אין ויוו הדמיה של מינים חמצן תגובתי ב מאתר פצע מודל
Summary
אנו מתארים יישום לא פולשנית ויוו הדמיה פרוטוקול מאופין בעיצוב חסכוני, ניצול L-012, chemiluminescent הלומינול-אנלוגי, כדי להמחיש ולכמת מינים חמצן תגובתי (ROS) שנוצר במודל של עכברים excisional פצע.
Abstract
הדור של מינים חמצן תגובתי (ROS) מהווה סימן היכר של תהליכים דלקתיים, אך עודף, סטרס חמצוני הוא נרחב בהפרות פתולוגיות שונות כגון סרטן, טרשת עורקים, סכרת. אנחנו בעבר הראו כי תפקוד של הגורם הגרעיני (נגזר erythroid 2)-אוהב 2 (Nrf2) / כמו Kelch erythroid תא, נגזר חלבון 1 (אותו1) איתות לשביל מוביל לחוסר איזון ROS קיצוני במהלך עורית פצע ריפוי סוכרת. מאז רמות ROS הן אינדיקטור חשוב של התקדמות של ריפוי הפצע, כימות ספציפי ומדויק בטכניקות הם בעלי ערך. תוארו מספר במבחנה מבחני למדוד ROS ב תאים ורקמות; עם זאת, הם רק מספקים מידה מצטברות יחיד עבור דגימה. לאחרונה, הפיתוח של מחוונים מבוססי חלבונים ושל שיטות הדמיה אפשרו עבור ניתוחים ייתכן ייחודי. L-012 (C13H8ClN4נאו2) היא נגזרת הלומינול יכול לשמש הן בתוך vivo והן במבחנה chemiluminescent זיהוי של ROS שנוצר על ידי אוקסידאז NAPDH. L-012 פולטת אות חזק יותר מאשר אחרים הגששים פלורסנט, הוכח להיות רגיש וגם אמינה לגילוי ROS. זמן לשגות תחולתה של L-012-ידי הדמיה מספק מידע חשוב אודות תהליכים דלקתיים תוך כדי הקטנת הצורך להקריב, הכולל הפחתת מספר חיות מחקר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ניצול L-012-ידי ויוו הדמיה לכמת סטרס חמצוני במודל של ריפוי הפצע excisional שימוש בעכברים סוכרתיים עם Nrf2 לא מתפקדת באופן מקומי/Keap1.
Introduction
מטבוליטים החמצן שנוצר באמצעות תהליכים דלקתיים לתרום cascades איתות שונים, כמו גם שינוי ההרסני של מרכיבי התא1. ניצול טכניקות רגישות וספציפיות למדוד ROS חיוני ללמוד תהליכים דלקתיים, אפיון השפעת סטרס חמצוני. דימות in vivo יקר בשל יכולתה לספק נתונים יכולות דינמיות ברקמת החיים. L-012 שווה בדיקה chemiluminescent סינתטי, כי היא רגישה מאוד עבור אניונים סופראוקסיד מייצרת עוצמת אור גבוה יותר מאשר אחרים הגששים פלואורסצנט תאים, רקמות, ו דם1,2,3, 4. זה כבר בהצלחה מועסקים עבור הדמיה ויוו במודלים מאתר ללמוד מספר מחלות דלקתיות, כולל דלקת מפרקים ו קוליטיס5,6. זה טרם ישתלב פציעה עורית הוקמה ריפוי מודל. מדידה של ROS שנוצר רלוונטי באותה מידה להעריך את ההתקדמות של ריפוי הפצע בתנאים שונים. הרגישות ואת הטבע לא פולשנית של שיטה זו הופכת טכניקה המבטיחים לימוד ריפוי הפצע על פני דגמים מאתר.
Nrf2 הוא מנהל התקן הגדולות של תגובת חמצון, גורם תעתיק עם ירידה לפרטים לרכיב נוגד חמצון תגובה (הם) נפוצה באזורים המקדם של אנזימים נוגדי חמצון מספר8. בהיעדרו של סטרס חמצוני, Nrf2 הוא מבודד בציטופלסמה על-ידי Keap1, מה שגורם לאחר מכן שלה ubiquitination והשפלה. חוסר איזון של הנתיב Nrf2/Keap1 היה מעורב חמצון-חיזור בלתי הולם הומאוסטזה ומתת ריפוי הפצע מושהית בסביבה של לחץ חימצוני מוגבר9. אנחנו בעבר הראו כי דיכוי Keap1 מעוררת פעילות Nrf2 מוגברת מקדם הצלה של ריפוי פצעים עורית פיפטות ב סוכרת פצעים9.
כאן נתאר פרוטוקול אשר מנצל ביולומינסנציה L 012-בסיוע הדמיה כדי למדוד רמות ROS במודל הפצע עורית excisional הריפוי, אשר הוא קריטי עבור הדגשת הקשר בין ROS לבין ריפוי הפצע. טכניקה זו מדגים שינויים בזמן אמת עומס חמצוני בתוך הפצעים ואת הפריפריה הקרובה. יתר על כן, שיטה זו מאפשרת להערכה מהירה של התערבויות ומנגנונים טיפול חמצון-חיזור זה משפיע. כאן אנו משתמשים מודל של נוקאאוט אותו1 לשיקום חמצון-חיזור הומאוסטזיס כדי להעריך את הישימות של האסטרטגיה שלנו. מכיוון הטכניקה שלנו אינה פולשנית הפצעים הם ללא הפרעה, אותה חיה יכול לשמש עבור נוסף מאשרות ניתוחים על בסיס היסטולוגיה או תא lysates.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקות נפוצות למדידת ROS מוגבלות פרוטוקולים מורכבים הדורשים שאיבת רקמות או בדומה לכך טכניקות פולשניות. בשנים האחרונות, מדידות של סטרס חמצוני דווחו על בסיס שיטות הדמיה חדשניות, ובכך לאפשר הערכות ייתכן9,10,11. L-012 יש מספר יתרונות כמו בדיקה chemil…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו אסירי תודה עד היסוד פרה הדמיה בית הספר NYU לרפואה, עם תודה אורלנדו אריסטיסאל יוסוף Zaim Wadghiri מיוחדת הליבה הוא משאב משותף נתמכת באופן חלקי על ידי לורה, יצחק פרלמוטר סרטן מרכז תמיכה גרנט NIH/NCI 5P30CA016087 NIBIB ביו טכנולוגיה משאב מרכז גרנט NIH P41 EB017183. עבודה זו נתמך על ידי האגודה האמריקנית לסוכרת “מסלול כדי סוכרת להפסיק” בבירה [גרנט מספר 1-16-אייס-08], NYU להחיל מחקר תמיכה לקרן יחסי ציבור
Materials
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
References
- Nishinaka, Y., et al. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
- Daiber, A., et al. Measurement of NAD(P)H oxidase-derived superoxide with the luminol analogue L-012. Free Radical Biology and Medicine. 36 (1), 101-111 (2004).
- Imada, I., et al. Analysis of reactive oxygen species generated by neutrophils using a chemiluminescence probe L-012. Analytical Biochemistry. 271 (1), 53-58 (1999).
- Sohn, H. Y., Gloe, T., Keller, M., Schoenafinger, K., Pohl, U. Sensitive superoxide detection in vascular cells by the new chemiluminescence dye L-012. Journal of Vascular Research. 36 (6), 456-464 (1999).
- Fuchs, K., et al. In vivo Hypoxia PET Imaging Quantifies the Severity of Arthritic Joint Inflammation in Line with Overexpression of Hypoxia-Inducible Factor and Enhanced Reactive Oxygen Species Generation. The Journal of Nuclear Medicine. 58 (5), 853-860 (2017).
- Asghar, M. N., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in murine colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 20 (8), 1435-1447 (2014).
- Galiano, R. D., Michaels, J. t., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair and Regeneration. 12 (4), 485-492 (2004).
- Soares, M. A., et al. Restoration of Nrf2 Signaling Normalizes the Regenerative Niche. Diabetes. 65 (3), 633-646 (2016).
- Wang, X., et al. Imaging ROS signaling in cells and animals. Journal of Molecular Medicine. 91 (8), 917-927 (2013).
- Kielland, A., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radical Biology and Medicine. 47 (6), 760-766 (2009).
- Balke, J., et al. Visualizing Oxidative Cellular Stress Induced by Nanoparticles in the Subcytotoxic Range Using Fluorescence Lifetime Imaging. Small. , (2018).
- Zielonka, J., Lambeth, J. D., Kalyanaraman, B. On the use of L-012, a luminol-based chemiluminescent probe, for detecting superoxide and identifying inhibitors of NADPH oxidase: a reevaluation. Free Radical Biology and Medicine. 65, 1310-1314 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signalling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Rabbani, P. S., et al. Targeted Nrf2 activation therapy with RTA 408 enhances regenerative capacity of diabetic wounds. Diabetes Research and Clinical Practice. 139, 11-23 (2018).
- Rabbani, P. S., et al. Novel lipoproteoplex delivers Keap1 siRNA based gene therapy to accelerate diabetic wound healing. Biomaterials. 132, 1-15 (2017).
