es una técnica prometedora para el estudio de la cicatrización de heridas a través de modelos murinos.
Nrf2 es un importante factor de la respuesta antioxidante y un factor transcripcional con especificidad para el elemento de respuesta antioxidante (es) común a las regiones promotoras de varios antioxidantes enzimas8. En ausencia de estrés oxidativo, el Nrf2 es secuestrado en el citoplasma por Keap1, que posteriormente causa su ubiquitinación y degradación. Desequilibrio de la vía Nrf2/Keap1 se ha implicado en la homeostasis redox inadecuado y retraso de la cicatrización de heridas en el ajuste del aumento del estrés oxidativo9. Previamente hemos demostrado que la supresión de Keap1 estimula la actividad creciente de Nrf2 y promueve el rescate de herida cutánea patológica curación en diabético hiere a9.
Aquí se describe un protocolo que utiliza bioluminiscencia L-012-asistido para medir los niveles de ROS en un modelo de curación herida cutánea por escisión, que es fundamental para destacar la asociación entre el ROS y la cicatrización de la proyección de imagen. Esta técnica muestra en tiempo real cambios en carga oxidativa dentro de las heridas y periferia inmediata. Además, este método permite una evaluación rápida de las intervenciones y mecanismos manejo de redox afectan. Aquí utilizamos un modelo de Keap1 caída para la restauración de la homeostasis redox para evaluar la aplicabilidad de nuestra estrategia. Ya que nuestra técnica es no invasiva y las heridas son inalteradas, el mismo animal puede utilizarse para mayores análisis confirmatorios a partir de lisados de histología o celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Técnicas comunes para la medición de ROS han sido limitadas por protocolos complejos que requieren la extracción de tejido o técnicas invasivas. En los últimos años, se han reportado mediciones del estrés oxidativo sobre la base de modalidades de imágenes innovadoras, permitiendo evaluaciones spatiotemporal9,10,11. L-012 tiene varias ventajas como sonda quimioluminiscente luminol, lucigenina y MCLA1</su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la base de la proyección de imagen preclínica en la Facultad de medicina de NYU, con agradecimiento especial a Orlando Aristizabal y Youssef Zaim Wadghiri. La base es un recurso compartido parcialmente apoyado por el 5P30CA016087 Laura y Isaac Perlmutter cáncer centro apoyo beca NIH/NCI y NIBIB biomédica tecnología recursos centro subvención NIH P41 EB017183. Este trabajo fue apoyado por la American Diabetes Association “Vía para detener la Diabetes” el NYU aplicado investigación fondo de apoyo a P.R. y D.C. [número 1-16-ACE-08]
Materials
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
References
- Nishinaka, Y., et al. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
- Daiber, A., et al. Measurement of NAD(P)H oxidase-derived superoxide with the luminol analogue L-012. Free Radical Biology and Medicine. 36 (1), 101-111 (2004).
- Imada, I., et al. Analysis of reactive oxygen species generated by neutrophils using a chemiluminescence probe L-012. Analytical Biochemistry. 271 (1), 53-58 (1999).
- Sohn, H. Y., Gloe, T., Keller, M., Schoenafinger, K., Pohl, U. Sensitive superoxide detection in vascular cells by the new chemiluminescence dye L-012. Journal of Vascular Research. 36 (6), 456-464 (1999).
- Fuchs, K., et al. In vivo Hypoxia PET Imaging Quantifies the Severity of Arthritic Joint Inflammation in Line with Overexpression of Hypoxia-Inducible Factor and Enhanced Reactive Oxygen Species Generation. The Journal of Nuclear Medicine. 58 (5), 853-860 (2017).
- Asghar, M. N., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in murine colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 20 (8), 1435-1447 (2014).
- Galiano, R. D., Michaels, J. t., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair and Regeneration. 12 (4), 485-492 (2004).
- Soares, M. A., et al. Restoration of Nrf2 Signaling Normalizes the Regenerative Niche. Diabetes. 65 (3), 633-646 (2016).
- Wang, X., et al. Imaging ROS signaling in cells and animals. Journal of Molecular Medicine. 91 (8), 917-927 (2013).
- Kielland, A., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radical Biology and Medicine. 47 (6), 760-766 (2009).
- Balke, J., et al. Visualizing Oxidative Cellular Stress Induced by Nanoparticles in the Subcytotoxic Range Using Fluorescence Lifetime Imaging. Small. , (2018).
- Zielonka, J., Lambeth, J. D., Kalyanaraman, B. On the use of L-012, a luminol-based chemiluminescent probe, for detecting superoxide and identifying inhibitors of NADPH oxidase: a reevaluation. Free Radical Biology and Medicine. 65, 1310-1314 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signalling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Rabbani, P. S., et al. Targeted Nrf2 activation therapy with RTA 408 enhances regenerative capacity of diabetic wounds. Diabetes Research and Clinical Practice. 139, 11-23 (2018).
- Rabbani, P. S., et al. Novel lipoproteoplex delivers Keap1 siRNA based gene therapy to accelerate diabetic wound healing. Biomaterials. 132, 1-15 (2017).
