Vivo에서 영상에는 Murine 반응성 산소 종의 상처 모델
Summary
우리는 비-침략 적 vivo에서 이미징 프로토콜을 간소 하 고 비용 효율적인, L-012, chemiluminescent luminol 아날로그, 시각화 하 고 계량 상처 excisional 마우스 모델에서 생성 된 반응성 산소 종 (선생님)을 활용 하 여 설명 합니다.
Abstract
반응성 산소 종 (ROS)의 발생, 염증 성 프로세스의 특징 이지만 널리 초과, 산화 스트레스는 암, 동맥 경화, 당뇨병 등 다양 한 병 리 연루. 우리 핵 요인 (erythroid 파생 2)의 그 역 기능으로 나타났습니다 이전-2 (Nrf2) 같은 Kelch 같은 erythroid 세포 유래 단백질 1 (Keap1) 신호 통로 피부 동안 극단적인 선생님 불균형에 이르게 상처 당뇨병에 치유 /. 선생님 수준 상처 치유의 진행의 중요 한 지시자 이기 때문에, 구체적이 고 정확한 정량화 기술 가치가 있습니다. 세포와 조직에서 선생님을 측정 하기 위해 여러 생체 외에서 분석 설명 되었습니다; 그러나, 그들은 단지 샘플 당 단일 누적 측정을 제공합니다. 더 최근에, 단백질 기반 지표 및 이미징 modalities의 개발은 독특한 spatiotemporal 분석에 대 한 수 있다. L-012 (C13H8ClN4NaO2)은 luminol 파생 모두 vivo에서 그리고 생체 외에서 chemiluminescent에 사용할 수 있는 NAPDH 산화 효소에 의해 생성 된 선생님의 탐지. L-012 다른 형광 프로브 보다 더 강한 신호를 방출 하 고 과민 하 고 선생님을 탐지 하기 위한 신뢰할 수 있는 것을 보여줘 왔다. 시간 경과 적용 L 012 촉진 이미징의 희생에 대 한 필요성을 줄이고 전반적인 연구 동물의 수를 감소 하는 동안 염증 성 프로세스에 대 한 귀중 한 정보를 제공 합니다. 여기, 우리는 프로토콜 L 012 촉진 하는 비보에 이미징 excisional 상처 치유 로컬 역 기능 Nrf2/Keap1와 당뇨병 쥐를 사용 하 여 모델에서 산화 스트레스 척도를 활용 하 여 설명 합니다.
Introduction
염증 성 프로세스를 통해 생성 된 산소 대사 산물 세포 구성 요소1의 파괴적인 변경 뿐만 아니라 다양 한 신호 폭포에 기여 한다. 선생님을 측정에 과민 하 고 특정 기술을 활용 하는 것이 염증 성 프로세스를 공부 및 산화 스트레스의 효과 대 한 중요 합니다. Vivo에서 화상 진 찰은 조직 생활에에서 동적 공간 및 시간 데이터를 제공 하는 기능 때문에 중요 합니다. L-012는 superoxide 음이온에 대 한 매우 민감한 이며 생산 하는 세포, 조직, 및 전 혈1,2,3, 에서 다른 형광 프로브 보다 높은 빛의 강도 합성 chemiluminescent 조사 4. 그것은 성공적으로 고용 되었다 vivo에서 화상 진 찰 murine 모델에 대 한 여러 염증 성 질환, 관절염, colitis5,6을 포함 하 여 공부 하. 그것은 아직 설립된 피부 상처 치유 모델에에서 채택 한다. 생성 된 선생님의 측정은 동등 하 게 다른 조건 하에서 상처 치유의 진행 평가 관련이 있다. 이 방법의 비 침 투 적인 자연과 감도 네요 murine 모델에 걸쳐 상처 치유를 공부 하는 유망 기술.
Nrf2 항 산화 반응과 transcriptional 요소 여러 항 산화 효소8의 발기인 지구에 공통 항 산화 반응 요소 (는)에 대 한 특이성의 주요 드라이버입니다. 산화 스트레스의 부재, Nrf2는 세포질에 연속적으로 그것의 ubiquitination 및 저하를 일으키는 원인이 되는 Keap1에 의해 격리 됩니다. Nrf2/Keap1 통로의 불균형 부적절 한 산화 환 원 항상성 및 산화 스트레스를 증가9의 설정에서 지연된 상처 치유에 연루 되었습니다. 우리가 나타났습니다 이전 Keap1의 Nrf2 활동 증가 자극 하 고 촉진 당뇨병 pathologic 피부 상처 치유의 구조9상처.
여기는 L 012를 이용한 생물 발광 excisional 피부 상처 치유 모델 선생님과 상처 치유 사이 협회를 강조를 위해 중요 하다는 선생님 수준을 측정에 이미징 사용 하는 프로토콜에 설명 합니다. 이 기술은 산화 부담 상처와 즉각적인 주변 내에서 실시간으로 변화를 보여 줍니다. 또한,이 방법은 신속한 개입 및 메커니즘의 평가 대 한 그 영향을 산화 환 원 처리 수 있습니다. 여기 사용 Keap1 최저 모델 산화 환 원 항상성의 복원에 대 한 우리의 전략의 적용 가능성을 평가 합니다. 우리의 기술은 비 침략 적 이며 상처를 방해 하지 않습니다, 때문에 같은 동물 조직학 또는 세포 lysates 기초 더 확실 한 분석을 위해 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
선생님을 측정 하기 위한 일반적인 기법 조직 추출 또는 침략 적 기술이 필요로 하는 복잡 한 프로토콜에 의해 제한 되어 있다. 최근 몇 년 동안, 산화 스트레스의 측정 spatiotemporal 평가9,,1011에 대 한 수 있도록 혁신적인 이미징 형식에 근거 하 여 보고 되었습니다. L-012는 luminol, lucigenin, 및 MCLA1,<sup class…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 전 임상 이미징 코어는 NYU의과 대학에, 올랜도 Aristizabal와 유세 프 Zaim Wadghiri 특별 한 감사. 핵심은 부분적으로 라와이 삭 단 암 센터 지원 그랜트 NIH/NCI 5P30CA016087 및 NIBIB 생물 의학 기술 리소스 센터 그랜트 NIH P41 EB017183에서 지 원하는 공유 자원 이다. 이 작품은 DC [1-16-에이스-08 부여 번호]와 홍보에 NYU 적용 연구 지원 기금에 미국 당뇨병 협회 “통로를 중지 당뇨병”에 의해 지원 되었다
Materials
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
References
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