Summary
在这里,我们介绍原子力显微镜(AFM),作为细胞和组织纳米和微缩进工具。该仪器允许同时采集样品的三维表面地形及其机械特性,包括细胞壁杨的模量以及 turgor 压力。
Abstract
我们在这里介绍使用原子力显微镜来缩进植物组织并恢复其机械性能。在缩进模式下使用两种不同的显微镜,展示了如何测量弹性模量,并用它来评估细胞壁的机械性能。此外,我们还解释了如何评估 turgor 压力。原子力显微镜的主要优点是它是非侵入性的,相对快速(5~20分钟),几乎任何类型的活植物组织表面平坦,无需治疗即可进行分析。分辨率可能非常好,具体取决于尖端大小和单位面积的测量次数。此方法的一个限制是,它只提供直接访问表面细胞层。
Introduction
原子力显微镜 (AFM) 属于扫描探针显微镜 (SPM) 系列,其中半径通常为几纳米的尖端扫描样品表面。表面的检测不是通过光学或电子方法实现的,而是通过尖端和样品表面之间的相互作用力实现的。因此,该技术不仅限于样品表面的地形特征化(3D分辨率可下降到几纳米),而且还允许测量任何类型的相互作用力,如静电、范德瓦尔或接触力。此外,尖端可用于在生物样品表面施加力并测量由此产生的变形,即所谓的"缩进",以确定其机械特性(例如,Young 的模量、粘弹性特性)。
植物细胞壁的机械特性是在试图理解发育过程1、2、3的基础机制时必须考虑的。事实上,这些特性在发育过程中受到严格控制,特别是因为细胞壁软化是允许细胞生长所必需的。AFM 可用于测量这些属性,并研究它们在器官、组织或发育阶段之间的变化方式。
在本文中,我们描述了我们如何使用AFM测量细胞壁的机械特性和土姆压力。这两种应用在两种不同的 AFM 显微镜上进行了演示,之后将在此详细介绍。
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Protocol
1.细胞壁机械性能的测量
注:给出了阿拉伯经体发育的陀螺的例子。
- 生物样品的制备
- 根据公布的阶段测定,在阶段9至10(约0.5毫米长)收集封闭的花蕾。在双筒望远镜下,使用细钳子,小心地打开芽,检查发育阶段,并收集位于花中心的陀螺仪。
- 将陀螺放在双侧胶带上,放在小培养皿盖的中心(直径为 5 厘米)。
注:作为替代方案,生物相容性胶水还可用于在缩进时更有效地固定样品。 - 快速加水,直到样品完全覆盖。这样可以避免脱水,并减少尖端对样品的粘附。或者,将样品浸入液体介质中,如阿拉伯拟南芥顶培养基5。
- AFM 校准
- 将悬臂弹簧常量k设置得足够高,使样品表面的变形达到所需的压痕,但不要过高以避免灵敏度损失。
注:粗略的经验法则是,如果已知 Young 的样本模量,则可以选择弹簧常数的量级作为k=E = =,其中#是所需的缩进。 - 使用R = 400 nm 球形端尖,具有 15 μm 尖端悬臂距离。
注:尖端半径与横向分辨率直接相关。通常,对于生物材料的缩进,选择圆尖(R大于 10-20 nm)或胶体探头。小型胶体探头可能难以使用,因为尖端和悬臂之间的距离很小,可以接触样品表面。 - 在实验前至少 2-3 小时打开软件并水平放置头部:这将允许头部进行热化,并避免热感应悬臂激光相对运动。如果显微镜配备了CellHesion模块(将可用的Z压电范围扩展到100μm,而不是15μm),请先打开控制器,然后在启动软件时选择细胞振取模式。
- 将悬臂安装在玻璃块上,并将块安装在头上。将几微升超纯水滴放在尖端,以避免在尖端浸入水中时形成气泡。
- 放置硬样品(清洁玻璃幻灯片或蓝宝石),并加入 30-50 μL 的超纯水。
注:此处描述的校准过程是有时称为触点校准。首先,在坚硬平坦的表面上形成力曲线,然后记录热激发悬臂的振荡光谱,以计算弹簧常数。存在其他校准协议,将在讨论段落中简要说明。 - 将头部放在舞台上(小心将 Z 电机提升到足够高的位置)。使用光学图像大致将激光放在悬臂上。
- 沿着悬臂的主轴移动激光,监测光电二极管上的总和信号。
注:当使用标准吊带时,应获得大于 0.5 V 的总和。 - 沿另一个方向移动激光并最大化总和信号,以便将激光定位在悬臂的中间。这将最大限度地减少横向和垂直偏转之间的串扰。
- 沿着悬臂的主轴移动激光,监测光电二极管上的总和信号。
- 偏转灵敏度的测量
注:光电二极管读取激光位移并提供以伏特为单位的信号。为了能够测量公制单位的偏转,必须测量偏转灵敏度。- 在接触和力光谱中设置仪器。将相对设定点设置为 2 V,将 Z 长度设置为 0.5 μm,并将速度扩展至 2 μm/s(采样率至 10000 Hz),然后选择Z 闭环。
- 打开校准管理器并选择力曲线的接触部分(应为线性)以进行线性拟合:斜率的反向给出偏转灵敏度。光电二极管读数现在以公制单位校准。
-
确定弹簧常数。在校准管理器中,选择弹簧常数以运行热频谱采集。要使信号在较长时间内平均,请选择 + 符号。热激发悬臂的功率谱可能显示几个峰值;围绕位于最低频率的一个选择来适合它。
注:如果在液体中执行热调谐,谐振峰值将比标称峰值更宽,频率降低。
- 将悬臂弹簧常量k设置得足够高,使样品表面的变形达到所需的压痕,但不要过高以避免灵敏度损失。
- 力光谱实验设置和采集
- 将样品放在 AFM 级,并将头部放在样品上。
注:确保头部已缩回足以避免尖端和样品表面之间的硬接触。 - 让悬臂热化几分钟。
- 在QI模式下,使用设定点力为 50 nN 的方法。
- 将 Z 长度设置为 4 μm,将扫描区域设置为 80 x 80 μm 2,像素数为 40 x 40。在"高级成像设置"面板中,将模式设置为恒定速度。将扩展和缩回速度设置为 200 μm/s,将采样速率设置为 25 kHz。
- 开始扫描并使用此快速低力扫描来检查样本是否移动。验证扫描区域是否无碎屑或偏转的电池,并找到尽可能平坦的区域以执行测量。
注:为了欣赏真正的样品倾斜,线平平应设置为OFF或常量。压痕轴和曲面之间的过度倾斜角度将对测量的 Young 模量5产生影响。 - 找到感兴趣区域后,选择周围 40 x 40 到 60 x 60 μm2的区域,并增加像素数以达到 2 像素/μm。 如有必要,在实验开始时调整此值。将 Z 长度减小到 2 μm。将扩展和缩回速度减小到 100 μm/s,并将采样速率提高到 50 kHz。
- 开始扫描并保存输出(通常由图像和数据文件组成)。
- 在测量日结束时,拆下尖端支架,用超纯水和 70% EtOH 轻轻冲洗。
- 干燥并拆下悬臂。对于使用同一尖端进行进一步实验,请考虑使用湿清洁方案进行清洁,如果可能,考虑进行后续等离子 O2处理。不要让水在悬臂和/或尖端支架上干燥,以避免盐结晶。
- 将样品放在 AFM 级,并将头部放在样品上。
- 数据分析(适用于 6.x 数据处理软件版本)
- 打开数据处理软件并加载数据文件。
- 单击"使用此地图进行批处理"按钮,以便在地图的所有曲线上使用相同的分析参数。
- 在加载预定义过程中,选择赫兹拟合。
- 使用第一个选项卡验证或更改校准参数。
- 在第二个选项卡中,从基线中删除偏移量(或偏移加倾斜),将其平均值设置为 0。
- 在第三个选项卡中,通过将接触点 (POC) 位置视为从沿延伸曲线的设定点值向下时跨越 0 力的第一个点来估计接触点 (POC) 位置。
- 选项卡"垂直尖端"位置通过从"高度测量"中减去悬臂偏转来计算齿尖移动。在此步骤中,通过选中相应的复选框,对以下拟合使用"未平滑高度"(原始数据)。
- 在弹性拟合选项卡中,选择适当的拟合模型。如果缩回曲线上看不到或弱附着力(对应于设定点力的 10% 或所选缩进深度上的最大平均力),则模型类型应设置为赫兹/Sneddon,并应使用延伸曲线。在粘附性更强的情况下,DMT 模型(代表 Derjaguin-Muller-Toporov 模型)应优先使用,并且应在缩回曲线上进行拟合(有关可用接触模型和相关公式的详细信息,请参阅手册)。
- 根据标称尖端形状设置尖端几何参数。在这里,尖形是球体,尖端半径是400nm。
- 将泊成比设置为 0.5,就像通常对生物材料(对应于不可压缩材料)所做的那样。
-
适合特定的缩进。默认情况下,拟合在整个曲线上执行。如果拟合必须达到特定的缩进,请首先选中"移位曲线"复选框;如果拟合必须达到特定缩进,请先选中"移位曲线"复选框。这将根据新确定的基线和 POC 值移动曲线的原点。
- 通过单击主窗口中的图标,添加第二个弹性拟合例程。
- 再次设置所有拟合参数,并在X 分钟指定所需的缩进。根据需要添加尽可能多的步骤(2 到 3 个步骤应足够),以便优化 POC 位置的确定,并随后计算缩进深度。此时可以保存该过程。
- 单击"保留并应用于所有"以迭代地图所有曲线上的上述步骤。
- 保存结果。将获取图像和 .tsv 文件。
2. 图尔戈尔压力的测量
注:给出了阿拉伯花的奥里扎林处理花序素的例子。
- 生物样品的制备
- 收集阿拉伯蛋白酶花序肌(IM)处理与微管脱聚药物奥里扎林从体外植物生长在含有极性辅助素运输抑制剂1-N-Naphthphphphthphthaala酸(NPA)的介质上按照已公布的方法6.
- 在两个选项之一之后安装 IM 示例
- 长期监测:将样品安装在含有阿拉伯拟南芥顶培养基(ACM)7、8和0.1%的植物保鲜混合物(PPM)中,以防止污染。将 IM 尖端悬挂在 ACM 表面上方,用 2% 的角珠支持 IM 底座。
- 对于快速的溶液变化进行测量:将样品安装在培养皿中,手持一小块胶粘剂,用生物兼容的胶水快速密封粘胶和样品基之间的间隙。等待胶水凝固(小于 2 分钟),然后将样品浸入含有 0.1% PPM 的液体 ACM 中。
注:固定样品底座时,确保样品表面没有涂覆胶合胶或胶水。AFM 测量的 turgor 压力要求样品稳定安装,而以前的安装方法可提供可接受的稳定性。根据样品的不同,可以使用其他安装方法,如双面胶带、聚莱酶等。
- AFM 校准
- 打开 AFM 采集软件并选择峰值力 QNM(大振幅)测量模式。
- 按照步骤 2.1 到 2.6 中描述的相同原则执行校准。
- 在"检查参数"窗口中,将"扫描"大小设置为 0。在"斜坡"窗口中,将斜带尺寸设置为 200 nm 和 500 nm 之间,将Trig 阈值设置为 2 V 和 5 V,将样本数设置为 2048 或更高。
- 将悬臂尖端与校准样品对齐,然后单击"接近"。
- 联系后,转到"斜坡"窗口,然后单击"连续斜坡"按钮。在曲线的线性系统上,单击"更新灵敏度"按钮确定斜率。多次重复偏转灵敏度测量,并通过从"校准"菜单打开 Tab检测器,手动更新具有测量平均值的校准。
- 缩回 AFM 头并拆下校准样品。
注:建议通过选择"标签阶段+ 初始化"来完全缩回 AFM 头,以防止在样品更改时意外发生硬接触。
- 力光谱实验设置和采集
- 如果样品尚未浸没,则将其浸入含有 PPM 的液体 ACM 中。
- 在采集软件中,指定测量参数,如下所示:
- 在Check 参数窗口中,将弹簧常数设置为悬臂的制造弹簧常数或步骤 2.8 中确定的弹簧常数。在此示例中,它设置为 42 N/m。
- 在此示例中,将尖端半径设置为 400 nm。
- 将样本泊松的比率设置为 0.5,因为水主要对 turgor 压力负责。
- 将样品/生产线设置为 128,以确保快速采集。
- 将扫描速率设置为 0.2 Hz。
- 将扫描大小设置为 1 μm。
注:设置扫描速率和扫描尺寸较小可有效防止 AFM 扫描触发的样本损坏。建议在任何样本更改时减少这两个参数。 - 在"斜坡"窗口中,将斜坡大小设置为 5 μm。
注:它更好地设置大于预期缩进深度的斜坡尺寸,从而更好地获得基线。 - 将三角阈值设置为最大值。
- 将样本数设置为 4608。
- 或者,在显微镜 + 啮合参数选项卡中,减少以下参数,以防止强烈的接触引起的样品损坏。将峰值力啮合设定点设置为 0.3 V(默认为 0.5 V)。将"啮合"增益设置为 0.5(默认为 0.75)。将SPM 接合步骤设置为 4 μm(默认为 15 μm)。
- 将样品置于 AFM 头下并对齐,然后接近悬臂,直到悬臂被淹没,但未与样品表面接触。
注:接近时,轻轻吹打液体ACM表面,直到悬臂和液体表面之间形成液体桥。这通常可以防止硬接触。 - 小心,手动接近示例。当探头相对靠近样品表面时,单击"接近"。
- 接触时,逐渐增加扫描尺寸和/或扫描速率,直到达到所需的平衡,而不会损坏样品和/或悬臂。
注:扫描尺寸受样品的表面曲率和粗糙度的限制。在奥里扎林处理的IM的情况下,50 x 50 μm2扫描区域可以达到扫描速率为0.3赫兹。 - 扫描时,确定测量区域是否如需要。如果需要,可重新定位。满足后,单击"点"和"拍摄"按钮以启动点和拍摄窗口。
- 在记录扫描之前,请选择适当的图像通道,以方便清晰识别细胞轮廓。通常,峰值力误差、DMT 模量、LogDMT 模量或耗散是合适的。指定保存目录和文件名。然后单击下一次扫描的"斜坡"以启动录制。
注:指定文件名(如 .000)后将自动添加一个点和三个数字的字符串。每次保存的扫描重复时,此数字会自动增加 1。 - 扫描完成后,软件界面将自动重定向到Ramp窗口。单击扫描的图像以指定要缩进的位置。
注:在记录缩进之前,最好选择几个地标来执行测试缩进,只需单击"Ramp",以防需要参数交替(对于斜坡大小、压电位置等)。缩进深度需要大于细胞壁厚(最好通过透射电子显微镜单独确定)。 - 选择每个细胞靠近其重心至少三个缩进位,并每个位点重复三次。这将产生每个单元至少 9 个力曲线,以便进一步分析。当对缩进网站放置满意时,单击"斜坡"并捕获。强制缩进曲线将自动保存到指定的目录中。
- 坡道完成后,重新定位到其他位置进行切片测量,或缩回扫描头并更改样本。
- 完成后,如步骤 1.3.8 和 1.3.9 中一样清洁悬臂。
- 数据分析
- 在分析软件中,打开 *.mca 文件。这将显示扫描图像上每个力曲线的位置。如果需要,请预先选择力曲线进行分析。
- 打开一个要分析的力曲线,通常采用x0000y.00z的格式,其中 x 是保存目录中的指定文件名,而 y 和 z 是自动注册的数字,表示缩进序列和扫描编号。
- 单击"基线校正"按钮并拖动力曲线上的蓝色短划线,直到"延伸源基线开始"和"延伸源基线停止"分别为 0% 和 80%。单击"执行"。
注:或者,扩展源基线停止可以设置为不同的值,只要它仍然在基线内,而不是超出接触点。 - 单击Boxcar 过滤器按钮,然后单击"执行"以平滑力曲线。
- 单击"缩进"按钮。
- 在"输入"窗口中,将活动曲线设置为"延伸"。
- 将拟合方法设置为线性化模型,并将粘附力设置为"是"。
- 将最大力拟合边界设置为 99%,将最小力拟合边界设置为 75%。
- 将拟合模型设置为刚度(线性)。
注:此设置将计算用于 turgor压力推导的表观刚度 k。在此示例中,拟合边界反映约 1.5 μm 缩进深度的刚度拟合。
- 力曲线可以分批分析。单击"运行历史记录"按钮,指定报表目录,并添加需要相同处理的所有其他力曲线。满足后,单击"运行"。默认情况下,拟合将存储为 *.txt 文件。
- 当k批量安装时,单击"历史记录" 5 缩进以返回到缩进窗口。
- 将最大力拟合边界更改为 10%,将最小力拟合边界更改为 0%。
- 将拟合模型设置为赫兹安(球形)。
注: 这将计算细胞壁杨的模量E的 turgor 压力推导。在此示例中,拟合边界反映大约 0.4 μm 缩进深度的赫兹安拟合(使用球形探头)。
- 对批次适合E重复步骤 2.4.6。
- 打开 *.00z 文件(z 是自动注册的扫描号码)以显示不同的扫描通道。在"高度"通道窗口中,单击"部分"按钮。这将允许测量样品的表面曲率,这是预测压力扣除所必需的。
- 跨一个单元格的长轴绘制一条线,将虚线边界移动到像元边缘,并记录半径值r1。对短轴重复此操作以检索半径r2。使用两个半径测量值计算细胞表面均率=M和高斯曲率+G,如下所示:
和
- 跨一个单元格的长轴绘制一条线,将虚线边界移动到像元边缘,并记录半径值r1。对短轴重复此操作以检索半径r2。使用两个半径测量值计算细胞表面均率=M和高斯曲率+G,如下所示:
- 使用发布9的薄壳模型推断 turgor 压力P,如下所示:
与
其中t是由电子显微镜等决定的细胞壁厚度。
注:推导 turgor 压力是一个合适的过程,需要迭代。四次迭代通常能够重现稳定的产品,但可以执行更多迭代(例如 100 次)。 - 计算每个单元格的平均 E、k 和P。此外,注册细胞内变异性(例如标准偏差)以进行记录。
和
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Representative Results
图 1A和图 1B显示了一个屏幕截图,其中说明了协议步骤 1.3.4 到 1.3.6 的结果,用于查找获取 QI 映射的感兴趣区域。值得一提的是,选择感兴趣的区域是为了不倾斜表面(即尽可能平坦)。事实上,正如Routier等人所注意到的,如果缩进轴不垂直于表面,那么所测得的杨的模量就被低估了。此效果在图 1的 C 或 D 面板的右上角可见,其中部分单元格的边框看起来比单元格的其余部分更柔和。这种效应引起的人工制品在美利多斯的情况下会更强,局部倾斜角度可以很容易地克服 50 x 50 μm2扫描区域的 40°。在我们的实验室中,我们目前正在开发一种基于 Routier 等人5所述方法的算法,以纠正这些人工制品(正在准备的纸张)。图 1C和图 1D显示了在协议第四段中详细分析后获得的 Young 模量图。特别是,面板 C 表示对整个缩进(用户定义的力设定点)进行分析的 Young 的模量,而面板 D 显示前 100 nm 缩进分析的结果(如步骤 1.4.9 中所述)。在这里,2个地图看起来非常相似,因为在实验设置期间,为了获得大约 100 nm 的平均缩进,选择了设定点。分析的缩进的变化有时可以更好地突出样本异质性,这有助于识别位置或提供有关内部结构行为的信息(例如,Costa 等人10)
图 2中的力曲线显示了两个值得一提的效果。首先,可以注意到,如果力曲线的接近部分实际以 500 nN 的设定点力结束,则向下尖端运动继续移动,这意味着尖端施加的最终力高于预期(此处为 1,000 nN)。这是因为监测悬臂偏转的反馈回路不能立即作用,因此其有限的反应时间在偏转阈值检测和压电运动停止之间引入滞后。此外,特别是在使用移动样品架的CellHesion时,运动部件的惯性会起作用,从而使这种时滞更长。此问题可以通过使用头压电来限制,在这种情况下,用户必须非常小心,在非常粗糙或倾斜的样品上进行测量,或者降低斜坡速度,这无论如何都会限制扫描的样本的分辨率和/或数量(此外,对于速度太慢的地图,样品生长可能会成为一个问题)。通常,如果力曲线彼此足够远(根据选择的缩进模型,可以计算缩进面积的半径,并用作最小分离距离),在不同样本沿线的位置不应相关,如果在方法曲线上执行分析,则克服力阈值不应成为问题。无论如何,如果样品是微妙的,或者如果重复扫描在同一区域,科学家可能想要尽量减少这种过冲。不幸的是,没有经验法则来确定这种过冲的数量,因为它取决于在斜坡速度上使用的压电,但也取决于材料属性:材料越硬,偏转信号随时间的变化越快,,给定有限的反馈响应时间,过冲越高。
需要注意的第二件事是椭圆突出显示的缩回曲线上的摆动。这种挥动可以是样品在尖端作用下移动/振动的指示器。在这种情况下,用户可以尝试更改扫描区域(有时显微镜的其他部分,但尖端可以触摸样品,或者样品可能没有足够的固定到其支持)或样品,如果其中几个已经准备在同一支持。如果功能始终存在,最好更改固定方法,在这种情况下,从双面胶带固定切换到生物相容性胶水。
图 3描述了对 turgor 压力推导的关键参数的确定。除由电子显微镜单独测定为+740 nm的细胞壁厚度11外,每个参数都可以从AFM扫描和缩进中检索。在步骤 2.4.10 中的安装过程之后,此力曲线的 turgor 压力推导为 1.50 MPa。汇集此单元中的所有 18 个力曲线,得出E = 6.77 ± 1.02 MPa 的平均值,k = 14.18 = 2.45 N/m,P = 1.45 = 0.29 MPa(均值 = 标准差)。
图 1:地形图(测量高度)通常在实验期间获取。(A) 记录第一个低分辨率/低力图,以找到适合扫描的区域。(B) 获得一个较小的高分辨率/更高力图,用于计算 Young 的模量(在黑色虚线方块突出显示的区域)。(C) 杨的模量图从 B 地图计算,详见步骤 1.4。在这里,获得了杨的模量图,分析了每个力曲线上的整体缩进。(D) 杨的模量图只分析前100纳米的缩进。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:力曲线示例。以蓝色表示方法,以红色表示缩回段。由于反馈回路反应时间有限和惯性,最大力(位于缩回曲线上)与力设定点不同。回伸曲线中的摆动可以代表样本固定与其支撑的不足。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:用于对 turgor 压力推导的 AFM 测量值。(A) DMT 模量图显示清晰的细胞轮廓,以监督细胞中心附近深缩位点的定位。缩进站点用十字标记。(B) A中红十字位置处深缩进的力曲线。细胞壁 Young 的模量E(绿色)和样品表观刚度k(红色)安装在曲线的不同系统,如步骤 2.4 中详述的那样。R2表示拟合的确定系数。(C) 高度贴图,其高度图具有手动确定的长轴和短轴,由白线描述,在面板 A 和 B 中分析的同一单元格的高度图谱(D) 面板 C 中单元格的长轴和短轴的高度轮廓(蓝色、长轴红色、短轴)和配合d 曲率半径 (r1和r2).请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
植物形态的出现主要取决于时间和空间内生长的协调速率和方向。植物细胞被包裹在由多糖基质制成的刚性细胞壁中,这些基质将它们粘在一起。因此,细胞膨胀由细胞壁上的 turgor 压力拉扯和细胞壁的刚度与抵抗这种压力之间的平衡控制。为了理解发育背后的机制,能够测量细胞壁的机械特性以及特定器官的不同组织或细胞中的turgor压力是很重要的。如本文所示,AFM 是在此背景下的选择方法。
协议中有几个关键步骤。第一个是组织准备,应该足够快,以避免脱水。这尤其至关重要,如果我们想要测量 turgor 压力。非常重要的是,样品正确固定在基材上:不稳定的样品会导致非常明显的效果,如宏观运动,易于光学检测,或力曲线的强烈变形。无论如何,样品振动或弯曲可以微妙的检测,引入人工制品的结果。最后,另一个关键步骤涉及缩进参数的选择。这是结果质量的决定因素。
在大面积测量机械性能(超过 40-50 μm 扫描尺寸)时,高度差异可能很高,因此很难正确跟踪表面并实现力曲线,而未达到 Z 压电范围的限制。为了克服此问题,使用了 CellHesion 模块。此模块在样品阶段添加了一个额外的 Z 压电,具有 100 μm 范围,允许在不接近危险的 Z 压电限制的情况下进行大面积采集。
该方法的第一个限制是,我们只能测量表面的细胞层。然而,最近作者在组织部分使用AFM在组织部分12,13,14。虽然必须在固定材料上完成此操作,但它可以访问深层细胞层的机械特性。或者,对活体样本进行更深的缩进,以推断生命样本上内部组织的机械特性,尽管在空间分辨率15上牺牲了更大的部分。第二个限制可以链接到样品几何体,因为具有陡坡的表面可能会有问题,因为尖端不再垂直于样品。我们需要限制测量可靠的角度范围,我们目前正在开发一种算法来纠正与这一现象相关的潜在伪影。此外,一些组织覆盖三头肌,可以阻止测量。最后,缩进测量与细胞表面垂直方向的机械性能,我们可以怀疑这是否能与与生长能力相关的细胞壁扩展性轻松连接。几项研究表明,情况是15,16。
值得在这里做一个更一般的意见,对AFM的测量/应用力。如协议部分所述,为了能够将光电二极管上的激光位移转换为力,必须进行校准。在此校准中,一个参数,即偏转灵敏度,允许将激光位移转换为实际悬臂偏转(通常以 nm 为单位),因此此因子将光电二极管输出电压(沿垂直轴)校准为纳米。第二个因素是弹簧常数 K,以 N/m 为单位测量,它转换力单位(通常为 nN)的垂直悬臂偏转,因为柔性悬臂器与弹簧一样。即使该过程看似简单,对于 AFM 力谱测量的K进行可靠且可重复的校准仍然是一个问题,因为不同的误差源可能会影响该过程的不同步骤。例如,在刚性表面上实现力曲线的偏转灵敏度的测量,如果尖端在表面上滑动,或者表面未完全清洁,或者如果表面电荷导致静电排斥,则可能导致不正确的值。在前面的所有情况下,力曲线的接触部分将变形(进一步倾斜或弯曲,而不是线性)。
协议部分中描述的接触过程只是现有几个校准程序之一。至少有 2 种方法可以相对简单和廉价的方式使用:Sader 方法(在某些 AFM 软件中实现时也称为非接触方法)或参考悬臂方法。Sader 方法17最初由 John Sader 为 V 形吊杆开发,然后用于矩形杆18,不需要在刚性基板上获取力曲线。相反,用户需要指定(在接触方法中的温度之外)、悬臂的长度和宽度以及悬臂所在的流体的密度和粘度(通常是空气、水或类似水的流体)。然后获得热谱,测量偏转灵敏度和弹簧常数。当使用非常锋利或功能化的尖端时,这种方法在刚性基板上执行力曲线时可能会损坏,因此此方法非常有利。
上述两种方法都与热激发悬臂的振荡光谱的获取有关。在室温下使用刚性吊杆时,平均振荡幅度可小于0.1nm,使谐振峰更小,更难检测。无论如何,至少对于本文中使用的两种仪器,谐振峰值实际上可以在空气和水中检测到,并适合测量弹簧常数(考虑到在液体中进行测量时,谐振频率会向较低方向移动值和峰值扩大)。
第三种方法不使用热调谐,而是使用参考悬臂或参考弹性结构,具有已知的弹簧常数(通常不确定度在 5% 左右或低于 5%),以便确定悬臂K。在这种情况下,需要在刚性基板上获取第一力曲线,以便测量偏转灵敏度(这与影响曲线形状的所有可能的伪影一起再次出现)。然后,硬基板被参考悬臂(通常为具有校准弹簧常数的无尖端悬臂)所取代,并执行另一条(或很少其他)力曲线,再次记录偏转灵敏度的值。然后,悬臂弹簧常数计算为:
其中Kref是参考悬臂的弹簧常数,S引用在其上测量的偏转灵敏度,L 是其长度,S刚性是测量在刚性上的偏转灵敏度衬 底。*L是参考悬臂尖端和末端之间的偏移,取决于用户所做的对齐,最后 * 是悬臂的倾斜角度,由 AFM 制造商指定。同样的方法可用于专为悬臂或进体校准而设计的弹性结构。这些结构的优点(通常是圆形的)是K在其中心是恒定的,不依赖于任何几何参数或 AFM 尖端在其上的精确定位,因此删除L和+L从前面的公式。
AFM 用户必须记住,所有这些校准方法都受不同误差源的影响(第一和第三个误差灵敏度的确定,在第一和第二个和几何几何时使用硬悬臂时的热调谐第三个参数和对齐,以及Kref的校准精度在参考悬臂的情况下使用),并且接触方法对尖端有潜在的危害(特别是第三个,其中校准强制使用两个不同的样本)。这意味着弹簧常数将始终确定到一定的精度,测量/应用力也始终确定(有关不同校准方法及其精度的全面审查,请参阅 Sikora19)。这意味着,Young 的木量和 turgor 压力也会受到悬臂校准的影响。无论如何,在计算这些数量时涉及其他更重要的错误源(例如使用简化模型确定 Young 的模量),因此从这些类型的测量中获取绝对值始终是一项挑战。重要的是获取大小级正确且彼此相一致的值,这意味着如果同一用户在同一样本上重复实验,则这些值应该是兼容的。为了获得校准,必须仔细进行校准,并且必须尽量减少误差源(例如,尽可能限制声学噪声/振动)。席勒等人最近提出了一种提高重复校准的一致性的可能战略,由于11个欧洲实验室的合作,一种协议(称为SNAP)可以弥补偏转灵敏度测定已经开发。在本文中,作者使用直接校准的吊臂进行测量,无论如何,同样的协议可以应用于非校准的吊臂,只需在第一时间用选择的方法校准它们,然后考虑第一个弹簧常量作为参考值("校准") 值。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢 PLATIM 团队的技术支持,以及 Arezki Boudaoud 和 RDP 实验室的生物物理团队成员,感谢他们的有益讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth medium | |||
| 1,000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
| 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
| Agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
| Agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
| Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2 mM. |
| MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2 g/ L. |
| N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
| Oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
| Plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
| Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
| Sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
| Tools for AFM | |||
| BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
| Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
| Patafix | UHU | D1620 | |
| Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
| Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
| Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |
References
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