Vivo Reaktif oksijen türleri içinde bir fare görüntüleme modeli yara
Summary
Biz bir non-invaziv vivo içinde aerodinamik ve maliyet-etkin, protokolü Imaging görselleştirmek ve reaktif oksijen türlerine (ROS) bir fare excisional yara modelinde oluşturulan ölçmek için L-012, bir chemiluminescent luminol-analog, kullanan açıklar.
Abstract
Reaktif oksijen türleri (ROS) nesil iltihabi süreçleri özelliğidir ama fazla, oksidatif stres yaygın kanser, ateroskleroz ve diyabet gibi çeşitli patolojileri içinde karıştığı. Daha önce nükleer faktör (2 erythroid elde edilen) bu disfonksiyon göstermiştir-2 (Nrf2) hangi tarihlerde / yol açar aşırı ROS dengesizlik kutanöz sırasında sinyal Kelch benzeri erythroid protein 1 (Keap1) hücre kaynaklı yara diyabet şifa. ROS düzeyleri yara iyileşme progresyon önemli bir göstergesi olduğundan, özel ve doğru miktar teknikleri değerlidir. ROS hücre ve dokulara ölçmek için birkaç vitro deneyleri tarif var; Ancak, onlar sadece örnek başına tek bir toplu ölçüm sağlar. Daha yakın zamanlarda, protein bazlı göstergeleri ve görüntüleme yöntemleri benzersiz kronolojik zamanmekansal analizleri için izin. L-012 (C13H8ClN4NaO2) içinde vivo ve in vitro chemiluminescent için kullanılabilir bir luminol türevi olan NAPDH oksidaz tarafından oluşturulan ROS tespiti. L-012 Diğer Floresan problar daha güçlü sinyale yayar ve hassas ve güvenilir ROS algılama olduğu gösterilmiştir. L-012-kolaylaştırdı görüntüleme zaman atlamalı uygulanabilirliği ise kurban gereksinimini azaltma ve genel olarak çalışma hayvan sayısını azaltarak iltihabi süreçleri hakkında değerli bilgiler sağlar. Burada, L-012-kolaylaştırdı vivo içinde yerel olarak işlevsel olmayan Nrf2/Keap1 ile diyabetik fare kullanarak excisional yara iyileşmesi bir modeldir oksidatif stres ölçmek için Imaging kullanan bir iletişim kuralı açıklar.
Introduction
Oksijen metabolitleri inflamatuar işlemler üretilen çeşitli sinyal cascades hem de hücresel bileşenleri1yıkıcı İLETİMLERİNİZE katkıda. ROS ölçmek için hassas ve belirli teknikler kullanan iltihabi süreçleri eğitim ve oksidatif stresin etkilerini karakterize için önemlidir. Vivo görüntüleme canlı dokuya dinamik uzamsal ve zamansal veri sağlamak yeteneği nedeniyle değerlidir. Süperoksit anyon için son derece hassas ve Diğer Floresan problar hücre, doku ve tam kan1,2,3, daha yüksek bir ışık şiddeti üreten bir sentetik chemiluminescent sonda L-012 olduğunu 4. bu başarıyla vivo içinde görüntüleme fare modelleri için çeşitli inflamatuar hastalıklar, artrit ve kolit5,6dahil olmak üzere çalışmaya istihdam edilmiştir. Modeli şifa kurulan bir kutanöz yarada istihdam edilecek henüz. Oluşturulan ROS ölçümü farklı koşullar altında yara iyileşmesi ilerlemeyi değerlendirmek aynı derecede uygundur. Duyarlılık ve bu yöntemin invaziv olmayan doğa arasında fare modelleri yara iyileşmesi için umut verici bir yüntem yapar.
Nrf2 antioksidan yanıt ve bir transkripsiyon faktörü antioksidan yanıt öğesi (vardır) birçok antioksidan enzimler8organizatörü bölgelerinde yaygın için özgüllük ile büyük bir sürücüdür. Oksidatif stres, yokluğunda Nrf2 sitoplazma içinde daha sonra onun ubiquitination ve düşmesine neden olan Keap1 tarafından münzevi. Nrf2/Keap1 yolu dengesizlik uygunsuz redoks homeostazı ve artmış oksidatif stres9ayarında gecikmiş yara iyileşmesi karıştığı olmuştur. Biz daha önce Keap1 bastırılması artan Nrf2 etkinliği uyarır ve teşvik göstermiştir diyabetik içinde patolojik kutanöz yara iyileşme Kurtarma yarası9.
Burada L-012-destekli bioluminescence ROS ile yara iyileşmesi arasındaki ilişkiyi vurgulamak için önemlidir excisional kutanöz yara iyileşme modelinde ROS düzeyleri ölçmek için Imaging kullanan bir iletişim kuralı açıklar. Bu teknik oksidatif yük yaralar ve acil çevre içinde gerçek zamanlı değişiklikleri gösterir. Ayrıca, bu yöntem hızlı değerlendirme müdahaleler ve mekanizmaları için bu etkiler redoks işleme sağlar. Burada biz bir modelini Keap1 nakavt redoks homeostazı restorasyonu için stratejimiz uygulanabilirliğini değerlendirmek için kullanın. Bizim non-invaziv bir tekniktir ve yaralar rahatsız oldukları için aynı hayvan histolojisi veya hücre lysates temelinde daha fazla doğrulama analizleri için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
ROS ölçmek için ortak teknikleri doku çekme ya da benzer şekilde invaziv teknikler gerektiren karmaşık iletişim kuralları tarafından sınırlı sahip. Son yıllarda, böylece kronolojik zamanmekansal değerlendirmeler9,10,11izin yenilikçi görüntüleme yöntemleri temelinde ölçümleri oksidatif stres bildirilmiştir. L-012 chemiluminescent bir sonda luminol, lucigenin ve FREDY271,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NYU School of Medicine, Orlando Aristizabal ve Youssef Zaim Wadghiri teşekkür etmek istiyorum ile görüntüleme preklinik özünde için minnettarız. Kısmen Laura ve Isaac Perlmutter Kanser Merkezi destek hibe NIH/ncı 5P30CA016087 ve NIBIB biyomedikal teknolojisi kaynak merkezi Grant NIH P41 EB017183 tarafından desteklenen bir paylaşılan kaynak çekirdeğidir. Bu eser DC [grant numarası 1-16-as-08] ve NYU uygulanan araştırma destek fonu için halkla ilişkiler için Amerikan Diyabet Derneği “Yolu için durdurmak diyabet” tarafından desteklenmiştir
Materials
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
References
- Nishinaka, Y., et al. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
- Daiber, A., et al. Measurement of NAD(P)H oxidase-derived superoxide with the luminol analogue L-012. Free Radical Biology and Medicine. 36 (1), 101-111 (2004).
- Imada, I., et al. Analysis of reactive oxygen species generated by neutrophils using a chemiluminescence probe L-012. Analytical Biochemistry. 271 (1), 53-58 (1999).
- Sohn, H. Y., Gloe, T., Keller, M., Schoenafinger, K., Pohl, U. Sensitive superoxide detection in vascular cells by the new chemiluminescence dye L-012. Journal of Vascular Research. 36 (6), 456-464 (1999).
- Fuchs, K., et al. In vivo Hypoxia PET Imaging Quantifies the Severity of Arthritic Joint Inflammation in Line with Overexpression of Hypoxia-Inducible Factor and Enhanced Reactive Oxygen Species Generation. The Journal of Nuclear Medicine. 58 (5), 853-860 (2017).
- Asghar, M. N., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in murine colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 20 (8), 1435-1447 (2014).
- Galiano, R. D., Michaels, J. t., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair and Regeneration. 12 (4), 485-492 (2004).
- Soares, M. A., et al. Restoration of Nrf2 Signaling Normalizes the Regenerative Niche. Diabetes. 65 (3), 633-646 (2016).
- Wang, X., et al. Imaging ROS signaling in cells and animals. Journal of Molecular Medicine. 91 (8), 917-927 (2013).
- Kielland, A., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radical Biology and Medicine. 47 (6), 760-766 (2009).
- Balke, J., et al. Visualizing Oxidative Cellular Stress Induced by Nanoparticles in the Subcytotoxic Range Using Fluorescence Lifetime Imaging. Small. , (2018).
- Zielonka, J., Lambeth, J. D., Kalyanaraman, B. On the use of L-012, a luminol-based chemiluminescent probe, for detecting superoxide and identifying inhibitors of NADPH oxidase: a reevaluation. Free Radical Biology and Medicine. 65, 1310-1314 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signalling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Rabbani, P. S., et al. Targeted Nrf2 activation therapy with RTA 408 enhances regenerative capacity of diabetic wounds. Diabetes Research and Clinical Practice. 139, 11-23 (2018).
- Rabbani, P. S., et al. Novel lipoproteoplex delivers Keap1 siRNA based gene therapy to accelerate diabetic wound healing. Biomaterials. 132, 1-15 (2017).
